楊滴，劉彥泓，劉岑杰，夏元鳳

（大連市食品檢驗(yàn)所，遼寧大連116600）

食品中銅綠假單胞菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的研究

楊滴，劉彥泓，劉岑杰，夏元鳳

（大連市食品檢驗(yàn)所，遼寧大連116600）

根據(jù)銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，用Primer express 3.0設(shè)計(jì)一對特異性引物和一個(gè)TaqMan探針，建立銅綠假單胞菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。通過對梯度含量的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌液樣品DNA和多種細(xì)菌的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，來檢測其靈敏度和驗(yàn)證引物和探針的特異性。試驗(yàn)結(jié)果表明，只有銅綠假單胞菌產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，其他細(xì)菌無擴(kuò)增，說明引物及TaqMan探針特異性較好，檢測靈敏度為1×103CFU/mL。該方法具有很好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

銅綠假單胞菌；實(shí)時(shí)PCR；檢測

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aernginosa）又稱綠膿桿菌，屬假單胞菌屬，在自然界分布廣泛，是條件致病菌，在機(jī)體免疫力低下時(shí)可引起敗血癥，具有較高的死亡率[1-2]。在日常食品檢測過程中，銅綠假單胞菌未列為常規(guī)項(xiàng)目，但銅綠假單胞菌已被確認(rèn)為食源性和水源性致病菌[3]。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的外毒素、腸毒素、致死毒素能夠嚴(yán)重污染食品[4]，在GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》中將銅綠假單胞菌列為致病菌，GB 19298-2014《包裝飲用水》明確規(guī)定每250 mL水樣中銅綠假單胞菌不得檢出。傳統(tǒng)的檢測方法為細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定，該過程時(shí)間長同時(shí)易受環(huán)境及抗生素的影響。目前，PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌和病毒的快速篩查檢測。但是PCR法需要電泳后處理，基于SYBR Green I染料的實(shí)時(shí)熒光PCR法特異性不強(qiáng)[5]?；赥aqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測具有、快速、簡便、定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢，在病原菌檢測中得到廣泛的應(yīng)用[6-7]。因此本研究旨在采用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立食品中銅綠假單胞菌檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等21株標(biāo)準(zhǔn)菌株購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。試驗(yàn)用菌株見表1。

1.1.2 試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋公司；DNA提取試劑盒：廣州迪奧公司；實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑、Taq酶：寶生物工程（大連）有限公司。

表1 試驗(yàn)用菌株Table 1 Test strains

1.1.3 主要儀器

QS7 Flex熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystems公司；5427R超低溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司；BWS-12恒溫水?。荷虾Ｒ缓憧茖W(xué)儀器有限公司；UV2550分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，用Primer express 3.0設(shè)計(jì)一對特異性引物和一個(gè)TaqMan探針，探針的熒光標(biāo)記選擇FAM作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán)，TAMRA為淬滅基團(tuán)。引物探針由大連寶生物公司合成。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR引物及探針序列Table 2 Nucleotide sequences of primers and probes for fluorescence real-time PCR

1.2.2 模板DNA的提取

將銅綠假單胞菌和其它菌株接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h。細(xì)菌增菌后，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA作為實(shí)時(shí)PCR的模板，-20℃保存。

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)用各種試劑采用寶生物工程（大連）有限公司的Premix Ex TaqTM（RR390Q）試劑盒，具體各種試劑濃度、體積見表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 3 Amplification reaction system of fluorescence real-time PCR

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)：95℃變性5 s、60℃退火和延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR特異性檢測

以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等20株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對照，以ddH2O為無模板對照驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測銅綠假單胞菌的特異性。

1.2.5 實(shí)時(shí)PCR靈敏度檢測

采用0.85%生理鹽水將銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株做成菌懸液，對菌懸液進(jìn)行10倍比梯度稀釋，形成梯度含菌量為 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL的菌懸液。對每個(gè)稀釋度取1 mL菌懸液進(jìn)行DNA提取，并進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.6 實(shí)際樣品應(yīng)用

選取市售涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、涼拌蔬菜、醬牛肉、6種礦泉水共10個(gè)樣品。拌豬耳朵、涼拌豬肚、涼拌蔬菜、醬牛肉無菌取樣25 g；礦泉水無菌取樣25 mL分別加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)24 h。取增菌液1 mL提取DNA，利用本研究的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測結(jié)果

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測銅綠假單胞菌特異性試驗(yàn)Fig.1 Specificity detection of fluorescence real-time PCR assay for Pseudomonas aeruginos

以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等20株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對照，并用ddH2O為無模板對照證實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測銅綠假單胞菌的特異性。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測銅綠假單胞菌特異性試驗(yàn)見圖1。

結(jié)果表明，只有銅綠假單胞菌具有擴(kuò)增曲線，其他20株標(biāo)準(zhǔn)菌株無擴(kuò)增曲線。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性檢測結(jié)果

分別取 1 mL 銅綠假單胞菌 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL 的菌懸液進(jìn)行 DNA 提取，提取的DNA進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。銅綠假單胞菌靈敏性試驗(yàn)見圖2。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測銅綠假單胞菌靈敏性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity detection of qRT-PCR assay for Pseudomonas aeruginos

結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌濃度為1×106、1×105、1×104、1×103CFU/mL 時(shí)均有擴(kuò)增曲線，濃度低于 1×103CFU/mL時(shí)無擴(kuò)增曲線，該方法檢測的低限為1×103CFU/mL。

2.3 實(shí)時(shí)PCR實(shí)際樣品檢測結(jié)果

對涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、涼拌蔬菜、醬牛肉、6種礦泉水共10個(gè)樣品的營養(yǎng)肉湯增菌液進(jìn)行DNA提取，以銅綠假單胞菌為陽性對照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

結(jié)果顯示，涼拌豬肚和一種礦泉水中檢測出含有銅綠假單胞菌。

3 結(jié)論與討論

日常食品檢測過程中，銅綠假單胞菌未被列為微生物的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。銅綠假單胞菌是一種常見的革蘭氏陰性桿菌，該菌為專性需氧菌，生長溫度范圍25℃～42℃，最適生長溫度為25℃～30℃，極易在水中及含水量較高的食品中存活并繁殖，存活時(shí)間長。蔡雙福等[8]對食品中銅綠假單胞菌進(jìn)行監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)熟肉制品、涼拌即食食品、飲用水具有較高的檢出率。食品感染銅綠假單胞菌后，對免疫系統(tǒng)并不健全或是出現(xiàn)免疫缺陷、抵抗力較弱的人群容易引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。因此，非常有必要對食品中銅綠假單胞菌進(jìn)行監(jiān)測及風(fēng)險(xiǎn)評估，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低該菌引起食品污染的風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測樣品中銅綠假單胞菌試驗(yàn)Fig.3 Detection of Pseudomonas aeruginosa in samples by qRT-PCR

薛利軍等[9]曾利用SYBR Green I染料以16S rDNA為目標(biāo)基因構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光PCR檢測銅綠假單胞菌的方法。外毒素A基因在銅綠假單胞菌中高度保守[10]，本研究根據(jù)GenBank中銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan探針，并利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，對目標(biāo)靶序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增。試驗(yàn)選取銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其它20種標(biāo)準(zhǔn)菌株，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證了銅綠假單胞菌引物及探針的特異性。本研究設(shè)計(jì)含有不同濃度的銅綠假單胞菌（1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL） 菌液樣品，試驗(yàn)得到該檢測方法的低限為1×103CFU/ml。本研究通過反復(fù)摸索，建立了一套檢測食品中銅綠假單胞菌的方法，特異性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)良好，該檢測方法具有特異、快速的特點(diǎn)，能夠滿足檢測要求，為食品中銅綠假單胞菌的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。

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Detection of Pseudomonas aernginosa by Fluorescence Real-time PCR Method

YANG Di，LIU Yan-hong，LIU Cen-jie，XIA Yuan-feng
（DaLian Institute of Food Decetion，Dalian 116600，Liaoning，China）

A fluorescence real-time PCR method was developed to detect the Pseudomonas aernginosa，Species-specific primers and TaqManfluorescent probe were designed by Primer express 3.0 software according to the conserved sequence of Exotoxin Agene of Pseudomonas aernginosa.Different gradient concentrations of Pseudomonas aernginosa DNA and various pathogen DNA were amplified by fluorescent real-time PCR to confirm the specificity and sensitivity of the developed method.Results showed that the amplification curves were expressed from Pseudomonas aernginosa by fluorescence real-time PCR.The sensitivity of fluorescence realtime PCR for Pseudomonas aernginosa was 1×103CFU/mL.This method is valuable for research and application prospects.

Pseudomonas aernginosa；fluorescence real-time PCR；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.030

楊滴（1983—），男（漢），高級工程師，碩士，主要從事食品安全檢測工作。

2017-02-23