許黎明，成春燕，韋星明，莫祺暉，盧漢浪，楊祥開

(廣西科學院 生物研究所，廣西 南寧，530007)

大豆β-淀粉酶基因在畢赤酵母中的高密度發(fā)酵表達

許黎明*，成春燕，韋星明，莫祺暉，盧漢浪，楊祥開

(廣西科學院 生物研究所，廣西 南寧，530007)

大豆β-淀粉酶在麥芽糖漿生產(chǎn)上具有應用優(yōu)勢。該研究應用畢赤酵母表達系統(tǒng)異源表達大豆β-淀粉酶，并對重組酶的酶學性質(zhì)進行了分析，結(jié)果顯示，其酶學性質(zhì)沒有改變。為了增強重組β-淀粉酶的表達，采用甲醇/山梨醇混合碳源誘導的畢赤酵母表達策略，10 L發(fā)酵罐發(fā)酵表達的重組β-淀粉酶酶活力為310 U/mL，比單一甲醇誘導提高了36%。研究結(jié)果表明，發(fā)酵條件優(yōu)化對提高異源β-淀粉酶在畢赤酵母中的表達有重要參考價值。

β-淀粉酶；畢赤酵母；異源表達；酶學性質(zhì)；山梨醇

β-淀粉酶(EC3.2.1.2)是外切淀粉酶，其水解直鏈淀粉產(chǎn)物主要是麥芽糖，水解支鏈淀粉產(chǎn)物為麥芽糖和β-極限糊精，在啤酒釀造、糖漿制造、紡織和醫(yī)療中有重要應用[1-6]。淀粉糖工業(yè)中一般將β-淀粉酶或α-淀粉酶與普魯蘭酶聯(lián)用生產(chǎn)麥芽糖漿，糖化過程中糖化液pH值的下降會影響麥芽糖產(chǎn)量，盡管通過提高糖化溫度可以緩解這一問題，但這勢必影響β-淀粉酶的穩(wěn)定性。植物β-淀粉酶在酶活、熱穩(wěn)定性、pH作用范圍等方面比微生物β-淀粉酶更具工業(yè)生產(chǎn)適應性，目前商品化的β-淀粉酶主要來自大豆、大麥和小麥等，其中大豆β-淀粉酶相比大麥β-淀粉酶對低pH值和高溫有更好的耐受性，更適于高麥芽糖的工業(yè)生產(chǎn)[7-9]。大豆β-淀粉酶主要通過提取獲得，制備過程要消耗大量糧食，成本偏高。與之相比，微生物發(fā)酵更有利于酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。大腸桿菌(Escherichiacoli)表達系統(tǒng)和畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)常用于異源蛋白的表達，目前大豆β-淀粉酶在大腸桿菌中已獲得了活性表達，但酶活力低，僅為19.61 U/mL，熱穩(wěn)定性較天然大豆β-淀粉酶有所下降，而大豆β-淀粉酶在酵母菌中的表達鮮見報道[10-13]。畢赤酵母具有生長快，易于高密度發(fā)酵等優(yōu)點，而且作為外源蛋白表達系統(tǒng)，還具有真核細胞的翻譯后修飾加工功能[14-15]，利用其表達的重組大麥β-淀粉酶的酶學性質(zhì)與天然大麥β-淀粉酶一致[12]，表明畢赤酵母特別適用于植物β-淀粉酶基因的表達。畢赤酵母中醇氧化酶1(Alcohol oxidase，AOX1)啟動子是一個強啟動子，已成功應用于數(shù)百種外源蛋白的表達[16-17]。在以甲醇為唯一碳源的誘導表達階段，畢赤酵母菌體生長與外源基因表達共同競爭碳源，增加了代謝負擔，而且高濃度的甲醇會毒害菌體細胞，導致表達效率降低[18-19]。因此，畢赤酵母的高密度發(fā)酵可考慮采用混合碳源補料策略，一是補充碳源不足，二是避免甲醇毒害，以提高表達效率。在混合碳源補料策略中，山梨醇是高密度發(fā)酵常用輔助碳源，對AOX1的轉(zhuǎn)錄抑制較弱，另外還可降低發(fā)酵過程中毒性產(chǎn)物的積累，減緩分泌蛋白的胞外降解[20-21]。

基于以上分析，本研究利用畢赤酵母表達系統(tǒng)異源表達大豆β-淀粉酶，構建大豆β-淀粉酶重組菌，分析重組菌的表達特性和重組酶的酶學性質(zhì)，在此基礎上，結(jié)合過程工藝的優(yōu)化，采用甲醇/山梨醇混合碳源補料誘導方式進行高密度發(fā)酵表達，提高大豆β-淀粉酶基因在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達效率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

P.pastorisGS115和E.coliDH5α菌株為本實驗室保存。質(zhì)粒pPIC9K購自Invitrogen公司，質(zhì)粒pGEM-SBA為本實驗室前期構建保存，含大豆β-淀粉酶(Soybean β-Amylase,SBA)編碼基因。

1.1.2 引物

實驗所用的引物見表1，由深圳華大基因科技服務有限公司合成。

表1 引物

注：下劃線標記的是克隆位點。

1.1.3 主要試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶和DNA分子參照為Thermo Scientific Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒為OMEGA Bio-Tek公司產(chǎn)品。

1.1.4 培養(yǎng)基

實驗所需培養(yǎng)基及其配制方法參考Invitrogen公司的《畢赤酵母表達操作手冊》。高密度發(fā)酵基礎培養(yǎng)基BSM和微量元素溶液PTM1配制方法參見文獻[22]。

1.2方法

實驗的常規(guī)分子生物學操作參照《分子克隆實驗指南》(第三版)進行。

1.2.1 β-淀粉酶的提取和純化

采用酸性水提法[13]提取大豆β-淀粉酶。提取的粗酶液經(jīng)pH6.0磷酸緩沖液稀釋后，用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行分離純化，凝膠色譜柱為Superdex G75。

1.2.2 β-淀粉酶重組質(zhì)粒的構建

以pGEM-SBA質(zhì)粒DNA為模板，SBA-F1/SBA-R1為引物，PCR擴增β-淀粉酶基因。將擴增基因與pPIC9K進行酶切，連接，構建β-淀粉酶重組質(zhì)粒。酶切位點為EcoR I和NotI。

1.2.3 高拷貝重組畢赤酵母的構建

提取β-淀粉酶重組質(zhì)粒DNA，用SalI酶進行酶切線性化處理，電轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115感受態(tài)細胞。取轉(zhuǎn)化液涂布MD平板，30 ℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子長出后篩選His+表型和篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選的遺傳霉素(G418)質(zhì)量濃度梯度為0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mg/mL。

1.2.4 重組畢赤酵母的誘導表達

淀粉酶酶活力定性檢測：將待測重組酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至同一生長周期，取2 μL菌液接種至含適量濃度淀粉的YPD平板，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，用I2-IK染色觀察淀粉水解圈，以菌株生長狀態(tài)的優(yōu)劣和淀粉水解圈的大小為評判，篩選酶活力高的重組菌進行后續(xù)誘導表達實驗。

將重組酵母接種于BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min下培養(yǎng)24 h(OD600≈6.0)，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中誘導表達。甲醇誘導濃度為0.5%，每24 h補加1次甲醇。誘導發(fā)酵6 d后離心收集上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗設P.pastorisGS115/pPIC9K為對照。

1.2.5 重組β-淀粉酶的純化

重組β-淀粉酶設計有組氨酸標簽(His-tag)，可用鎳柱親和層析純化。

1.2.6 重組β-淀粉酶酶學性質(zhì)的測定

實驗采用純化的重組β-淀粉酶和天然β-淀粉酶進行酶學性質(zhì)分析。天然β-淀粉酶從相同來源大豆品種中分離提純，該酶定義為原始β-淀粉酶。

(1)β-淀粉酶酶活力的測定。采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法測定β-淀粉酶酶活力。酶活力單位(U/mL)定義為：1 mL酶液在pH 6.5、60 ℃的條件下，1 h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖即為1個酶活力單位。

(2)最適反應溫度測定。分別測定50、55、60、65、70 ℃溫度條件下的β-淀粉酶酶活力，設酶活力最高者為100%，以此計算其他溫度條件下的相對酶活力。實驗以原始β-淀粉酶為對照。

(3)最適作用pH值的測定。采用20 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，分別測定pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0條件下的β-淀粉酶酶活力，設酶活力最高者為100%，以此計算其他pH值條件下的相對酶活力。實驗以原始β-淀粉酶為對照。

(4)酶反應穩(wěn)定性的測定。將β-淀粉酶置于最適反應溫度和最適反應pH條件下保溫8 h，每隔1 h取樣，冰上靜置10 min后測定酶活力，設初始反應酶活力為100%，以此計算剩余酶活力。實驗以原始β-淀粉酶為對照。

1.2.7 補料高密度發(fā)酵表達

種子液按10%接種量接入10 L全自動發(fā)酵罐中。以氨水和磷酸溶液控制pH值為6.0，控制溫度30 ℃，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量維持DO在30%以上。當甘油耗盡，DO上升后(DO>60%)，開始流加含有1.2% PTM1的50%甘油。當菌體達到一定濃度后(OD600≈200)，停止補料。待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持基質(zhì)匱乏狀態(tài)1 h(DO>60%)后，開始流加含1.2% PTM1的甲醇或者甲醇與山梨醇按20∶1質(zhì)量比混合的誘導培養(yǎng)基，并且把溫度降低至22 ℃誘導表達，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，維持DO在10%以上。從發(fā)酵開始每隔12 h取樣，測定上清液酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1大豆β-淀粉酶基因的克隆與表達

將PCR擴增的大豆β-淀粉酶基因克隆至pPIC9K，構建得到重組質(zhì)粒pPIC9K-SBA，電轉(zhuǎn)化P.pastorisGS115，經(jīng)營養(yǎng)互補篩選，得到重組酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA。pPIC9K-SBA的EcoR I和NotI雙酶切驗證電泳結(jié)果見圖1A，pPIC9K-SBA有9.3 kb的載體條帶和1.5 kb的目的基因條帶，對照pPIC9K僅有9.3 kb的載體條帶。P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA的PCR驗證電泳結(jié)果見圖1B，P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA有1.5 kb的目的基因擴增條帶，對照P.pastorisGS115/pPIC9K沒有擴增條帶。結(jié)果說明大豆β-淀粉酶重組畢赤酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA構建成功。

A：M1-Lambda DNA EcoR I+Hind Ⅲ Marker 3 DNA 分子量標準；1-質(zhì)粒pPIC9K-SBA；2-質(zhì)粒pPIC9K；M2-DL2000 DNA 分子量標準；B：M1-Lambda DNA EcoR I +Hind Ⅲ Marker 3 DNA 分子量標準；1-菌株P. Pastoris GS115/pPIC9K-SBA；2-菌株P. Pastoris GS115/pPIC9K；M2-DL2000 DNA 分子量標準圖1 質(zhì)粒pPIC9K-SBA和菌株P. pastoris GS115/pPIC9K-SBA 的構建和驗證Fig.1 Construction and verification of the plasmid pPIC9K-SBA and strain P. pastoris GS115/pPIC9K-SBA

G418平板抗性篩選高拷貝重組酵母P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA轉(zhuǎn)化子的結(jié)果如圖2所示。當G418質(zhì)量濃度為0 mg/mL時，所有轉(zhuǎn)化子生長正常，G418質(zhì)量濃度升至2 mg/mL以上時，部分轉(zhuǎn)化子能夠生長，當G418質(zhì)量濃度升至4 mg/mL時，僅有2個轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出生長優(yōu)勢，分別標記為P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA-1(簡稱1#)和P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA-2(簡稱2#)。后續(xù)將這2株菌用于搖瓶發(fā)酵表達。

圖2 高產(chǎn)β-淀粉酶轉(zhuǎn)化子的G418質(zhì)量濃度梯度篩選Fig.2 Selection of high β-amylase activity producing transformants on G418 concentration gradient plate

P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA淀粉酶酶活力定性檢測結(jié)果如圖3A所示。1#和2#的菌落大小相近，但1#的淀粉水解圈明顯比2#大，淀粉水解圈的大小，在一定程度上反映了菌株淀粉酶酶活力的大小。P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA搖瓶發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵上清液經(jīng)等體積超濾純化處理后作SDS-PAGE電泳分析，電泳結(jié)果如圖3B所示，1#和2#表達的重組β-淀粉酶分子量大小約為56 kDa， 1#的目的條帶濃度比2#高。發(fā)酵上清液經(jīng)酶活力檢測，1#菌株重組β-淀粉酶酶活力為53 U/mL，2#菌株為19 U/mL。

A：1-菌株P. Pastoris GS115/pPIC9K-SBA-1；2-菌株P. Pastoris GS115/pPIC9K-SBA-2；CK-菌株P. Pastoris GS115/pPIC9K； B：M-蛋白質(zhì)分子量標準；1-菌株P. Pastoris GS115/pPIC9K；2-菌株P. Pastoris GS115/pPIC9K-SBA-1；3-菌株GS115/pPIC9K-SBA-2圖3 重組β-淀粉酶的驗證Fig.3 Verification of the recombinant β-amylase

結(jié)果表明，構建的P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA成功分泌表達活性β-淀粉酶蛋白，并且1#菌株的酶表達能力強于2#菌株，適用于下一步發(fā)酵實驗。

2.2重組酶的酶學性質(zhì)

2.2.1 最適反應溫度

重組β-淀粉酶的最適反應溫度測定結(jié)果見圖4A。在pH 6.5條件下，重組酶酶活力在50～60 ℃時較高，而且隨溫度升高而升高，60 ℃時達到最高，高于60 ℃酶活力下降，在70 ℃時相對酶活力為(25.67±0.04)%；原始酶的溫度反應變化趨勢與重組酶相似，60 ℃時酶活力最高，低于60 ℃時酶活力隨溫度升高而升高，高于60 ℃時酶活力下降，70 ℃時相對酶活力降至(30.33±0.02)%。實驗結(jié)果表明，重組酶和原始酶的最適反應溫度是60 ℃。

2.2.2 最適作用pH值

重組β-淀粉酶的最適作用pH值測定結(jié)果見圖4B。在60 ℃反應條件下，重組酶酶活力在pH 3.0～6.0之間呈上升趨勢，pH 6.0時為最高酶活力，pH值大于6.0后酶活力明顯下降；原始酶的pH反應變化趨勢與重組酶相似，pH 6.0時達到最高酶活力，pH 3.0～6.0時酶活力逐漸升高，pH值高于6.0時酶活力下降。實驗結(jié)果表明，重組酶和原始酶的最適作用pH值為6.0。

圖4 重組酶與原始酶的酶學性質(zhì)比較分析Fig.4 Comparative analysis of enzymatic properties between recombinant β-amylase and purified β-amylase

2.2.3 酶反應穩(wěn)定性

重組β-淀粉酶的反應穩(wěn)定性見圖4C。在最適反應溫度和最適作用pH條件下溫育反應6 h后，重組酶剩余酶活力為(48.33±0.03)%，原始酶剩余酶活力為(51.67±0.03)%。重組酶和原始酶的剩余酶活力無顯著差異(p>0.05)，二者的酶活半衰期約為6 h。

2.3補料高密度發(fā)酵表達β-淀粉酶

取P.pastorisGS115/pPIC9K-SBA-1菌株進行高密度發(fā)酵，以單一甲醇碳源流加方式為實驗對照，采用甲醇/山梨醇混合碳源流加方式進行10 L發(fā)酵罐補料高密度發(fā)酵。發(fā)酵過程的SDS-PAGE電泳分析如圖5所示，酶活力變化如圖6所示。發(fā)酵過程酶活力呈上升趨勢，132 h時，對照組β-淀粉酶酶活力達到228 U/mL，甲醇/山梨醇混合流加方式下β-淀粉酶酶活力達到310 U/mL，與對照組相比，甲醇/山梨醇混合流加提高了β-淀粉酶的表達量，酶活力相應提高了36%，但是其雜蛋白含量也相應增加。

圖5 重組β-淀粉酶的表達分析Fig.5 Analysis of the recombinant β-amylase expression

圖6 重組β-淀粉酶的酶活力分析Fig.6 Analysis of the recombinant β-amylase enzyme activity

實驗結(jié)果表明，甲醇/山梨醇混合流加方式比單一甲醇流加方式更能提高β-淀粉酶的發(fā)酵表達。

3 討論

在高麥芽糖生產(chǎn)中，大豆β-淀粉酶對低pH值和高溫等工業(yè)適應性上表現(xiàn)出良好的耐受性[7-8]，目前僅在大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)活性表達，表達的重組β-淀粉酶熱穩(wěn)定性較原始β-淀粉酶有所降低。本研究實現(xiàn)了大豆β-淀粉酶在畢赤酵母中的活性表達，重組β-淀粉酶的酶學性質(zhì)與原始β-淀粉酶一致，表明畢赤酵母較大腸桿菌更適合用于植物來源的β-淀粉酶基因的表達[10-13,23]。

畢赤酵母表達系統(tǒng)是成熟的外源蛋白表達系統(tǒng)[17,24]，但與其他酵母表達系統(tǒng)一樣，難以實現(xiàn)淀粉水解酶系的異源高表達[12,25]。本研究構建了大豆β-淀粉酶重組畢赤酵母，搖瓶發(fā)酵重組酶酶活力為53 U/mL，比報道的大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的酶活力高[13]。在此基礎上結(jié)合過程工藝的優(yōu)化進行高密度發(fā)酵，甲醇單一碳源流加方式下重組酶酶活力為228 U/mL，甲醇/山梨醇混合碳源流加方式下重組酶酶活力為310 U/mL。比較不同發(fā)酵方式的重組酶的表達水平，高密度發(fā)酵比搖瓶發(fā)酵分別提高了330%和485%，甲醇/山梨醇混合碳源流加比甲醇單一碳源流加提高了36%，表明經(jīng)條件優(yōu)化的甲醇/山梨醇混合碳源誘導補料流加高密度發(fā)酵可以最大提高重組酵母β-淀粉酶的表達量。在畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中，山梨醇是常用的非抑制性輔助碳源，在外源蛋白誘導表達階段，山梨醇與甲醇具有不同的代謝途徑，山梨醇的加入既緩解了甲醇單獨誘導表達能量不足的壓力，又改善了甲醇代謝及降解中間毒副產(chǎn)物的能力，因而提高了畢赤酵母的代謝活性和蛋白質(zhì)合成速率[20-21,26-27]。

目前植物源β-淀粉酶的發(fā)酵表達水平偏低[10-12,25]，還需要通過進一步的菌株改造，提高β-淀粉酶表達水平。本研究構建的大豆β-淀粉酶重組畢赤酵母，其酶產(chǎn)量雖然與利用畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶等相比還相去甚遠[28]，但通過甲醇/山梨醇誘導共混補料流加方式提高了大豆β-淀粉酶在畢赤酵母中的異源表達水平，進一步證實了畢赤酵母表達系統(tǒng)以山梨醇為輔助碳源有益于外源蛋白的表達，也說明了在菌株發(fā)酵水平一定的前提下，結(jié)合過程工藝的優(yōu)化能夠提高菌株的發(fā)酵效率，這對于植物源β-淀粉酶的發(fā)酵表達具有實際指導意義。

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Expressionofβ-amylasegenefromsoybeaninPichiapastorisbyhighcelldensityfermentation

XU Li-ming*,CHENG Chun-yan,WEI Xing-ming, MO Qi-hui,LU Han-lang,YANG Xiang-kai

(Biology Institute,Guangxi Academy of Sciences,Nanning 530007,China)

Soybean β-amylase has significant performance advantages in maltose production. Therefore, in this study, the soybean β-amylase was heterologously expressed inPichiapastoris. The enzymatic properties of the recombinant β-amylase were examined and found to have no change. To enhance the production of recombinant β-amylase, the methanol/sorbitol co-feeding induction strategy inPichiapastoriswas carried out and the recombinant β-amylase activity reached 310 U/mL in 10 L fermentator, which was 0.36 fold higher than that of strain feeding with methanol alone. These results indicated that heterologous β-amylase expression level could be enhanced by optimizing fermentation condition inPichiapastoris.

β-amylase;Pichiapastoris; heterologous expression; enzymatic properties; sorbitol

碩士研究生(本文通訊作者，E-mail：dawn111305@163.com)。

廣西自然科學基金面上項目(2015GXNSFAA139087)；廣西自然科學基金青年基金項目(2013GXNSFBA019113)；廣西科學院基本科研業(yè)務費資助項目(12YJ25SWS23)

2017-05-04，改回日期：2017-05-18

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014688