韓婉清，王斌，王莉，冼燕萍

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣州市食品安全檢測技術(shù)重點實驗室，廣州市食品安全風險動態(tài)監(jiān)測與預(yù)警研究中心，廣東廣州510000）

UPLC-MS/MS法測定涼茶飲料中的有機酸和黃酮類化合物

韓婉清，王斌，王莉，冼燕萍*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣州市食品安全檢測技術(shù)重點實驗室，廣州市食品安全風險動態(tài)監(jiān)測與預(yù)警研究中心，廣東廣州510000）

建立一種超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定涼茶飲料中5種有機酸和黃酮類化合物的方法。樣品經(jīng)高速離心，甲醇稀釋后，經(jīng) BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離，乙腈-0.1%甲酸水（體積分數(shù)）梯度洗脫，串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測。5種目標物的方法檢出限在0.2 mg/L～0.5 mg/L，在0.02 mg/L～0.5 mg/L濃度范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。添加水平為1.0 mg/L～40 mg/L時，平均回收率為86.3%～102%；相對標準偏差（RSD，n=6）為2.4%～8.7%。

涼茶；有機酸；黃酮類化合物；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）

涼茶是由藥食同源的植物為原料，經(jīng)熬制后具有清熱解毒、生津止渴等功效的植物飲料。由于涼茶是采用化學成分尚不明確的植物原料熬制而成的復(fù)方制劑，產(chǎn)品成分復(fù)雜，目前尚未有關(guān)于涼茶具體組分的明確報道，僅有國內(nèi)部分機構(gòu)利用質(zhì)譜技術(shù)進行主要活性成分的定性篩查。游飛祥等利用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography of quadrupole time of flight-mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）分析鑒定了植物涼茶中的化學成分，共鑒定出43種有機酸類和黃酮苷類物質(zhì)[1]。梁慧等利用HPLC-TOF-MS和高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜（high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometric，HPLC-IT-MS）進行癍痧涼茶的化學成分分析，鑒定出主要活性成分為有機酸、黃酮類和三萜皂苷類物質(zhì)[2]。但是，對涼茶飲料中這些活性成分的定量測定鮮有文獻報道。

目前，國內(nèi)外對于有機酸、黃酮類化合物的檢測方法研究，主要集中在果汁[3]、酒[4]、植物性食品[5]、中草藥[6]等領(lǐng)域，所用方法多為液相色譜法[7-8]、離子交換色譜法[9]，亦有關(guān)于毛細管電泳[10]、氣相色譜[11]等方法的報道。這些檢測方法都存在因易受基質(zhì)干擾而造成假陽性的缺陷，因此對樣品的凈化要求高。本文采用超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定涼茶飲料中奎寧酸、綠原酸、甘草苷、柚皮苷、槲皮素等5種有機酸和黃酮類物質(zhì)，5種目標物的化學結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 5種目標物的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of 5 target compounds

由于涼茶飲料成分復(fù)雜，植物源性激素、多糖、色素等物質(zhì)的存在都可能對目標物的痕量檢測造成干擾，本試驗采用串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測，具有良好的選擇性和抗干擾能力，方法可在6 min內(nèi)實現(xiàn)目標物的準確定性和定量，滿足市售實際樣品的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC-MS/MS ACQUITYTM-XevoTMTQ MS超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Waters公司；5418高速離心機：德國Eppendorf公司；MS3 basic渦旋振蕩器：德國IKA公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司。

綠原酸（Chlorogenic acid，CAS327-97-9，純度95%）、奎寧酸（D-Quinic acid，CAS：77-95-2，純度98%）、甘草苷（Liquirtin，CAS：551-15-5，純度99%）、槲皮素（Quereetin，CAS：117-39-5，純度 98%）、柚皮苷（Naringin，CAS：10263-47-2，純度 98%）：德國 Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇：HPLC級，德國Merck公司；甲酸：HPLC級，德國CNW公司；超純水（18.2 MΩ）。

5種標準物質(zhì)用少量水溶解后，加入甲醇定容，配制成單標標準儲備液；分別吸取適量的單標標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成10.0 mg/L的混合標準溶液，4℃避光保存，臨用前用甲醇稀釋成所需濃度的混合標準工作液。

5份市售分析樣品：3份自制涼茶購自廣州市散裝涼茶零售店；1份干粉狀涼茶購自網(wǎng)絡(luò)；1份預(yù)包裝植物涼茶飲料購自廣州市內(nèi)超市。

1.2 供試溶液的制備

取適量涼茶樣品，13 000 r/min高速離心5 min，吸取1.0 mL上清液，加入甲醇稀釋并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，供UPLC-MS/MS測定。

涼茶干粉按說明書所述比例，用超純水沖制成涼茶溶液后，按上述方法進行供試液的制備。

1.3 儀器條件

色譜柱：BEHC18色譜柱，100mm×2.1mm，1.7μm；流動相：A.0.1%甲酸水溶液（體積分數(shù)），B.乙腈，梯度洗脫程序：0.0 min～4.0 min，80% ～5%A；4.0 min～5.0 min，5%A；5.0 min ～5.1 min，5%～80%A。流速：0.2 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：30℃。5種待測物的保留時間見表1。

表1 5種待測物的保留時間和質(zhì)譜分析條件Table 1 Retention time and MS parameters for the analysis of 5 target compounds

質(zhì)譜條件：ESI負模式；毛細管電壓1.5 kV；離子源溫度150℃；去溶劑氣溫度400℃；去溶劑氣：氮氣，800 L/h；錐孔氣：氮氣，50 L/h；碰撞氣：高純氬氣，0.15 mL/min；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；5種目標物監(jiān)測離子對（m/z）及錐孔電壓、碰撞能等參數(shù)見表1，每個離子對的駐留時間均為0.06 s。

2 結(jié)果和討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

5種目標物中，有機酸分子結(jié)構(gòu)中含有羧基，黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，在ESI-電離方式下均可獲得豐度較高的脫氫準分子離子峰[M-H]-，對各目標物分別優(yōu)化錐孔電壓使各母離子豐度達到最大。對確定的母離子進行二級質(zhì)譜掃描，各目標物的質(zhì)譜裂解途徑見表2。根據(jù)歐盟2002/657/EC指令的要求，每種化合物（除綠原酸外）均選擇2個特征碎片離子作進行定量和定性，通過優(yōu)化碰撞能，使特征碎片離子豐度達到最大，經(jīng)優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表2 5種目標物的質(zhì)譜裂解途徑Table 2 Fragmentation pathways of 5 target compounds

試驗比較了 BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和 BEH T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱對 5種待測物的分離效果（見圖2），結(jié)果顯示，目標物經(jīng)T3柱分離后，綠原酸會出現(xiàn)分峰現(xiàn)象（分裂成Rt=2.47 min和 3.44 min），甘草苷（Rt=4.35）和柚皮苷（Rt=4.47）不能完全分離；經(jīng)C18柱分離后，各目標物能實現(xiàn)完全分離，峰型尖銳，響應(yīng)較高。因此，選擇BEH C18色譜柱分離。

比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水（體積分數(shù)）和乙腈-10 mmol/L乙酸銨3組流動相體系對目標物響應(yīng)和分離效果的影響。由于有機酸中的羧基可與色譜柱固定相中的硅醇殘基發(fā)生相互作用，在使用乙腈-水體系作為流動相時，奎寧酸和綠原酸等有機酸的色譜峰出現(xiàn)分裂或變寬拖尾現(xiàn)象；盡管在ESI-電離模式下，使用酸性的流動相體系會抑制目標物的電離，導致響應(yīng)降低，但各目標物峰形較好，尤其是乙腈-甲酸體系，目標物峰形尖銳對稱。比較了甲醇和乙腈作為有機相對目標物洗脫的影響，結(jié)果顯示，采用乙腈洗脫，目標物的分離效果和峰形均優(yōu)于甲醇體系，因此，選擇乙腈-0.1%甲酸水（體積分數(shù)）作為流動相體系。通過優(yōu)化梯度洗脫程序，使各目標物的分離效果和響應(yīng)值達到最佳，目標物標準溶液在優(yōu)化的儀器條件下的總離子流色譜圖見圖3。

圖2 不同色譜柱對待測物的分離效果Fig.2 Separation result of different column

圖3 目標物的總離子流色譜圖Fig.3 TIC chromatogram of target compounds

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關(guān)系和檢出限

按 1.1 配制濃度分別為 0.02、0.05、0.1、0.3、0.5 mg/L的系列目標物混合標準工作溶液。按本試驗確定的儀器條件（1.3）進行測定，以各目標物峰面積為縱坐標（y），以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標（x）作標準曲線，獲得各目標物的線性方程及相關(guān)系數(shù)。

對涼茶樣品進行加標，經(jīng)前處理后對樣液進行檢測，根據(jù)信號噪音比3（S/N=3）和稀釋倍數(shù)計算方法檢出限（LOD）。

5種目標物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限見表3。可見，各目標物在0.02 mg/L～0.5 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0；方法檢出限為 0.2 mg/L～0.5 mg/L。

2.2.2 方法回收率和精密度

選取涼茶樣品進行3個濃度水平的加標試驗，每個濃度平行6次，計算方法回收率和精密度，結(jié)果見表4。

表3 目標物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限Table 3 Equation of linear correlation，correlation coefficient and the method detection limit（LOD）of target analytes

表4 回收率和精密度測定結(jié)果（n=6）Table 4 Determination results of recoveries and precisions（n=6）

在添加濃度范圍內(nèi)，5種目標物的平均回收率為86.3%～102%；相對標準偏差（RSD，n=6）為2.4%～8.7%。

2.3 實際樣品檢測

利用建立的方法，對市售5份涼茶樣品進行測定，每個樣品重復(fù)測定3次，以驗證方法的適用性，各樣品中有機酸和黃酮類化合物的含量見表5，所測5份樣品均檢出了奎寧酸和綠原酸，4份樣品含有甘草苷，1份樣品含有柚皮苷，均未檢出槲皮素。其中樣品3（感冒茶）的總離子流色譜圖見圖4。

表5 樣品中目標物的測定情況Table 5 Determination reslults of target compounds in samples

3 結(jié)論

本試驗建立了超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定涼茶中5種有機酸和黃酮類化合物的方法，樣品經(jīng)高速離心后，用甲醇稀釋，過濾，UPLC-MS/MS電噴霧負離子電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，目標物以保留時間和特征離子對定性，外標法定量。本方法前處理過程簡單，抗干擾能力強，適用于涼茶等植物飲料中有機酸和黃酮類化合物的檢測。

圖4 實際樣品的總離子流色譜圖Fig.4 TIC chromatogram of real sample

[1]游飛祥,韓彥琪,龔蘇曉,等.HPLC-Q-TOF-MS分析植物涼茶中的化學成分[J].食品研究與開發(fā),2016,37(8):161-165

[2]梁慧,鄧潔薇,楊運云.高效液相色譜-質(zhì)譜法對癍痧涼茶的化學成分鑒定及指紋圖譜研究[J].分析測試學報,2014,33(2):144-149

[3]陳意光,鄧穗興,柯振華,等.高效液相色譜法同時測定果汁中13種有機酸和白藜蘆醇[J].現(xiàn)代食品科技,2010,26(12):1387-1390

[4]施超歐,姚寶龍,胡咪,等.離子轉(zhuǎn)換色譜-紫外檢測法測定啤酒中的無機陰離子和有機酸[J].色譜,2016,34(10):951-955

[5]徐慧敏,施婷婷,檀華蓉,等.高效液相色譜法同時測定蔬菜中有機酸與磺胺類抗生素[J].分析試驗室,2016,35(10):1135-1139

[6]王波,周圍,劉小花,等.基于超高效合相色譜對黃芪中5種主要黃酮類化合物的快速檢測[J].分析化學,2016,44(5):731-739

[7]Abdelrahman S Z,Nattha P,áurea A,et al,Chenyu D.A.A new HPLC method for simultaneously measuring chloride,sugars,organic acid and alcohols in food samples[J].Journal of Food Composition and Analysis,2017,56:25-33

[8]Xiujuan X,Dan Z,Wei Z,et al.Microwave-assisted aqueous twophase extraction coupled with high performance liquid chromatography for simultaneous extraction and determination of four flavonoids incrotalariasessilifloraL[J].Industrial Crops and Products,2017,95:632-642

[9]熊治渝,董英,周洪斌,等.在線富集離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用發(fā)同時測定飼料添加劑中的16種有機酸[J].色譜,2014,32(2):145-150

[10]彭振磊,張育紅,王川.石化廢水中低碳有機酸的毛細管電泳分析[J].分析試驗室,2015,34(7):850-854

[11]Magiera S,Uhlschmied C,Rainer M,et al.GC-MS method for the simultaneous determination of β-blocker,flavonoids,isoflavones and their metabolites in human urine[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2011,56:93-102

Quantitative Analysis of Organic Acid and Flavonoid in Herbal Tea by UPLC-MS/MS

HAN Wan-qing，WANG Bin，WANG Li，XIAN Yan-ping*
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food（Guangzhou），Guangzhou Key Laboratory of Detection Technology for Food Safety，Guangzhou Research Centre of Risk Dynamic Detection and Early Warning for Food Safety，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

A method for quantitative analysis of 5 kinds of organic acid and flavonoid compounds in herbal tea by ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）was developed.Samples were centrifuged，diluted with methanol，and separated on BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column with acetonitrile-0.1%formic acid solution as mobile phase by gradient elution.Quantitative analysis was performed by a triple quadrupole MS system with negative electrospray ionization（ESI-）operated under multiple reaction monitoring（MRM）mode.The method showed a good linearity with correlation coefficients（r）larger than 0.999 0 at the concentration of 0.02 mg/L-0.5 mg/L.The limits of detection（LOD）of the method ranged 0.2 mg/L-0.5 mg/L.At the spiked level of 1.0 mg/L-40 mg/L，the average recoveries presented 86.3%-102%，with the relative standard deviation（RSD，n=6）values varied between 2.4%-8.7%.

herbal tea；organic acid；flavonoid；ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.025

廣東省質(zhì)監(jiān)局科技計劃項目（2015CZ13）；廣州市質(zhì)監(jiān)局科技計劃項目（2015kj01）

韓婉清（1987—），女（漢），工程師，碩士，從事產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測研究。

*通信作者

2017-01-20