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        懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒的DAS-ELISA檢測(cè)與分析

        2017-11-04 06:35:34尹明華郁雪婷李遠(yuǎn)芳范亞紅羅玉婕萬小霞
        關(guān)鍵詞:高山試管熱處理

        尹明華,劉 燕,郁雪婷,李遠(yuǎn)芳,周 榕,范亞紅,羅玉婕,萬小霞

        (上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001)

        浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis, 2017,29(10): 1699-1705

        尹明華,劉燕,郁雪婷,等. 懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒的DAS-ELISA檢測(cè)與分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2017,29(10): 1699-1705.

        10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.15

        2017-04-01

        上饒師范學(xué)院2017年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2017-CX-72)

        尹明華(1973—),女,江西永新人,碩士,副教授,主要從事植物生物技術(shù)方面的研究。E-mail: yinminghua04@163.com

        懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒的DAS-ELISA檢測(cè)與分析

        尹明華,劉 燕,郁雪婷,李遠(yuǎn)芳,周 榕,范亞紅,羅玉婕,萬小霞

        (上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001)

        對(duì)懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗6種病毒(馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯M病毒和馬鈴薯A病毒)進(jìn)行了DAS-ELISA檢測(cè)與分析,并比較不同莖尖脫毒方法的效率,旨在確定懷玉山高山馬鈴薯的病毒種類,并篩選出懷玉山高山馬鈴薯脫毒苗。結(jié)果表明,懷玉山高山馬鈴薯感染的病毒包括馬鈴薯卷葉病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯M病毒和馬鈴薯A病毒6種?!皢渭兊那o尖培養(yǎng)”以及“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”只能脫除部分病毒,而“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”可脫除全部6種病毒。本試驗(yàn)成功獲得了脫毒效果較好的編號(hào)為5-1-2和6-4-1以及脫毒效果最好的編號(hào)為5-3-2和6-2-2的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生脫毒苗。本試驗(yàn)結(jié)果為懷玉山高山馬鈴薯脫毒苗的工業(yè)化生產(chǎn)及其主糧化背景下高山馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

        懷玉山高山馬鈴薯;莖尖再生苗;病毒;雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

        2015年2月1日,“中央一號(hào)”文件明確提出,將馬鈴薯列為水稻、小麥、玉米之外的第四大主糧作物[1]。在主糧化背景下,馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化是必然選擇。懷玉山高山馬鈴薯又叫麻籽洋芋,主要種植區(qū)域?yàn)橛裆娇h懷玉鄉(xiāng)境內(nèi)的玉峰村、洋塘村、金坪村、隴首村、關(guān)口村5個(gè)行政村。懷玉山高山馬鈴薯塊莖含有豐富的蛋白質(zhì)、賴氨酸和色氨酸、鉀、鋅、鐵、VC、VB1、VB2等,且淀粉和脂肪含量低,不含還原糖,適合“三高”人群食用。另外,麻籽洋芋塊莖所含的纖維素細(xì)嫩,對(duì)胃腸黏膜無刺激作用,有解痛或減少胃酸分泌功能。因此,懷玉山高山馬鈴薯具有和中養(yǎng)胃、健脾利濕、降糖降脂、美容養(yǎng)顏、防治胃癌等功效。2013年4月,懷玉山高山馬鈴薯獲準(zhǔn)為國(guó)家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品。懷玉山高山馬鈴薯的繁殖主要通過無性繁殖的方式,長(zhǎng)期的無性繁殖容易造成病毒在植物體內(nèi)逐代積累,從而發(fā)生種性退化,造成大幅減產(chǎn)和品質(zhì)下降,并且感病薯塊在貯運(yùn)期間也易發(fā)生腐爛,對(duì)生產(chǎn)和銷售都造成巨大損失。因此,如何對(duì)懷玉山高山馬鈴薯進(jìn)行脫毒,成為懷玉山高山馬鈴薯實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的重中之重。

        目前已知的馬鈴薯病毒約有40余種,因國(guó)家和地域分布而異,但其中分布廣泛、為害嚴(yán)重的病毒有馬鈴薯卷葉病毒(potato leaf roll virus,PLRV)、馬鈴薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、馬鈴薯X病毒(potato virus X,PVX)、馬鈴薯S病毒(potato virus S,PVS)、馬鈴薯M病毒(potato virus M,PVM)和馬鈴薯A病毒(potato virus A,PVA)[2-3]。利用組織培養(yǎng)莖尖脫毒技術(shù)培育試管苗來繁育馬鈴薯脫毒試管苗,是目前克服因馬鈴薯病毒造成種性退化、提高產(chǎn)量和品質(zhì)的主要途徑[4]。在馬鈴薯脫毒苗培育中,病毒檢測(cè)是保證馬鈴薯莖尖再生苗脫毒效果的關(guān)鍵。一般而言,病毒檢測(cè)不只是針對(duì)馬鈴薯莖尖再生苗某一病毒進(jìn)行檢測(cè),而更多是針對(duì)馬鈴薯莖尖再生苗幾種主要病毒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè),從大量的樣品中選出生產(chǎn)上可利用的馬鈴薯脫毒苗[5]。DAS-ELISA(雙抗體夾心板酶聯(lián)免疫吸附法)是鑒定馬鈴薯莖尖再生苗是否脫除多種病毒的常規(guī)方法[6],具有靈敏、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),適于鑒定大量樣品的常規(guī)病毒鑒定,能快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)出馬鈴薯中含有的病毒類型,早已被列為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法(GB/18133-2012)[3,7]。目前,DAS-ELISA成功應(yīng)用于番茄花葉病毒[8]、葡萄卷葉病毒Ⅲ[9]等園藝植物的病毒檢測(cè)工作。關(guān)于馬鈴薯病毒DAS-ELISA檢測(cè)的研究也有報(bào)道[5-6,10],但有關(guān)懷玉山高山馬鈴薯莖尖脫毒苗的培育及其脫毒效果的DAS-ELISA 檢測(cè)尚未見報(bào)道。本研究以懷玉山高山馬鈴薯塊莖為材料,切取其莖尖獲得再生苗并對(duì)其進(jìn)行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA的檢測(cè),探究懷玉山高山馬鈴薯感染的病毒種類,篩選出不含PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的脫毒苗,旨在為懷玉山高山馬鈴薯脫毒苗的工業(yè)化生產(chǎn)及其主糧化背景下高山馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        懷玉山高山馬鈴薯塊莖(由上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供)。

        1.2 方法

        1.2.1 懷玉山高山馬鈴薯塊莖的催芽

        將懷玉山高山馬鈴薯塊莖置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗催芽,待芽長(zhǎng)至6~8 cm時(shí),選取強(qiáng)壯的芽切下,用于其無菌體系的建立。

        1.2.2 懷玉山高山馬鈴薯無菌體系的建立

        將懷玉山高山馬鈴薯塊莖萌發(fā)的芽摘下,自來水洗凈,用飽和無磷洗衣粉浸泡1 h后,帶進(jìn)超凈工作臺(tái)內(nèi),先用70%乙醇消毒30 s,無菌水洗滌3次,再用0.1%氯化汞消毒8 min,無菌水洗滌3次,接種到MS固體培養(yǎng)基上。待新芽長(zhǎng)出,即表明無菌體系建成。

        1.2.3 懷玉山高山馬鈴薯的快繁

        將無菌體系的芽切成1.5~2.0 cm長(zhǎng),繼續(xù)接種到MS固體培養(yǎng)基上。如此反復(fù),就可獲得較多的試管苗。

        1.2.4 懷玉山高山馬鈴薯試管苗莖尖切取及其再生苗病毒的DAS-ELISA檢測(cè)

        取生長(zhǎng)時(shí)間約為20~30 d的懷玉山高山馬鈴薯試管苗,在40倍的顯微鏡下用解剖刀與解剖針剝?nèi)〈笮〖s為 0.2~0.3 mm(含1~2個(gè)葉原基)的莖尖,接種在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的固體培養(yǎng)基上。莖尖長(zhǎng)出肉眼可見的綠色小點(diǎn)即視為成活,成活的莖尖長(zhǎng)出帶有2個(gè)以上葉片的小植株即視為莖尖已成苗。莖尖成苗后轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)20~30 d,就可對(duì)每個(gè)莖尖的成苗編號(hào),并分別繼代快繁,待苗數(shù)量較多時(shí),則對(duì)編號(hào)的莖尖再生苗進(jìn)行病毒的DAS-ELISA檢測(cè)。DAS-ELISA檢測(cè)方法具體見試劑盒說明書,并參考張志軍等[3]提供的方法。馬鈴薯病毒DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

        1.2.5 懷玉山高山馬鈴薯試管再生苗的病毒DAS-ELISA檢測(cè)

        取第一次莖尖脫毒效果較好的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗,按照馮光惠等[11]和Tomassoli等[12]的方法,在光照培養(yǎng)箱內(nèi)每天升溫1 ℃,持續(xù)15 d,然后每天在溫度(38±1)℃,光照強(qiáng)度 3 000 lx 條件下培養(yǎng)16 h,在溫度18 ℃條件下暗培養(yǎng)8 h,如此變溫?zé)崽幚?周以鈍化病毒。最后在40倍的顯微鏡下繼續(xù)剝?nèi)〈笮〖s為 0.2~0.3 mm(含1~2個(gè)葉原基)的莖尖,接種在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的固體培養(yǎng)基上。莖尖第二次成苗后轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)20~30 d,就可對(duì)每個(gè)莖尖的成苗再次編號(hào),并分別繼代快繁,待苗數(shù)量較多時(shí),則對(duì)第二次莖尖再生苗進(jìn)行病毒的DAS-ELISA檢測(cè),檢測(cè)方法同上。

        取第二次莖尖脫毒效果較好的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生苗,在光照培養(yǎng)箱內(nèi)每天升溫1 ℃,持續(xù)15 d,然后每天在溫度(38±1)℃,光照強(qiáng)度 3 000 lx 條件下培養(yǎng)16 h,在溫度18 ℃條件下暗培養(yǎng)8 h,如此變溫?zé)崽幚?周以鈍化病毒。最后在40倍的顯微鏡下繼續(xù)剝?nèi)〈笮〖s為0.2~0.3 mm(含1~2個(gè)葉原基)的莖尖,接種在MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的固體培養(yǎng)基上。莖尖第三次成苗后轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)20~30 d,而后對(duì)每個(gè)莖尖的成苗再次編號(hào),并分別繼代快繁,待苗數(shù)量較多時(shí),則對(duì)第三次莖尖再生苗進(jìn)行病毒的DAS-ELISA檢測(cè),檢測(cè)方法同上。以上試驗(yàn)重復(fù)3次,所有數(shù)據(jù)表示為平均值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1懷玉山高山馬鈴薯試管苗第一次莖尖再生苗病毒的DAS-ELISA檢測(cè)

        對(duì)懷玉山高山馬鈴薯試管苗第一次莖尖再生苗進(jìn)行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的DAS-ELISA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)樣本1-9均未能脫除PVX病毒;樣本1、2、4未能脫除PVY病毒;樣本1未能脫除PLRV病毒;樣本1、2、3、4、8、9未能脫除PVS病毒;樣本1、2、4、8未能脫除PVA病毒;樣本1未能脫除PVM病毒(表1)。因此,常規(guī)的莖尖培養(yǎng)完全脫除懷玉山高山馬鈴薯的PVX病毒,而PVS的脫除率為44.4%,PVA的脫除率為55.6%,PVY的脫除率為66.6%,PLRV和PVM的脫除率均為88.9%。因此,常規(guī)的0.2~0.3 mm莖尖脫毒并不能完全脫除懷玉山高山馬鈴薯PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒。但樣本5、6、7只帶有PVX一種病毒,其他5種病毒已經(jīng)脫除。

        2.2懷玉山高山馬鈴薯試管苗“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”再生苗的病毒DAS-ELISA檢測(cè)

        在2.1節(jié)中,樣本1未能脫除6種病毒,樣本5、6、7只帶有PVX一種病毒。然后對(duì)樣本1、樣本5和樣本6第一次莖尖再生苗進(jìn)行熱處理后再次切取莖尖培養(yǎng),最后對(duì)其第二次莖尖再生苗進(jìn)行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的DAS-ELISA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)樣本1-1脫除了PVM病毒;樣本1-2、1-3、1-4、1-5和樣本6-4對(duì)6種病毒的脫除還是沒有效果;樣本5-1沒有脫除PVX、PVY和PVA病毒,但脫除了PLRV、PVS和PVM病毒;樣本5-3和樣本6-2沒有脫除PVY病毒,但脫除了PLRV、PVX、PVS、PVM和PVA 5種病毒。這表明,在第1次病毒DAS-ELISA檢測(cè)時(shí),樣本5和樣本6有些病毒未被檢出,但第二次檢測(cè)時(shí)被有效檢出,如樣本5-1仍帶有PVX、PVY和PVA,樣本6-4仍帶有6種病毒。通過“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”和病毒的第二次DAS-ELISA檢測(cè),樣本5-3和樣本6-2仍帶有PVY病毒,原先帶有的PVX病毒被脫除了(表2)。綜上所述,經(jīng)過“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”后,PVX病毒的脫除率為22.2%,PVY的脫除率為0,PLRV、PVS和PVA的脫除率均為33.3%,PVM的脫除率均為44.4%。

        表1懷玉山高山馬鈴薯第一次莖尖再生苗的病毒DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果

        Table1Results of virus DAS-ELISA detection of the first shoot-tip regenerated plantlets of Huaiyushan high mountain potato

        酶聯(lián)板序號(hào)AssayplateNo.樣本編號(hào)SampleNo.馬鈴薯X病毒PVX馬鈴薯Y病毒PVY馬鈴薯卷葉病毒PLRV馬鈴薯S病毒PVS馬鈴薯A病毒PVA馬鈴薯M病毒PVM47116480461087602990559020048217900423010503530287009649310630098012202590171011050417610148013302590311010151506050090016901730096008452618890103010401730157008053714070081010301550117008854813920091011602390178010155913340105009402460105009491陽(yáng)性對(duì)照Positivecontrol06830205010901250310029892陽(yáng)性對(duì)照Positivecontrol04920278010501110281027393陰性對(duì)照Negativecontrol01020070008501040087008094陰性對(duì)照Negativecontrol00900070010201230084009295空白對(duì)照Blankcontrol00890065008001210077008496空白對(duì)照Blankcontrol008800690080011300770076

        在波長(zhǎng)405 nm處讀數(shù),下劃實(shí)線的數(shù)值為病毒值高于陰性對(duì)照2倍,下劃虛線的數(shù)值為病毒值低于陰性對(duì)照2倍但是高于陰性對(duì)照1.8倍,不劃線的數(shù)值為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的脫毒材料,帶方框的數(shù)值為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)且效果最好的脫毒材料。下同。

        Values were read at the wavelength of 405 nm; The value with the lower real line was two times higher than that of the negative control; The value with the lower dashed line was 2 times lower than that of the negative control, but higher than that of the negative control by 1.8 times; Non marking values indicate that they are virus-free materials which meet national standards; The value within the box is in line with national standards, which has the best results. The same as below.

        表2懷玉山高山馬鈴薯第二次莖尖再生苗的病毒DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果

        Table2Results of virus DAS-ELISA detection of the second shoot-tip regenerated plantlets of Huaiyushan high mountain potato

        酶聯(lián)板序號(hào)AssayplateNo.樣本編號(hào)SampleNo.馬鈴薯X病毒PVX馬鈴薯Y病毒PVY馬鈴薯卷葉病毒PLRV馬鈴薯S病毒PVS馬鈴薯A病毒PVA馬鈴薯M病毒PVM351?1126101310721016001560040361?2037801890958039001750089371?3016901421130008900880057381?4028003191534010003790053395?3006301080046002900370033406?2003408930032003500370029885?1082202280024006300550032896?4127901070092010000610076901?511570071070300840223012391陽(yáng)性對(duì)照Positivecontrol11331094316205311263314892陽(yáng)性對(duì)照Positivecontrol11471042316205891082319293陰性對(duì)照Negativecontrol00350039003800330046004194陰性對(duì)照Negativecontrol00300033003300340029002895空白對(duì)照Blankcontrol00320037003300280046003796空白對(duì)照Blankcontrol006900360036003600370048

        2.3懷玉山高山馬鈴薯試管苗“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”再生苗的病毒DAS-ELISA檢測(cè)

        在2.2節(jié)中,樣本5-1仍帶有PVX、PVY和PVA,樣本6-4仍帶有6種病毒,樣本5-3和樣本6-2仍帶有PVY病毒。然后對(duì)樣本5-1、樣本6-4、樣本5-3和樣本6第二次莖尖再生苗進(jìn)行熱處理后再次切取莖尖培養(yǎng),最后對(duì)其第三次莖尖再生苗進(jìn)行PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒的DAS-ELISA檢測(cè),發(fā)現(xiàn)樣本5-1-2、樣本5-3-2、樣本6-2-2和樣本6-4-1均脫除6種病毒,其中樣本5-1-2和樣本6-4-1為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的脫毒材料,樣本5-3-2和樣本6-2-2為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)且效果最好的脫毒材料(表3)。綜上所述,經(jīng)過“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”后,6種病毒的脫除率均為100%。

        表3懷玉山高山馬鈴薯第三次莖尖再生苗的病毒DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果

        Table3Results of virus DAS-ELISA detection of the third shoot-tip regenerated plantlets of Huaiyushan high mountain potato

        酶聯(lián)板序號(hào)AssayplateNo.樣本編號(hào)SampleNo.馬鈴薯X病毒PVX馬鈴薯Y病毒PVY馬鈴薯卷葉病毒PLRV馬鈴薯S病毒PVS馬鈴薯A病毒PVA馬鈴薯M病毒PVM745?1?2011201080124010801090103755?3?2009801000131010501050102766?2?2010401020127011201090109776?4?101050115011101130115010891陽(yáng)性對(duì)照Positivecontrol11140168291401850291190892陽(yáng)性對(duì)照Positivecontrol11400165294201770285197793陰性對(duì)照Negativecontrol01100113011701090112011794陰性對(duì)照Negativecontrol01030109011501070106011095空白對(duì)照Blankcontrol01010103010001040100010296空白對(duì)照Blankcontrol010701100103009101090100

        3 討論

        莖尖培養(yǎng)能夠脫除病毒的原理是病毒在植物體內(nèi)的分布存在不均勻性,而在植物兩個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)即莖尖和根尖含病毒量少或不含病毒,因?yàn)檫@兩個(gè)地方尚未形成維管束,而病毒一般是通過維管束傳播的。由于根尖易形成愈傷組織,而莖尖易形成芽,因此,在脫毒時(shí)一般選取莖尖作為脫毒材料。選取莖尖時(shí),生長(zhǎng)點(diǎn)附近的組織要盡量少,長(zhǎng)度約0.1~0.3 mm,既保證莖尖的成活,也保證脫除大多數(shù)病毒[13]。劉江娜等[14]剝?nèi)●R鈴薯大西洋、中聯(lián)紅、夏波蒂和隴薯三號(hào)4個(gè)品種無菌苗帶有2個(gè)直徑約為0.1~0.2 mm葉原基的莖尖,分別可獲得 28.05%、13.60%、13.65% 和 23.40% 脫毒效果較好的脫毒苗。徐茜等[15]認(rèn)為馬鈴薯新品種渝馬鈴薯3號(hào)莖尖大小為帶1~2個(gè)長(zhǎng)約0.2~0.3 mm葉原基為好。但在本試驗(yàn)中,常規(guī)的0.2~0.3 mm莖尖脫毒并不能完全脫除懷玉山高山馬鈴薯PLRV、PVY、PVX、PVS、PVM和PVA 6種病毒。

        莖尖培養(yǎng)與熱處理方法相結(jié)合脫除病毒已在許多植物上得到應(yīng)用。Robert等[16]利用35~40 ℃熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng),大蒜的洋蔥黃矮病毒脫除率可達(dá)90%以上。Tomassoli等[12]利用(38±1)℃,16 h·d-1熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng),Capparisspinosa的Caper latent virus(CapLV)病毒脫除率為89%~93%。但Tan等[17]發(fā)現(xiàn)白天38 ℃/晚上 32 ℃的熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)無法獲得梨脫毒苗,但利用白天42 ℃/晚上34 ℃的熱處理再結(jié)合莖尖培養(yǎng)能獲得較高的脫毒效果。因此,熱處理可以對(duì)病毒起到鈍化作用,如果先將莖尖再生苗進(jìn)行熱處理后再次進(jìn)行莖尖培養(yǎng),可提高脫毒效果。本試驗(yàn)對(duì)懷玉山高山馬鈴薯試管苗“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”再生苗的病毒DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,通過此方式仍然未能獲得懷玉山高山馬鈴薯試管苗脫除6種病毒的脫毒苗。但通過“莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)→熱處理→莖尖培養(yǎng)”這種方式可獲得懷玉山高山馬鈴薯試管苗脫除6種病毒的脫毒苗。本試驗(yàn)成功獲得了脫毒效果較好的編號(hào)為5-1-2和6-4-1以及脫毒效果最好的編號(hào)為5-3-2和6-2-2的懷玉山高山馬鈴薯莖尖再生脫毒苗。因此,對(duì)于懷玉山高山馬鈴薯帶毒種類較多的試管苗來說,只有通過2~3次重復(fù)切取莖尖結(jié)合1~2次重復(fù)熱處理方可完全清除其攜帶的6種病毒。

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        DAS-ELISAdetectionandanalysisofsixkindsofvirusesinplantletsregeneratedfromHuaiyushanhighmountainpotatoshoot-tips

        YIN Minghua, LIU Yan, YU Xueting, LI Yuanfang, ZHOU Rong, FAN Yahong, LUO Yujie, WAN Xiaoxia

        (CollegeofLifeSciences,ShangraoNormalUniversity,Shangrao334001,China)

        In order to determine the virus species and screen out its virus-free plantlets, 6 viruses (potato leafroll virus, potato virus Y, potato virus X, potato virus S, potato virus M and potato virus A) in plantlets regenerated from shoot-tips of Huaiyushan high mountain potato were detected and analyzed by DAS-ELISA, and the efficiency of different shoot tip detoxification methods were compared. The results showed that there were 6 viruses including potato leafroll virus, potato virus Y, potato virus X, potato virus S, potato virus M and potato virus A in Huaiyushan high mountain potato. Two methods such as “simple shoot tip culture” and “shoot tip culture→thermotherapy→shoot tip culture” can only remove parts of the viruses, while “shoot tip culture→thermotherapy→shoot tip culture→thermotherapy→shoot tip culture” could remove all 6 viruses. In this study, we successfully obtained the virus-free plantlets of Huaiyushan high mountain potato, of which No. 5-1-2 and No. 6-4-1 had better virus-free effect and No. 5-3-2 and No. 6-2-2 had the best virus-free effect. The results will help to provide technical support and theoretical basis for virus-free plantlet industrial production of Huaiyushan high mountain potato and its industrialization development under the background of the fourth major staple food.

        Huaiyushan high mountain potato; plantlets regenerated from shoot-tips; virus; DAS-ELISA

        S532

        A

        1004-1524(2017)10-1699-07

        (責(zé)任編輯張 韻)

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