響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚酒渣中花色苷提取工藝研究

胡彥新1，2，王英2，劉小莉2，董明盛1，周劍忠1，2，*
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014）

為提高桑葚酒渣中花色苷的提取率，以花色苷提取率為考察目標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法（RSM）對桑葚酒渣中花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，首先在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對液料比、提取時間、提取溫度、超聲功率、加酶量和pH值這6個因素進(jìn)行篩選，然后利用響應(yīng)面法對加酶量、提取溫度、提取時間進(jìn)行優(yōu)化。最終獲得提取花色苷最佳的工藝條件為：加酶量0.2%、提取溫度64℃、提取時間145 min。在此試驗(yàn)條件下花色苷的提取率為4.68 mg/g。

桑甚酒渣；花色苷；響應(yīng)面法

桑葚又稱?？埃置？白印⑸Ｕ?、桑棗、桑果、烏堪等，為桑科落葉喬木桑樹的成熟果穗，其化學(xué)成分復(fù)雜，營養(yǎng)豐富，成熟的桑葚果含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質(zhì)、白藜蘆醇、花青素等成分，其營養(yǎng)是葡萄的4倍、蘋果的5倍～6倍，具有提高人體免疫力、延緩衰老、促進(jìn)造血細(xì)胞生長、防止動脈硬化、促進(jìn)新陳代謝等多種功能。

桑葚酒渣是桑葚在果汁桑葚酒釀造等加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，桑葚酒渣中含有大量的花色苷，花色苷作為一種天然色素，安全、無毒、資源豐富，且具有清除體內(nèi)自由基、抗炎、抗癌、阻礙小腸對膽固醇和膽汁酸的吸收[1-5]、減輕肝機(jī)能障礙、抑制脂質(zhì)過氧化和用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病、抗突變、治療乳房囊腫，治療微循環(huán)疾病以及用于預(yù)防動脈粥樣硬化等保健功能，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[6-9]。

桑葚[10]酒渣中主要的活性成分是花色苷，在桑葚酒渣中含量豐富，為了節(jié)約時間、提高效率、簡化工序，本試驗(yàn)探究了液料比、提取時間、提取溫度、超聲功率、加酶量和pH值這6個因素對花色苷提取率的影響的大小[11-16]。首先利用單因素試驗(yàn)對液料比、提取時間、提取溫度、超聲功率、加酶量和pH值這6個因素進(jìn)行篩選，然后對加酶量、提取溫度、提取時間這3個主要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。最終得到提取桑葚酒渣中花色苷的最佳條件，為后期試驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定下夯實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚酒渣為桑葚酒發(fā)酵完畢后的副產(chǎn)物，經(jīng)冷凍干燥后備用。氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸（均為國產(chǎn)分析純）：湖南九典制藥股份有限公司。

UV-5100分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；LC-210.2精密電子天平：德國賽多利斯股份有限公司產(chǎn)品；SevenEasy plus pH儀：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16C臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-C-1恒溫振蕩器：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 桑葚酒渣中花色苷的提取

花色苷的提取采用超聲波輔助果膠酶法提取[17]：將一定料液比的桑葚酒渣在自然狀態(tài)下靜置1 h，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，隨后加入果膠酶和纖維素酶0.3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），超聲一段時間，獲得花色苷提取液。然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對上述所提取的花色苷提取液進(jìn)行濃縮，除去多余的水分，得到濃度較高花色苷提取液。

1.2.2 花色苷含量的測定

花色苷含量測定采用pH示差法[18]。依據(jù)pH示差法的原理取0.025 mol/L（pH1.0）的氯化鉀緩沖液和0.4 mol/L（pH 4.5）的乙酸鈉緩沖液各5 mL分別加入1 mL的待測樣品，混勻，室溫下避光平衡30 min，用蒸餾水作空白，在矢車菊素-3-葡萄糖苷最大吸收波長510 nm和700 nm（校正渾濁度）下，測定吸光度值，稀釋樣品的吸光度值以及原始樣品中花色苷含量按如下公式計(jì)算：

式中：TAcy為桑葚花色苷含量，mg/g；V為提取液的總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量，449.2；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；A為樣品的吸光度值；m為原料的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

1.2.3.1 料液比對提取率的影響

在固定超聲波功率400 W，pH 4.0、加酶量0.2%、提取溫度50℃和提取時間90 min條件下，考察不同的料液比（1 ∶0.5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20 g/mL）對其提取率影響，確定最佳料液比。

1.2.3.2 提取時間對提取率的影響

在固定超聲波功率400 W，pH 4.0、加酶量0.2%、提取溫度50℃和料液比1∶15（g/mL）條件下，考察不同的提取時間（30、60、90、120、150 min）對其提取率影響，確定最佳提取時間。

1.2.3.3 提取溫度對提取率的影響

在固定pH 4.0、加酶量0.2%、超聲波功率400 W、料液比1∶15（g/mL）和提取時間90 min條件下，考察不同的提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對其提取率影響，確定最佳提取溫度。

1.2.3.4 加酶量對提取率的影響

在固定超聲波功率400W，pH4.0、料液比1∶15 g/mL、提取溫度50℃和提取時間90 min條件下，測定不同的加酶量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）對其提取率影響，確定最佳加酶量。

1.2.3.5 超聲波功率對提取率的影響

在固定加酶量 0.2%，pH 4.0、料液比 1 ∶15（g/mL）、提取溫度50℃和提取時間90 min條件下，測定不同的超聲波功率（100、200、300、400、500 W）對其提取率影響，確定最佳超聲波功率。

1.2.3.6 pH值對提取率的影響

固定加酶量0.2%、料液比1∶15（g/mL）、超聲波功率400 W、提取溫度50℃和提取時間90 min條件下，測定不同的 pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0） 對其提取率影響，確定最佳pH值。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在固定料液比1∶15（g/mL）、超聲波功率300 W、pH 4.0等條件的前提下，選取加酶量、提取溫度和提取時間3個因素為自變量，以每克桑葚酒渣中提得的花色苷毫克數(shù)為指標(biāo)，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of central composite design

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比的影響

料液比的不同對花色苷提取的影響見圖1。

圖1 不同料液比對花色苷提取的影響Fig.1 Influence of difference solid-liquid ratio on the extraction of anthocyanin

由圖 1可知，在料液比低于 1∶15（g/mL）時，隨著料液比的不斷增大，花色苷提取率增大的趨勢較快。當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時，花色苷提取的提取率已經(jīng)達(dá)到相對比較大的數(shù)值4.26 mg/g，當(dāng)繼續(xù)增大料液比時，花色苷的提取率增加的趨勢逐漸變緩，并且最終趨于平穩(wěn)，考慮料液比過大，反應(yīng)體系較濃稠，不利于花色苷的溶出以及造成試驗(yàn)材料的浪費(fèi)，料液比為1 ∶15（g/mL）較適宜。

2.1.2 提取時間的影響

不同提取時間對花色苷提取的影響見圖2。

圖2 不同提取時間對花色苷提取的影響Fig.2 Influence of difference extraction time on the extraction of anthocyanin

由圖2可知，在提取時間低于120 min時，隨著提取時間的延長，花色苷提取率增大的趨勢較快。當(dāng)提取時間為120 min時，花色苷提取的提取率已經(jīng)達(dá)到相對比較大的數(shù)值4.58 mg/g，當(dāng)繼續(xù)延長提取時間時，花色苷的提取率增加的趨勢逐漸變緩，并且最終趨于平穩(wěn)，并且時間延長會導(dǎo)致更多的花色苷發(fā)生氧化而損失[19-21]。因此，綜合試驗(yàn)周期考慮，本試驗(yàn)將提取時間確定為120 min。

2.1.3 提取溫度的影響

不同提取溫度對花色苷提取的影響見圖3。

圖3 不同提取溫度取對花色苷提取的影響Fig.3 Influence of difference extraction temperature on the extraction of anthocyanin

由圖3可知，在提取溫度低于60℃時，隨著提取溫度的升高，花色苷提取率增大的趨勢較快。當(dāng)提取溫度為60℃時，花色苷提取的提取率已經(jīng)達(dá)到相對比較大的數(shù)值4.52 mg/g，繼續(xù)升高溫度，提取率反而下降，這是由于花色苷物質(zhì)耐熱性較差[22-23]，并且在高溫狀態(tài)下果膠酶和纖維素酶也容易失活，因此本試驗(yàn)將提取溫度確定為60℃。

2.1.4 加酶量的影響

不同加酶量對花色苷提取的影響見圖4。

圖4 不同加酶量對花色苷提取的影響Fig.4 Influence of difference enzyme dosage on the extraction of anthocyanin

如圖4所示，在加酶量低于0.2%時，隨著加酶量的增加，花色苷提取率增大的趨勢較快。當(dāng)加酶量為0.2%時，花色苷提取的提取率已經(jīng)達(dá)到相對比較大的數(shù)值4.56 mg/g，當(dāng)繼續(xù)增加加酶量時，花色苷的提取率增加的趨勢逐漸變緩，并且最終趨于平穩(wěn)。

2.1.5 超聲波功率的影響

不同超聲功率對花色苷提取的影響見圖5。

由圖5可知，在超聲功率低于300 W時，隨著超聲功率的升高，花色苷提取率增大的趨勢較快。當(dāng)超聲功率為300 W時，花色苷提取的提取率已經(jīng)達(dá)到相對比較大的數(shù)值4.52 mg/g，繼續(xù)升高超聲功率，提取率反而下降，因此本試驗(yàn)將超聲功率設(shè)定為300 W。

圖5 不同超聲功率對花色苷提取的影響Fig.5 Influence of difference ultrasonic power on the extraction of anthocyanin

2.1.6 pH值的影響

不同pH值對花色苷提取的影響見圖6。

圖6 不同pH值對花色苷提取的影響Fig.6 Influence of difference pH on the extraction of anthocyanin

由圖6可知，在pH低于4.0時，隨著pH值的升高，花色苷提取率呈現(xiàn)增大的趨勢。當(dāng)pH值為4.0時，花色苷提取的提取率已經(jīng)達(dá)到相對比較大的數(shù)值4.82 mg/g，繼續(xù)升pH值，提取率反而下降，這可能是因?yàn)樵谳^高的pH值條件下果膠酶和纖維素酶部分失活造成的[24]，因此本試驗(yàn)將pH值確定為4.0。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚酒渣花色苷提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立及其方差分析

雖然影響桑葚酒渣中花色苷提取率的因素很多，但加酶量、提取溫度和提取時間是影響其提取率的最主要的因素，通過方差分析，這3個因素對花色苷提取率影響顯著（P<0.05），故對這3個關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，利用Design Expert8.0.6對其進(jìn)行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值花色苷提取率（Y）對自變量 X1、X2、X3的二次多項(xiàng)式回歸方程

上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，結(jié)果表明，模型是極顯著的（P=0.000 1）失擬項(xiàng)不顯著（P=0.071 7），回歸模型的決定系數(shù)為0.966 1，說明該模型能解釋96.61%的變化，該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，用該模型對桑葚酒渣花色苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化可以獲得良好的效果。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

模型回歸系數(shù)顯著性分析見表4。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 4 Significance test for regression coefficients

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知；模型一次項(xiàng)X1、X2、X3極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)不顯著，交叉項(xiàng)X1X3、X1X2、X2X3極顯著（p＜0.01）。將二次回歸方程中一次項(xiàng)系數(shù)絕對值大小作為各參數(shù)對花色苷提取率影響的比較依據(jù)[25]，得出三因素對花色苷提取率影響的大小依次為：X3＞X1＞X2，即提取時間、加酶量和提取溫度。

2.2.2 響應(yīng)面分析的結(jié)果

響應(yīng)面分析的結(jié)果見圖7。

圖7 響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface

通過二次多項(xiàng)式回歸方程所得到的響應(yīng)面如圖7，可知 X1X2、X1X3、X2X3對桑葚酒渣花色苷提取率的影響極顯著（p＜0.01），由圖7可知，當(dāng)提取時間為120 min時，在加酶量0.15%～0.25%，提取溫度55℃～65℃時桑葚酒渣中花色苷提取量達(dá)到最大；當(dāng)提取溫度為60℃時，在加酶量0.15%～0.25%，提取時間110 min～130 min時桑葚酒渣中花色苷提取量達(dá)到最大；當(dāng)加酶量為0.2%時，在提取溫度55℃～65℃，提取時間110min～130min時桑葚酒渣中花色苷提取量達(dá)到最大。

2.3 模型的驗(yàn)證

當(dāng)將加酶量、提取溫度、提取時間的取值范圍分別設(shè)為 0.1%～0.3%、50℃～70℃、90 min～150 min，并將目標(biāo)值即花色苷的提取效率設(shè)定為最大值，通過Design-Expert 8.0.6軟件獲得最優(yōu)組合為加酶量0.2%、提取溫度63.95℃、提取時間143.67 min。在此最優(yōu)組合下，理論最佳桑葚酒渣花色苷的提取率為4.77 mg/g。根據(jù)實(shí)際條件的限制將最優(yōu)組合修正為：加酶量0.2%、提取溫度64℃、提取時間145 min，在此試驗(yàn)條件下桑葚酒渣花色苷的提取率為4.68 mg/g。與預(yù)測值相差不大，說明響應(yīng)面法對提取桑葚酒渣花色苷條件的優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)是以花色苷提取率為考察目標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法（RSM）對桑葚酒渣中花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，首先利用單因素試驗(yàn)對液料比、提取時間、提取溫度、超聲功率、加酶量和pH值這6個因素進(jìn)行篩選，然后利用響應(yīng)面法優(yōu)化加酶量、提取溫度、提取時間。最終獲得提取花色苷最佳的工藝條件為：加酶量0.2%、提取溫度64℃、提取時間145 min。在此試驗(yàn)條件下花色苷的提取率為4.68 mg/g。因此，利用響應(yīng)面分析方法對桑葚酒渣花色苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，該試驗(yàn)是可行的。

[1]孫建霞,張燕,胡小松,等.花色苷的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與降解機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(3):996-1008

[2]于東,陳杜星,方忠祥,等.花色苷提取、分離純化及鑒定的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(3):127-133

[3]BRIDLE P,TIMBERLAKE C F.Anthocyanins as natural food colours selected aspects[J].Food Chem,1997,58(1/2):103-109

[4]食品衛(wèi)生學(xué)編寫組.食品衛(wèi)生學(xué)[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2005

[5]凌文華,郭紅輝.植物花色苷[M].北京:科學(xué)出版社,2009

[6]賀強(qiáng),吳立仁.藍(lán)酶果實(shí)中營養(yǎng)成分的生物學(xué)功能[J].北方園藝,2010(24):222-224

[7]劉莉莉,姜傳福.藍(lán)酶的營養(yǎng)成分及其保健功能研究[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2013(9):62-63

[8]ZHOLOBOVA Z P.Basis for commercial cultivation of blue honeysuckle[J].Sadovodstvo I Vinogradarstvo,1990,8:23-25

[9]楊玲.藍(lán)靛果提取物抗氧化及抗癌作用的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2009

[10]帕麗旦.克里木.桑葚的開發(fā)研究進(jìn)展[J].新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,22(3):71-73

[11]瑪若,趙逸云,李化茂,等.超聲在生物技術(shù)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1994,2(6):500-505

[12]衰謀村,成昌梅,義志忠,等.超聲溶劑提取法研究[J].湘潭大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),1992,14(4):43-46

[13]張衛(wèi)紅,吳曉霞,馬空軍.超聲波技術(shù)強(qiáng)化提取天然產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代化工,2013,33(7):26-29

[14]程秀瑋,魏瑋,孫勇民.響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚花色苷提取工藝的研究[J].食品研究與開發(fā),2014(14):43-46

[15]程秀瑋,魏瑋.響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取桑葚花色苷工藝的研究[J].中國釀造,2014,33(6):123-127

[16]孟憲軍,王冠群,宋德群,等.響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓花色苷提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2010(7):226-229

[17]李亞輝,馬艷弘,黃開紅,等.超聲波輔助酶法提取黑莓酒渣中花色苷工藝優(yōu)化及其生物活性[J].食品科學(xué),2015,36(6):63-68

[18]孫婧超,劉玉田,趙玉平,等.pH示差法測定藍(lán)莓酒中花色苷條件的優(yōu)化[J].中國釀造,2011(11):171-174

[19]齊希光,沈波,張暉,等.響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯花色苷提取工藝研究[J].糧食與飼料工業(yè),2010(10):26-28

[20]YAMAZAKI J,KUSHIDA N,OGUCHI A,et al.Response surface design and analyses[M].New York:Marcel Dekker Inc,1987

[21]BENNETT A,BOGORAD L.Complementary chromatic adaptation in afilamentous blue-green alga[J].J Cell Biol,1973,58(2):419-435

[22]WANG S Y,LIN H S.Antioxidant activity in fruit and leaves of blackberry,raspberry and strawberry is affected by cultivar and maturity[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry,2000,48:140-1411

[23]張麗霞,周劍忠,顧振新,等.黑莓花色苷的分離純化與抗氧化活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(8):244-246

[24]高梓淳.藍(lán)莓花色苷提取與純化工藝初探[D].杭州:浙江大學(xué),2014

[25]祁小妮,隋英,李振亮,等.響應(yīng)曲面優(yōu)化菟絲子多糖提取工藝及抗氧化活性研究[J].中國釀造,2015,34(8):35-38

The Research on the Optimization of Anthocyanin Extraction in Mulberry Wine Residue by Response Surface

HU Yan-xin1，2，WANG Ying2，LIU Xiao-li2，DONG Ming-sheng1，ZHOU Jian-zhong1，2，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，Jiangsu，China 2.The Research Institute of Agricultural Product Processing，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China）

In order to improve the extraction efficiency of anthocyanin in the mulberry wine residue，the optimization of anthocyanin extraction in the mulberry wine residue were studied by the response surface methodology （RSM）.On the basis of one-factor test，six factors including solid-liquid ratio，extraction time，extraction temperature，ultrasonic power，enzyme quantity and pH value were screened.Afterwards，the enzyme quantity，extraction time and extraction temperature were optimized by response surface methodology.The optimum conditions of anthocyanin extraction mulberry wine residue were as follow：volume of enzyme 0.2%，the extraction temperature 64℃，the extraction duration 145 min.At this condition，the extraction yield of anthocyanin was 4.68 mg/g.

mulberry wine residue；anthocyanin；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.010

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目（CX(14)2118）

胡彥新（1990—），男（漢），碩士在讀，研究方向：食品微生物。

*通信作者：周劍忠（1965—），男，研究員，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

2017-02-21