孟繁磊，宋志峰，劉笑笑，牛紅紅，蔡紅梅，魏春雁

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，吉林長(zhǎng)春130033）

冬蟲夏草與蛹蟲草中蟲草素和總糖含量測(cè)定

孟繁磊，宋志峰，劉笑笑，牛紅紅，蔡紅梅，魏春雁*

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，吉林長(zhǎng)春130033）

建立高效液相色譜法測(cè)定冬蟲夏草與蛹蟲草中蟲草素含量的方法，比較不同產(chǎn)地冬蟲夏草和蛹蟲草中蟲草素和總糖的含量。以水為溶劑超聲波提取、高效液相色譜法測(cè)定蟲草素含量；苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量。結(jié)果顯示冬蟲夏草中沒(méi)有檢出蟲草素，而不同產(chǎn)地的蛹蟲草中蟲草素含量有一定區(qū)別，含量分別為1.39%、0.48%、0.11%；總糖含量是蛹蟲草高于冬蟲夏草，其中不同產(chǎn)地的冬草夏草總糖含量沒(méi)有差別，而不同產(chǎn)地的蛹蟲草總糖含量相差較大，分別為14.69%、20.61%、34.33%。

冬蟲夏草；蛹蟲草；蟲草素；總糖；高效液相色譜法

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc），是寄生于昆蟲、少數(shù)真菌和植物體上的一類藥食兩用真菌，與人參、鹿茸并稱為三大滋補(bǔ)品，有營(yíng)養(yǎng)、保健和醫(yī)療三重功效，在醫(yī)療方面具有免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、抗癌、抗菌、抗病毒、抗輻射、促造血、護(hù)肝、鎮(zhèn)靜等作用[1]。冬蟲夏草資源匱乏、價(jià)格高昂，皆因目前尚未實(shí)現(xiàn)人工栽培，而其自然環(huán)境惡劣，僅分布在青藏高原上的草原和山區(qū)，數(shù)量十分有限，全靠人力采收，而隨著人們經(jīng)濟(jì)收入的提高和對(duì)養(yǎng)生保健的重視，對(duì)其需求量不斷增大，價(jià)格畸形高漲。蛹蟲草（Cordyceps smilitaris（L.ex Fr.）Link），又稱北冬蟲夏草、北蟲草、東北蟲草、蛹草等，作為冬蟲夏草的同屬真菌，具有與冬蟲夏草相近甚至相同的化學(xué)成分，因此也應(yīng)具有類似于冬蟲夏草的生物功能，人們希望蛹蟲草可以作為冬蟲夏草的替代品[2]。

由于近年來(lái)我國(guó)在食品的質(zhì)量及安全等方面所反映出的問(wèn)題越來(lái)越多，我國(guó)對(duì)這些方面也給予越來(lái)越多的重視，但在《中國(guó)藥典》[3]一部里也僅以腺苷的含量為指標(biāo)規(guī)定了冬蟲夏草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但是核苷類的含量受樣品采集時(shí)間的影響[4]，而且腺苷在其他真菌中也普遍存在，如靈芝[5]，缺乏唯一性和專一性。因此，對(duì)蟲草中其他較為主要的物質(zhì)成分蟲草素、總糖進(jìn)行深入研究，并結(jié)合產(chǎn)地和外觀形狀，建立科學(xué)的、合理的蟲草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。

目前，蟲草素定量測(cè)定方法主要有紫外分光光度法[6]、高效液相色譜法[7-10]、毛細(xì)管電泳法[11]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]及薄層色譜掃描法[13]等。本文采用高效液相色譜法測(cè)定冬蟲夏草與蛹蟲草中蟲草素含量，建立了準(zhǔn)確定量的方法，進(jìn)行了方法學(xué)的驗(yàn)證，并測(cè)定了不同產(chǎn)地的冬蟲夏草和蛹蟲草蟲草素和總糖含量，旨在為冬蟲夏草及其替代品的質(zhì)量控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料

干燥的蛹蟲草子實(shí)體樣品：A（產(chǎn)自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）、B（產(chǎn)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌基地）、C（產(chǎn)自上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所）；干燥的冬蟲夏草子實(shí)體樣品：D（產(chǎn)自西藏那曲）、E（產(chǎn)自青海玉樹）。上述樣品50℃烘干粉碎，全部過(guò)60目篩。

1.2 試劑

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司，純度≥98%；葡萄糖：德國(guó)MERCK，純度≥98%；甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技公司；濃硫酸（分析純）、苯酚（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

ACQUITY UPLC H-Class超高液相色譜儀：Waters公司，包括四元溶劑管理器（QSM）、樣品管理器（SMFNT）、UV 檢測(cè)器、EmpowerⅢ色譜管理軟件；T6新悅分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-250DB數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；EBA21高速臺(tái)式離心機(jī)：西班牙SELECTA公司。

2 方法

2.1 蟲草素檢測(cè)

2.1.1 色譜條件

色譜柱：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（體積比為 15∶85）；流速 0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 蟲草素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蟲草素標(biāo)樣0.100 0 g，超純水、超聲波震蕩溶解，定容成1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液 10、50、100、200、500、1 000 μL，置于 10 mL 容量瓶，加超純水定容至10 mL得到質(zhì)量濃度為1、5、10、50、100 μg/mL的蟲草素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蟲草素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.1.1的色譜條件下，依次進(jìn)樣，以蟲草素質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。

2.1.3 待測(cè)液制備

回流法：參考中國(guó)藥典中關(guān)于冬蟲夏草測(cè)試的樣品處理方法，取樣品粉末1.00 g，于具塞錐形瓶中，加超純水100 mL，搖勻，稱重，加熱回流1 h，放冷，再稱重，超純水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得待測(cè)液。

震蕩法：稱取樣品粉末1.00 g置于具塞的錐形瓶中，準(zhǔn)確加超純水100 mL，蓋上塞蓋后搖勻，振蕩提取1 h，提取完后取1 mL樣液離心，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，即得待測(cè)液。

超聲法：精密稱取樣品粉末1.00 g于具塞試管中，加入超純水100 mL，搖勻，超聲提取1 h，每20 min搖勻一次，14 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，即得待測(cè)液。

2.2 可溶性總糖含量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取適量葡萄糖于105℃烘箱內(nèi)烘干至質(zhì)量恒重，稱取0.100 4 g加蒸餾水溶解定容至100 mL，即得濃度為1.004 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精確量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加水定容至10 mL，搖勻。分別量取上述各溶液2 mL，加入1 mL 5%苯酚試液，再快速加入5 mL濃H2SO4，室溫靜置5 min，于40℃水浴上加熱30 min，取出冷卻至室溫，于波長(zhǎng)490 nm測(cè)吸光度值。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.009 8×C+0.016 ，r=0.998 9，線性范圍 0～100 μg/mL。

2.2.2 樣品中總糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品0.050 g，放入10 mL刻度離心管中，加4 mL 80%乙醇，超聲提取30 min，離心，收集上清液，其殘?jiān)? mL 80%乙醇重復(fù)提取1次，合并上清液。上清液中加入0.010 g活性炭，80℃水浴中脫色30 min，定容至50 mL過(guò)濾后取濾液1 mL稀釋到10 mL，取2 mL于具塞試管，加入1 mL 5%苯酚試液，再快速加入5 mL濃H2SO4，室溫靜置5 min，于40℃水浴上加熱30 min，取出，冷卻至室溫。于波長(zhǎng)490 nm測(cè)吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 蟲草素測(cè)定樣品前處理?xiàng)l件的確定

3.1.1 提取方法

以蛹蟲草A為原料，比較了回流法、振蕩法和超聲法的提取效率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同提取方法對(duì)提取效果的影響（n=5）Table 1 Different efficiency of different extraction（n=5）

由表1可以看出，在樣品用量、提取時(shí)間、提取溶劑使用量都一致的情況下，超聲法提取的結(jié)果高于回流法和震蕩法，確定超聲提取法來(lái)提取蟲草中的蟲草素。

3.1.2 超聲時(shí)間的確定

本試驗(yàn)設(shè)定了 30、60、90、120、150 min 5 個(gè)不同的超聲時(shí)間處理，每個(gè)重復(fù)3次，以蛹蟲草A為原料，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)蟲草素的率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield cordycepin

在0～60 min，蟲草素的提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加，90、120、150 min的提取率僅分別比60 min的提取率提高了0.28%、0.5%、0.7%，考慮時(shí)間成本和耗電成本，確定60 min為蟲草素最佳超聲提取時(shí)間。

3.2 蟲草素方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢出限

分別取蟲草素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.1.1的色譜條件下，依次進(jìn)樣，以蟲草素質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，蟲草素在1 μg/mL～100 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=64.424X+37.293（r=0.999 7）。以3倍信噪比為最低檢出限，蟲草素的檢測(cè)線為5 mg/kg。圖2為蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品和蛹蟲草樣品A的色譜圖。

3.2.2 精密度試驗(yàn)

把質(zhì)量濃度為20 μg/mL的蟲草素對(duì)照品在2.1.1的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定其峰面積，計(jì)算蟲草素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果為3.03%，表明該色譜儀和檢測(cè)器精密度良好，符合試驗(yàn)的要求。

圖2 A蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL），B蛹蟲草A樣品的色譜圖Fig.2 A cordycepin standard solution（50 μg/mL），B chromatogram of Cordyceps militaris A sample

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取蛹蟲草 A 的供試溶液，分別在 0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，結(jié)果蟲草素峰面積RSD值為2.37%，表明供試品溶液在24 h是穩(wěn)定的。

3.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取蛹蟲草A樣品，稱取0.1 g共6份，制備供試品溶液，測(cè)定結(jié)果蟲草素峰面積的RSD值為3.85%，表明樣品的重復(fù)性良好。

3.2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

向已知蟲草素含量的蛹蟲草A和冬蟲夏草D中加入不同量的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加入的蟲草素量約為本底值的0.5、1和2倍，按照2.1.3超聲法制備供試溶液，按照2.1.1的色譜條件測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 2 The determination results of recovery（n=6）

由表2可見(jiàn)，樣品的加標(biāo)回收率在90.00%～99.05%范圍內(nèi)，表明該方法提取測(cè)定蟲草素的含量準(zhǔn)確可行。

3.3 蛹蟲草與冬蟲夏草中蟲草素含量和總糖比較

蛹蟲草與冬蟲夏草中蟲草素和總糖測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蟲草素和總糖含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of cordycepin and total sugar content

表3顯示，不同產(chǎn)地的蛹蟲草中蟲草素含量有一定區(qū)別，其中來(lái)自于吉林省農(nóng)科院的蛹蟲草A中的蟲草素含量顯著高于其他兩種，這可能與培養(yǎng)蛹蟲草所用的菌種、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基差異有關(guān)，也可能與新鮮程度有關(guān)，含量達(dá)1.39%的樣品A為新生產(chǎn)樣品，含量為0.48%的樣品B為3個(gè)月前生產(chǎn)，含量為0.11%的樣品C為一年前生產(chǎn)，這一現(xiàn)象，提醒對(duì)蟲草素穩(wěn)定性進(jìn)行研究很有必要，也提醒對(duì)生產(chǎn)方式進(jìn)行研究非常必要。有文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]冬蟲夏草中含有一定量的蟲草素，但本文用已建立的方法對(duì)西藏那曲和新疆玉樹產(chǎn)的冬蟲夏草進(jìn)行測(cè)定，并未檢出蟲草素，有可能是以下原因：首先可能是蟲草素隨冬蟲夏草生存環(huán)境的變化而有所變化；也可能是本方法的檢出限不夠低，不能夠檢測(cè)出含量很低的蟲草素；也可能是和樣品放置時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。

兩個(gè)來(lái)源的冬蟲夏草總糖含量非常接近，但都低于蛹蟲草中的總糖含量，這可能和它們的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，蛹蟲草在生長(zhǎng)過(guò)程中有足夠的碳源來(lái)合成碳水化合物，所以總糖含量相對(duì)較高；不同產(chǎn)地的蛹蟲草總糖含量有一定的差別，可能和培養(yǎng)環(huán)境及所用培養(yǎng)基有關(guān)。

蛹蟲草總糖含量趨勢(shì)恰恰與蟲草素含量趨勢(shì)相反，呈明顯的負(fù)相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)-0.894 1），兩類成分的積累是否拮抗，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文建立了利用高效液相色譜測(cè)定蛹蟲草和冬蟲夏草中蟲草素含量的方法，此方法結(jié)果穩(wěn)定可靠，是測(cè)定蟲草樣品中蟲草素含量的有效方法。

比較了不同產(chǎn)地的冬蟲夏草和不同來(lái)源的蛹蟲草中蟲草素和總糖含量，得到以下結(jié)論：1）蛹蟲草中蟲草素含量顯著高于冬蟲夏草；2）蛹蟲草中總糖含量也顯著高于冬蟲夏草；3）不同來(lái)源蛹蟲草蟲草素和總糖含量差異顯著，且有明顯的負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，其機(jī)理有待深入研究。

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Determination of Cordycepin and Total Sugar in Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris

MENG Fan-lei，SONG Zhi-feng，LIU Xiao-xiao，NIU Hong-hong，CAI Hong-mei，WEI Chun-yan*
（Institute of Agricultural Quality Standard and Testing Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，Jilin，China）

A high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of cordycepin content in Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis was developed，and the contents of cordycepin and total sugar in both of them with different places of production were compared.Water was used to extract the cordycepin，which was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Then，phenol sulfuric acid method was applied to detect the content of total sugar from Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis.The results showed that no detectable cordycepin in Cordyceps sinensis，and the contents of cordycepin were different because of the different places of origin，they were 1.39%，0.48%，0.11%，respectively.The total sugar content of Cordyceps militaris was higher than that of Cordyceps sinensis，the contents of total sugar of Cordyceps sinensis from different origins were similar，but that of Cordyceps militaris from different origins were different，they were 14.69%，20.61%，34.33%，respectively.

Cordyceps sinensis；Cordyceps militaris；cordycepin；total sugar；high performance liquid chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.028

孟繁磊（1985—），女（漢），助理研究員，碩士研究生，主要從事食品質(zhì)量安全檢測(cè)方面的研究。

*通信作者：魏春雁（1962—），女，教授，主要從事食品質(zhì)量安全檢測(cè)方面的研究。

2017-03-20