劉琦，生威，李志，李詩潔，張燕，王碩

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津300457）

基于單克隆抗體的玉米赤霉烯酮檢測方法研究

劉琦，生威，李志，李詩潔，張燕，王碩*

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津300457）

建立一種檢測谷物樣品中玉米赤霉烯酮的酶聯(lián)免疫分析方法。將玉米赤霉烯酮修飾羧基制得半抗原，再與鑰孔嘁血藍蛋白偶聯(lián)，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過細胞融合與篩選，得到3株具有高親和力和特異性的雜交瘤細胞，分別為2E8、2C7、6E11，重鏈類型均為IgG1，輕鏈類型均為Kappa。細胞株2E8分泌的抗體特異性較好，制備腹水得到單克隆抗體用于后續(xù)實驗。建立檢測玉米赤霉烯酮的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法，方法的靈敏度（IC50）為（0.13±0.02）ng/mL，檢測限（IC15）為（0.02±0.01）ng/mL，在玉米和燕麥中的檢出限分別為2.4 μg/kg，4.0 μg/kg。加標回收率為82.80%～109.20%，變異系數(shù)為3.27%～15.38%。經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質譜儀驗證（R2=0.996 3）二者具有良好的相關性。

玉米赤霉烯酮；單克隆抗體；間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法；高效液相色譜-串聯(lián)質譜法

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、木賊鐮刀菌、粉紅鐮刀菌等產(chǎn)生的一種真菌毒素[1]。ZEN具有雌激素活性，造成動物體內生殖激素紊亂，嚴重影響動物的繁殖機能[2-5]。我國GB 2761-2011《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》規(guī)定[6]：谷物及其制品中，ZEN限量為60 μg/kg。

目前，檢測ZEN的方法主要有色譜法和免疫分析法[7]?；谏V檢測的方法如高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）[8-9]以及高效液相色譜-質譜聯(lián)用（High performance liquid chromatography-Mass sepectrum，HPLC-MS）[10-11]等方法具有準確度好，靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，是目前應用于食品中有害小分子物質檢測的實驗室確證方法。免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法[12]、膠體金免疫層析法[13-14]以及免疫生物傳感器技術[15-18]，具有高特異性、靈敏性，不需要貴重儀器，可以大大簡化前處理過程，在現(xiàn)場檢驗以及批量篩選中具有重要意義[19]。王元凱等[20]制備ZEN單克隆抗體并建立一種間接競爭酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法。方法的靈敏度為1.90μg/kg，檢測限為0.051μg/kg。祭芳等[21]制備ZEN單克隆抗體，腹水效價大于1×10-6，抗體靈敏度為225 ng/mL。Sun等[22]經(jīng)過細胞融合，得到四株特異識別玉米赤霉烯酮的單克隆抗體。選擇最為靈敏的細胞株4A3-F9（IC50=1.115 ng/mL）進行ELISA方法的建立，方法回收率為91.30～97.07%。Pei等[23]通過高通量酶聯(lián)免疫分析對雜交瘤細胞進行篩選，制備的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體靈敏度IC50=1.79 ng/g，檢測限為IC15=0.1 ng/g，對玉米樣品進行了測定，方法回收率為80%～128%。

本研究使用單克隆抗體技術，得到抗玉米赤霉烯酮的單克隆抗體，并建立一種用于檢測谷物中玉米赤霉烯酮的間接競爭ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）標準品、鑰孔嘁血藍蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）、弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant）、弗氏不完全佐劑（Freund's incomplete adjuvant）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）：美國 Sigma公司；羧甲基羥胺、無水吡啶：法國阿法埃莎公司；Free DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT、HT：美國GIBCO公司；MycoSep 226凈化柱：美國Romer公司；甲醇（色譜純）：德國Merck公司；其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

玉米、燕麥樣品購自天津某超市，經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質譜分析為陰性樣品。

1.2 儀器與設備

Mycosep226凈化柱：美國Romer公司；酶標儀、CO2細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；倒置顯微鏡：日本NIKON公司；液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）和Agilent MassHunter工作站）：美國安捷倫公司。

1.3 實驗動物與細胞株

實驗動物為健康雌性BALB/c小鼠：北京軍事醫(yī)學科學院；骨髓瘤細胞為Sp2/0細胞：天津科技大學教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室保存。

1.4 方法

1.4.1 人工抗原的合成

玉米赤霉烯酮半抗原的制備方法參照文獻[24]并改進，步驟如下：稱取10 mg玉米赤霉烯酮于圓底燒瓶中，加入200 μL甲醇使其溶解。加入20 mg羧甲基羥胺（Carboxymethoxylamine，CMO），1 mL無水吡啶，氬氣保護下室溫攪拌反應24 h，反應結束后50℃真空干燥除去吡啶，4℃保存待用。

免疫抗原的制備參照方法[12]并改進，步驟如下：稱取上述所得半抗原9.78 mg和EDC 14 mg，加入1 mL DMF溶液，攪拌并4℃活化過夜。將10 mg KLH溶于2 mL碳酸氫鈉緩沖液（130 mmol/L，pH=8.1），在冰浴中逐滴加入活化產(chǎn)物，室溫下反應2 h后在4℃下反應過夜。將產(chǎn)物用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffercd saline，PBS）溶液透析72 h，測定其濃度并分裝，凍存于-20℃。包被抗原（Zearalenone-ovalbumin，ZEN-OVA）的制備方法同免疫原。

1.4.2 單克隆抗體的制備

將免疫原100 μg與等體積的弗式完全佐劑混合均勻（加強免疫使用弗氏不完全佐劑）免疫動物。分別于第2、3、4次免疫后8 d～10 d在小鼠尾動脈處取血，采用間接競爭ELISA進行檢測。沖刺免疫后取脾細胞與Sp2/0融合，采用有限稀釋法3次克隆化，得到能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株。采用辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體腹水，并使用亞型鑒定試劑盒對所產(chǎn)抗體的亞型進行鑒定。

1.4.3 間接競爭ELISA方法

在 37℃下，將 100 μL 的包被抗原（1 μg/孔）加入到聚苯乙烯酶標板上，孵育3 h。棄去孔中液體，用0.05%吐溫20-磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferad sahne mith 0.05%tween 20，PBST） 洗液洗板 3 次 （250 μL/孔），拍干；使用 0.5%脫脂乳粉溶液（200 μL/孔）對微孔進行封閉1 h，PBST洗液洗板3次；實驗孔加入標準品（50 μL/孔），對照孔加入等量的 PBS，同時加入用PBS緩沖液梯度稀釋的抗血清（50 μL/孔），孵育1 h，PBST洗液洗板4次；加入用PBS緩沖液稀釋10 000倍的羊抗鼠酶標二抗（100 μL/孔），孵育30 min，PBST 洗液洗板 5次；加入底物液（100 μL/孔），反應 15 min～20 min；加入終止液（50 μL/孔）終止反應；用酶標儀在雙波長（450、650nm）下，讀取吸光值。

1.4.4 間接競爭ELISA方法標準曲線的繪制

設定 ZEN標準品濃度值分別為10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.013 7、0.004 6、0 ng/mL。標準品濃度為0時的吸光值設為B0，不同濃度標準品的吸光值設為B，空白對照的吸光值設為B空白，抑制率計算公式為：1-[（B-B空白）/（B0-B空白）]×100%。以標準品濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制標準抑制曲線。

1.4.5 抗體特異性的測定

選擇幾種常見的真菌毒素以及玉米赤霉烯酮結構類似物測定交叉反應來評價抗體特異性。交叉反應率（cross-reactivity，CR%）計算公式如下：

1.4.6 甲醇含量對ELISA反應體系的影響

谷物樣品的提取需要使用甲醇作為提取液。配制濃度為0%、1%、5%、10%、20%、40%的甲醇/PBS溶液作為樣品稀釋液進行間接競爭ELISA，考察有機試劑含量對ELISA體系的影響。

1.4.7 高效液相色譜串聯(lián)質譜法的驗證

1.4.7.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：甲醇 ∶0.05%氨水=50∶50（體積比）；載氣流速 0.2 mL/min，進樣量 1 μL；柱溫箱溫度：25℃。

1.4.7.2 質譜條件

電噴霧電離源（ESI-）；碰撞能量25 V；毛細管電壓140 V；母離子m/z 317.36；子離子m/z 131.1；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L/min。

1.4.8 實際樣品測定

間接競爭ELISA方法谷物樣品處理方法：

樣品處理方法參照文獻[25]并改進，方法如下：準確稱取5 g谷物樣品，粉碎后加入20 mL70%甲醇-水溶液，劇烈震蕩2 min，10 000 r/min離心15 min，取上清用PBS稀釋后測定。向玉米樣品中分別添加玉米赤霉烯酮標準品5、10、20 μg/kg，向燕麥樣品中分別添加15、25、50 μg/kg，計算回收率以及變異系數(shù)。

高效液相色譜串聯(lián)質譜法谷物樣品處理方法：

樣品處理方法參照文獻[26]并改進，方法如下：準確稱取2 g谷物樣品，粉碎后加入10 mL70%甲醇-水溶液，劇烈震蕩2 min，10 000 r/min離心15 min，使用MycoSep 226多功能凈化柱進行凈化。氮氣吹干有機溶劑，取1 mL甲醇復溶試管底部殘渣，溶液經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾后進行分析。加標回收方法同間接競爭ELISA方法谷物樣品處理方法，并比較兩種方法的相關性。

2 結果與分析

2.1 細胞篩選及亞型鑒定

對4只小鼠進行免疫，經(jīng)測定均有免疫應答。小鼠4經(jīng)免疫后效價達到1∶128 000，對100 ng/mL的ZEN標準品抑制率達到83.2%，因此選擇小鼠4進行細胞融合。本次細胞融合獲得3株雜交瘤細胞。經(jīng)測定重鏈類型均為IgG1；輕鏈類型均為Kappa。純化腹水并進行特異性測定，結果見表1。

表1 單克隆抗體特異性及亞型測定Table 1 The sensitivity and isotype of monoclonal antibody

2.2 間接競爭ELISA方法標準曲線

選擇細胞株2E8分泌的單克隆抗體建立間接競爭ELISA方法。ELISA方法工作條件為：包被抗原包被量為0.01 μg/孔，抗體稀釋4萬倍，采用0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液來稀釋標準品，得到玉米赤霉烯酮的間接競爭標準曲線如圖1所示。方法靈敏度IC50=（0.13±0.02）ng/mL，檢測限 IC15=（0.02±0.01）ng/mL。

圖1 ZEN間接競爭ELISA標準曲線Fig.1 Standard curve of ZEN by ic-ELISA

2.3 抗體特異性測定

交叉反應測定結果見表2。制備的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與其他真菌毒素幾乎無交叉，說明抗體的特異性較好。與4種結構類似物均有交叉，與玉米赤霉酮交叉較小。由于此結構類似物是由玉米赤霉烯酮代謝產(chǎn)生，且均有毒性，因此，本次制備的抗體可實現(xiàn)對這4種結構類似物的檢出。

表2 抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體與其他真菌毒素的交叉反應Table 2 Cross-reactivity of anti-ZEN monoclonal antibody with mycotoxin

2.4 甲醇含量對間接競爭ELISA的影響

甲醇含量對間接競爭ELISA的影響結果見圖2。

圖2 甲醇含量對間接ELISA的影響Fig.2 The influence of methanol on ic-ELISA

當甲醇含量低于5%時，對ELISA反應影響較小。甲醇含量大于5%時影響抗原抗體反應，降低ELISA反應的靈敏度。尤其是當甲醇超過20%時，靈敏性顯著降低。因此，當甲醇含量低于5%時，可認為對ELISA體系影響較小。

2.5 樣品基質影響及消除

對樣品提取液進行不同倍數(shù)的稀釋，繪制標準曲線，以確定能夠消除基質影響的最適稀釋倍數(shù)，結果見圖3。

圖3 樣品提取液稀釋倍數(shù)對ELISA反應的影響Fig.3 The influence of dilution multiple of sample extraction buffer on ic-ELISA

由圖3可知，玉米樣品提取液稀釋30倍，燕麥樣品提取液稀釋50倍后進行測定可以基本消除基質影響，且此時甲醇含量不超過5%。

2.6 實際樣品測定結果

樣品測定結果見表3。

表3 樣品添加回收試驗（n=3）Table 3 Recovery test in samples（n=3）

可知間接競爭ELISA方法的加標回收率在82.80%～109.20%之間，液相色譜串聯(lián)質譜方法的加標回收率在76.20%～103.00%。經(jīng)過比較二者線性相關系數(shù)值R2為0.996 3，兩種方法檢測的結果較為一致，說明ELISA方法較為準確。根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)可以得出間接競爭ELISA方法在玉米和燕麥中的檢出限分別為 2.4 μg/kg，4.0 μg/kg。

3 結論

本研究經(jīng)過細胞融合與篩選得到3株能夠特異性分泌抗體的雜交瘤細胞，對玉米赤霉烯酮均具有高度特異性。選擇最優(yōu)細胞株建立檢測玉米赤霉烯酮的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法。方法的靈敏度（IC50）為（0.13±0.02）ng/mL，檢測限（IC15）為（0.02±0.01）ng/mL，在玉米和燕麥中的檢出限分別為 2.4 μg/kg，4.0 μg/kg。經(jīng)液相色譜串聯(lián)質譜法驗證二者相關性良好，方法操作簡單且靈敏，可用于檢測多種谷物中的玉米赤霉烯酮含量。

[1]RICHARD J L.Some major mycotoxins and their mycotoxicoses--an overview[J].International Journal of Food Microbiology,2007,119(1/2):3-10

[2]MOLTó J C.Review on the toxicity,occurrence,metabolism,detoxification,regulations and intake of zearalenone:an oestrogenic mycotoxin[J].Food&ChemicalToxicology,2007,45(1):1-18

[3]YANG J,ZHANG Y,WANG Y,et al.Toxic effects of zearalenone and alpha-zearalenol on the regulation of steroidogenesis and testosterone production in mouse Leydig cells[J].Toxicology in Vitro,2007,21(4):558-565

[4]單妹,許梓榮,馮建蕾.玉米赤霉烯酮對家畜繁殖性能和人體健康的影響[J].中國畜牧獸醫(yī),2006,33(1):37-39

[5]MARIN D E,TARANU I,BURLACU R,et al.Effects of zearalenone and its derivatives on porcine immune response[J].Toxicology in Vitro An International Journal Published in Association with Bibra,2011,25(8):1981-1988

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2761-2011食品中真菌毒素限量[S].北京:中國標準出版社,2011

[7]馬惠蕊,王玉坤,劉淑艷,等.食源性真菌毒素檢測技術研究進展[J].福建分析測試,2011,20(1):40-43

[8]羅小虎,包清彬,楊瀟,等.高效液相色譜法測定玉米赤霉烯酮的方法研究[J].食品科技,2010(1):266-270

[9]尹青崗,王鋒,周洪杰,等.高效液相色譜法對玉米中玉米赤霉烯酮的測定[J].中國糧油學報,2009,24(7):138-141

[10]LI M,KONG W,LI Y,et al.High-throughput determination of multi-mycotoxins in Chinese yam and related products by ultra fast liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry after one-step extraction.[J].Journal of Chromatography B Analytical Technologies in the Biomedical&Life Sciences,2016,1022:118-125

[11]TRUCKSESS M W,FU W S,OLES C J,et al.Determination of zearalenone in botanical dietary supplements,soybeans,grains,and grain products by immunoaffinity column cleanup and liquid chromatography:single-laboratory validation.[J].Journal of Aoac International,2011,94(2):589-595

[12]王碩,張鴻雁,王俊平.酶聯(lián)免疫吸附分析方法:基本原理及其在食品化學污染物檢測中的應用[M].北京:科學出版社,2011:178-179

[13]WANG Y,DENG R,ZHANG G,et al.Rapid and sensitive detection of the food allergen glycinin in powdered milk using a lateral flow colloidal gold immunoassay strip test.[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2015,63(8):2172-2178

[14 KIM K Y,SHIM W B,KIM J S,et al.Development of a simultaneous lateral flow strip test for the rapid and simple detection of deoxynivalenol and zearalenone.[J].Journal of Food Science,2014,79(10):2048-2055

[15]LIN X,GUO X.Advances in Biosensors,Chemosensors and Assays for the Determination of Fusarium Mycotoxins.[J].Toxins,2016,8(6):161

[16]ZHAN S,HUANG X,CHEN R,et al.Novel fluorescent ELISA for the sensitive detection of zearalenone based on H2O2-sensitive quantum dots for signal transduction.[J].Talanta,2016,158:51-56

[17]HERVáS M,LóPEZ M á,ESCARPA A.Electrochemical immunoassay using magnetic beads for the determination of zearalenone in baby food:An anticipated analytical tool for food safety[J].Analytica Chimica Acta,2009,653(2):167-172

[18]CHOI S W,CHANG H J,LEE N,et al.Detection of mycoestrogen zearalenone by a molecularly imprinted polypyrrole-based surface plasmon resonance(SPR)sensor.[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2009,57(4):926-932

[19]朱慧莉,黎錫流,許喜林.酶聯(lián)免疫吸附法及其在食品分析中的應用[J].食品工業(yè)科技,2001(2):80-82

[20]王元凱,王君,王雨晨,等.玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及間接競爭ELISA檢測方法的建立[J].微生物學通報,2011,38(12):1793-1800

[21]祭芳,曹歡,徐劍宏,等.抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2014,30(2):417-422

[22]SUN Y,HU X,ZHANG Y,et al.Development of an immunochromatographic strip test for the rapid detection of zearalenone in corn[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2014,62(46):11116-21

[23]PEI S C,LEE W J,ZHANG G P,et al.Development of anti-zearalenone monoclonal antibody and detection of zearalenone in corn products from China by ELISA[J].Food Control,2013,31(1):65-70

[24]Thouvenot D,Morfin R F.Radioimmunoassay for zearalenone and zearalanol in human serum:production,properties,and use of porcine antibodies[J].Applied&Environmental Microbiology,1983,45(1):16-23

[25]LIU N,NIE D,ZHAO Z,et al.Ultrasensitive immunoassays based on biotin–streptavidin amplified system for quantitative determination offamilyzearalenones[J].FoodControl,2015,57:202-209

[26]鄭翠梅,張艷,王松雪,等.液相色譜-飛行時間質譜同時測定糧食中13種真菌毒素[J].分析測試學報,2012,31(4):383-389

Study on Immunoassay for the Detection of Zearaleone Based on Monoclonal Antibody

LIU Qi，SHENG Wei，LI Zhi，LI Shi-jie，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The aim of this research was to develop an enzyme linked immunosorbent assay to detect zearalenone in grain samples.Three hybridoma cells named 2E8，2C7，6E11 were obtained after cell fusion and filtering by immunizing Balb/c mouses with conjugate of ZEN and keyhole limpet hemocyanin.The subtypes of three monoclonal antibody were identified with IgG1 for heavy chain and Kappa for light chain.The cell 2E8 was chosen for subsequent experiments.An indirect-competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）was developed for the detection of zearalenone with high specificity and affinity after optimizing.The half maximal inhibitory concentration（IC50）was（0.13±0.02）ng/mL，the limit of detection（IC15）was（0.02±0.01）ng/mL while the the limits of detection are 2.4 μg/kg，4.0 μg/kg for corn and oat with the recoveries from 82.80%to 109.20%and the coefficients of variation was between 3.27%and 15.38%.The method was confirmed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry with a good correlation.

zearalenone；monoclonal antibody；indirect-competitive enzyme linked immunosorbent assay （ic-ELISA）；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.022

“十二五”國家科技支撐計劃（2013BAD18B11）；國家國際科技合作專項項目（2014DFR30350）

劉琦（1992—），女（漢），碩士，研究方向：食品安全檢測。

*通信作者：王碩（1969—），男，教授，博士生導師，研究方向：食品安全和免疫學檢測。

2017-02-20