甘田生，龔湘君

華南理工大學 材料科學與工程學院，廣東 廣州 510640

·新技術·

生物被膜的物理特性及其表征

甘田生，龔湘君

華南理工大學 材料科學與工程學院，廣東 廣州 510640

生物被膜涉及到人類生產生活的方方面面。生物被膜的形成有時是有益的，可用于生物降解、生物催化等；但同時也造成了諸多不利的影響，醫(yī)療領域中的感染性疾病、工業(yè)生產中的生物污損等均與生物被膜的形成有關。生物被膜形成過程中的物理性質決定著生物被膜的形態(tài)結構以及機械穩(wěn)定性，對它在應對外界環(huán)境刺激并得以生存具有重要的意義。本文介紹了生物被膜形成初期和發(fā)展過程中的物理性質以及相應的表征手段。其中，細菌的表面粘附由細菌的近界面運動行為及細菌與表面的相互作用決定，并對生物被膜的初期形成起關鍵的作用。此外，機械性能測試發(fā)現成熟的生物被膜可看作具備粘彈性的聚合物。

生物被膜，細菌粘附，物理性質

生物被膜是由吸附于固體表面或氣液界面的微生物相互粘附在一起，并嵌入其所分泌的胞外多聚物中而形成的固著微生物群落[1]。只要條件適宜，絕大多數細菌都可在各種表面形成生物被膜。細菌生物被膜幾乎涉及到我們人類生產和生活的各個方面。生物被膜的形成和發(fā)展過程中涉及到很多的物理學過程。因此，從物理學的視角對生物被膜進行研究，有助于我們對生物被膜的形成、發(fā)展以及組織結構有更加完整的認識和理解，為開發(fā)控制生物被膜的策略提供新的思路[2]。從生物被膜的形成過程來看，首先發(fā)生的是細菌在表面的粘附。在細菌附著到表面的過程中，涉及到兩個極為重要的物理性質，一是細菌在近界面附近的運動，二是細菌與表面之間的相互作用力。細菌的粘附決定了細菌生物被膜的形成以及后續(xù)的發(fā)展。當生物被膜初步形成并生長成熟，對其形態(tài)結構的表征以及機械性能的研究有助于我們從整體上把握生物被膜的形貌和機械穩(wěn)定性。本文將從細菌粘附過程、生物被膜的形態(tài)結構以及生物被膜的機械性能等三個方面對生物被膜進行論述，同時介紹相關的表征技術。

1 細菌的粘附及其表征

細菌粘附到表面是生物被膜形成的第一步，也是最為關鍵的一步。細菌和表面間存在著多種相互作用，其中，細菌在非生物表面的粘附主要通過非特異性相互作用，如疏水相互作用；而在活體或者衰亡的組織表面的粘附則主要通過特異性分子間的結合作用，如凝集素、配體、粘附素等[3]。細菌的粘附過程可以分為兩步：“?？俊?Docking)和“鎖定”(Locking)[4]?！巴？俊边^程主要是浮游細菌剛剛粘附至表面上，處于一個可逆的狀態(tài)，即細菌既可脫附也可繼續(xù)留在表面生長。這一過程可再細分為兩步。首先，浮游細菌被流體沖刷或者帶鞭毛的能動型細菌游走至界面附近幾十納米處；接下來，細菌需要克服細菌表面與可附著表面之間的排斥作用力，一般是靜電作用力，才可附著到表面。“鎖定”則是可逆附著的細菌通過分泌胞外多聚物將其自身牢牢地固著在表面上。之后，細菌開始增長繁殖，逐漸形成生物被膜。

1.1 細菌的近界面運動行為

從細菌粘附的過程可以得知，細菌在界面附近的運動行為對細菌的粘附起到非常關鍵的作用。有研究表明，細菌自身的運動行為會對生物被膜的形成以及其形態(tài)結構有顯著影響[5-6]。因此，研究近界面附近細菌的運動行為對我們了解細菌的粘附以及生物被膜的形成具有非常重要的意義。早在1972年，Henrichsen就利用了顯微照相機系統(tǒng)地觀察了40種細菌在表面上的運動行為，并歸納出了6種運動模式：游動(Swimming)、涌動(Swarming)、滑翔(Gliding)、蹭行(Twitching)、滑行(Sliding)和突進(Darting)[7]。隨著現代熒光標記和顯微鏡技術的發(fā)展，科學家們對細菌的運動行為進行了更為細致的研究。細菌采取的運動形式和細菌自身的運動器官如鞭毛、菌毛等有關，例如，游動主要是由于鞭毛的旋轉[8]，涌動依靠鞭毛和胞外分泌物[9]，而蹭行則來自于菌毛的釋放和收縮[10]。傳統(tǒng)的光學顯微技術可獲知細菌在二維聚焦平面上的運動行為，然而其丟失了縱向上不在聚焦面的行為信息。數字全息顯微技術(Digital holographic microscopy，DHM)是正在興起的三維成像技術，可以實時獲取物體的三維形貌以及空間位置等信息[11]。DHM具有對測試樣品無損傷、無需染色、高通量和定量化等優(yōu)點。利用此工具，我們課題組研究了大腸桿菌在不同性質的聚合物表面的粘附過程[12]，結果發(fā)現細菌尾部和表面碰撞是細菌在疏水性聚合物表面上粘附的主要誘因。

1.2 細菌與表面相互作用力的表征

當細菌靠近表面至50 nm左右時，細菌能否吸附到表面取決于細菌和表面之間的相互作用力。這些相互作用力與細菌和表面之間的距離有關，如圖1所示。當距離大于50 nm時，范德華力起主要作用；而當距離在10–20 nm之間時，范德華力和靜電作用力同時作用；在距離進一步減少至1.5 nm時，除了范德華力和靜電作用力，一些特異性相互作用也可能存在[13]。為研究這些相互作用如何影響著細菌的粘附過程，研究者們發(fā)展了許多技術方法去測量細菌或者相關的生物分子和表面之間的相互作用力，例如，流室實驗(Flow-chamber experiments)、表面力儀(Surface force apparatus)、生物膜力學探針(Biomembrane force probe)、光鑷和磁鑷(Optical and magnetic tweezers)、原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFM)[14]。AFM 具有納米級的分辨率和較寬的力測量范圍(5 pN–100 nN)，因此得到了非常廣泛的應用。它不僅可用于測量單個受體-配體結合的相互作用(約60–80 pN)，也能夠測量整個細菌和表面之間的相互作用(大于1 nN)[15]。

圖1 細菌與表面之間的作用力與距離之間的關系Fig.1 Interaction forces vs.distance between bacteria and surface.

AFM利用一根對力非常敏感的微懸臂去探測針尖與表面之間的相互作用力，進而獲得樣品表面的納米級形貌[16]。將單個細菌固定在微懸臂上制備成細菌探針，即可用于測量細菌與各種表面以及細菌與細菌之間的相互作用力，這就是所謂的單細胞力譜(Single-cell force spectroscopy，SCFS)(圖2)[17]。SCFS可以獲得細菌粘附過程中非特異性和特異性相互作用力的直接、定量的信息。Herman等研究了表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermindis表面的粘附素SdrG和血漿中的纖維蛋白原(Fibrinogen)之間的特異性相互作用[18]。他們發(fā)現，單個 SdrG-Fibrinogen之間結合作用力非常強，約為2 nN。表皮葡萄球菌在植入生物材料表面形成生物被膜的能力與這種極強的特異結合作用力高度有關，極強的結合作用有利于生物被膜抵抗來自其生長環(huán)境的剪切力。Alsteens等將表達了白色念珠菌粘附蛋白 Als5p的酵母細胞固定到無針尖探針上，然后利用SCFS測量了該蛋白與疏水表面之間的非特異性相互作用[19]。由于蛋白的疏水重復單元和疏水表面間的結合，他們測量得到較大的作用力(1.25 nN)和較長的斷裂長度(400 nm)。

圖2 單細胞力譜示意圖、細菌粘附測試的示意圖(A)和得到相應的力-距離曲線(B)[17]Fig.2 Demonstration of a single-cell force spectroscopy.Scheme of a cell-adhesion measurement(A)and the corresponding force-distance curve(B)[17].

2 生物被膜形態(tài)結構的表征

細菌粘附至表面后，開始分泌和積累胞外多聚物。附著的細菌開始增殖，浮游細菌也會繼續(xù)粘附到表面，最后形成的生物被膜具有非常復雜的三維結構。在大多數生物被膜中，胞外多聚物的質量占到生物被膜干質量的90%以上。胞外多聚物維持著生物被膜的機械穩(wěn)定性，能夠將細菌固定于生物被膜鄰近的區(qū)域中，便于細菌之間發(fā)生交流，形成協(xié)同的“細菌社會”[20]。人們對生物被膜的認識有賴于各種成像表征技術的發(fā)展。激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)是研究生物被膜結構最為常用的工具。利用特定的熒光分子作標記，CLSM可以在生物被膜的生長環(huán)境中對其形態(tài)結構實現原位和無損的觀察研究。Bridier等利用高通量的CLSM研究了60種條件致病菌形成的生物被膜的形態(tài)結構[21]。他們發(fā)現不同生物被膜之間的結構多樣性，例如綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa生物被膜的蘑菇狀結構，沙門氏菌Salmonella enteric生物被膜中存在的孔洞結構。高分辨率CLSM的出現使得追蹤細菌個體在生物被膜中空間分布及形態(tài)成為可能。Stewart等利用高分辨率CLSM研究了表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermis生物被膜在不同濃度的氯化鈉溶液中的結構變化[22]。結果表明，高鹽濃度會降低細菌在生物被膜中的密度。Drescher等利用高分辨率CLSM對霍亂弧菌Vibrio cholerae生物被膜中所有的細菌進行成像[23]。他們通過分析細菌在生物被膜中的空間位置、大小和取向來研究生物被膜在生長過程中的結構轉變，結果表明生物被膜的生長可以分為4個階段(圖3)。在第一階段，少數細菌粘附在表面形成高度有序的一維線狀結構；第二階段，吸附在表面上的細菌形成二維的菌落，而細菌在菌落中是無規(guī)排布的；第三階段，形成具有較低細菌密度(約為200–1000個細菌)的三維菌落；第四階段是形成細菌密度很高的菌落(大于2000個細菌)。

圖3 野生型霍亂弧菌生物被膜的不同生長階段[23]Fig.3 The different phases ofV.choleraewild-type biofilm growth[23].

除了CLSM外，掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope，SEM)、透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope，TEM)以及原子力顯微鏡(Atomic force microscope，AFM)也在生物被膜形態(tài)結構的研究中具有廣泛的應用。相比于CLSM，SEM、TEM和AFM具有更高的空間分辨率，可看到生物被膜中更為精細的結構。然而，利用SEM表征生物被膜樣品時，樣品需要經過固定、染色、干燥和噴涂導電涂層等制備過程，這些預處理過程可能都會改變生物被膜本來的結構。近年來出現的低溫場發(fā)射掃描電子顯微鏡(cryoFESEM)、可變壓掃描電子顯微鏡(VPSEM)和環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)可以在一定程度上保持生物被膜本來的結構狀態(tài)，因而在生物被膜的高分辨率成像中得到廣泛的應用[24-27]。TEM 可用于觀察生物被膜中的胞外多聚物。通過利用特定的染色劑對胞外多聚物進行染色，進而可以研究胞外多聚物的性質以及細菌和這些多聚物之間的結合方式[28-30]。

AFM 是空間分辨率可以達到納米級的成像工具，可以在空氣以及溶液環(huán)境下對樣品進行成像，在生物樣品的研究中具有非常重要的應用。AFM 可以在溶液狀態(tài)下直接對生物被膜進行原位成像，而不需要對其進行特別的處理，這樣可以最大程度保持生物被膜的結構完整性[31-33]。然而，AFM 也存在一些局限性，例如成像范圍較小。而且，在溶液中成像時，AFM 探針容易損傷軟的、凝膠狀的生物被膜。因此，有時候需要先將生物被膜干燥后，在空氣中對其進行成像進而獲得高分辨率的形貌圖。然而干燥過程也會改變生物被膜的形態(tài)結構，因此，在這種情況下得到的結果與真實情況有一定的偏離[34-35]。

3 生物被膜的機械性能及其表征

生物被膜在生長過程中會受到很多環(huán)境壓力，如海洋環(huán)境中的水壓、輸水管道的流體剪切力以及靜脈導管中的血液流動等[36]。生物被膜必須具有一定的機械穩(wěn)定性，才能在受到這些流體剪切力后不會像液體一樣流動。同時由于細菌需要生長繁殖，生物被膜也不會完全像固體一樣。研究表明，生物被膜可視為一種粘彈性的聚合物材料，即具有流體粘滯性和固體彈性的綜合性質[37]。研究生物被膜的機械性能是一個非常重要的科學和經濟問題。生物被膜的物理機械性能決定著生物被膜的形態(tài)和機械穩(wěn)定性，影響到生物被膜中的物質傳輸以及生物被膜的物理清除過程。

為了研究生物被膜的機械性能，研究者們除了使用平板剪切流變儀和平板壓縮實驗等常用方法外[38-39]，還采用了很多新穎的技術方法，例如，流動池方法(Flow cell method)[40-41]、微懸臂法(Micro-cantilever method)[42-43]、流體動力學測定(Fluid dynamic gauging)[44]、磁鑷(Magnetic tweezers)[45]以及原子力顯微鏡(AFM)[31,34,46-48]等。利用這些技術方法可以測量得到生物被膜的力-位移或應力-應變曲線、彈性模量、粘度、松弛時間、儲能和損耗模量、內聚能和粘附力等力學參數。

Shaw等利用平板流變儀研究了44種不同的生物被膜，包括在流變儀中原位培養(yǎng)的以及從自然界中收集回來的生物被膜[49]。盡管不同生物被膜的剪切模量和粘度差別很大，但是有趣的是，它們具有同樣的彈性松弛時間，約為18min(圖4)。松弛時間是生物被膜受到機械應力產生的可逆形變轉化為永久形變(即生物被膜遭到破壞)需要的時間。這一松弛時間(18min)和生物被膜生長過程中細菌的倍增時間具有同一量級，可能對于生物被膜的生存來說，這一時間尺度在生物被膜抵抗外應力時具有非常重要的意義。Lieleg等研究了生物被膜經過化學試劑處理后機械性能的變化[50]。他們發(fā)現，生物被膜中細菌的活性和生物被膜的機械穩(wěn)定性沒有必然的聯(lián)系，單純殺死細菌并不能將生物被膜從表面上清除。因此，一些可以降低生物被膜機械穩(wěn)定性的抗菌劑也許會有更好的效果。

圖4 44種生物被膜的有效剪切模量和有效粘度的關系曲線[49]Fig.4 Plot of effective shear modulus vs effective viscosity for44 tested biofilms[49].

AFM 除了可以對生物被膜進行高分辨率的成像外，在測量生物被膜機械性能方面也具有非常廣泛的應用。AFM 可以測量生物被膜的內聚能[46]、彈性模量[34,47]和粘附力[31,48]等性能。磁力調制原子力顯微鏡(Magnetic force modulation AFM，MF-AFM)的發(fā)展使得AFM可用于研究樣品的機械性能對擾動頻率的依賴性。MF-AFM利用一根磁性探針以一定的力壓進樣品表面一定的深度，然后通過一個外加磁場使得探針在設定的頻率范圍內振動，將探針振動的振幅和相位角測量出來后可用于計算樣品在不同頻率下的機械性能。我們課題組利用MF-AFM研究了大腸桿菌生物被膜在其生長過程中機械性能的變化，測量了距離生物被膜表面不同深度下的有效剛度(Effective stiffness)[51]。隨著培養(yǎng)時間的增長，生物被膜的結構變得越來越均勻。測量得到的有效剛度隨頻率的變化符合冪律規(guī)則，說明生物被膜的一些流變行為和軟玻璃態(tài)材料有著相似之處。

4 總結

在本文中，我們討論了細菌粘附、生物被膜組織結構和機械性能等方面的一些研究進展。浮游細菌粘附到表面是觸發(fā)生物被膜形成和發(fā)展的關鍵過程，對這一過程進行深入的研究分析是十分必要的。我們課題組搭建了三維數字全息顯微鏡(DHM)觀察細菌在界面附近的運動行為以及細菌與表面的碰撞過程，研究在生物被膜形成初期細菌的粘附機理。DHM實時的三維成像技術將會使其成為生物被膜研究中的重要工具。生物被膜可看作是一種非常復雜的粘彈性材料，研究生物被膜的結構和機械穩(wěn)定性對于了解它如何能在各種惡劣環(huán)境中生存和發(fā)展是十分重要的。為此，我們課題組搭建了磁力調制原子力顯微鏡(MF-AFM)對生物被膜的機械性能的研究。MF-AFM 兼具高分辨率成像和微流變表征的功能，在生物被膜結構以及機械性能的研究中具有非常廣闊的應用前景。

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(本文責編 郝麗芳)

Characterization of the physical properties of biofilms

Tiansheng Gan, and Xiangjun Gong
Faculty of Materials Science and Engineering,South China University ofTechnology,Guangzhou510640,Guangdong,China

It was known that bacteria adhere to surfaces and form sessile colonies called biofilms.Biofilms show potential applications for biodegradation and biocatalysis, whilst they also cause healthy and environmental problems.In particular, they lead to human infections and biofouling problems in industry.Physical properties of biofilms reflect the architecture and mechanical stability of biofilms that are highly related to their resistance to environmental challenges and their survival.In this article, we reviewed the physical properties involved in the development of biofilms and the related characterization techniques.The surface adhesion of bacteria plays a crucial role in the biofilm formation, which is determined by the motion of bacteria near a surface as well as the interaction between the bacteria and the surface.As far as the biofilms become mature, they behave like a polymer glassy material revealed by rheological measurements.

biofilm, surface adhesion, physical properties

February22,2017;Accepted:July27,2017

Xiangjun Gong.E-mail: msxjgong@scut.edu.cn

甘田生, 龔湘君.生物被膜的物理特性及其表征.生物工程學報,2017,33(9):1390–1398.

Gan TS, Gong XJ.Characterization of the physical properties of biofilms.Chin J Biotech,2017,33(9):1390–1398.

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.21404044,21574046).

國家自然科學基金(Nos.21404044，21574046)資助。

龔湘君 華南理工大學材料科學與工程學院副教授。本科畢業(yè)于中國科學技術大學物理系，博士畢業(yè)于香港中文大學物理系。此后轉入香港中文大學化學系從事博士后研究工作。研究興趣為設計基于光學、電磁學的高精度表征工具用于研究界面附近的生物物理現象。具體包括：1)發(fā)展基于三維實時追蹤的高精度光學表征技術；2)微生物在近界面的粘附行為；3)生物大分子和環(huán)境污染分子在近界面的動態(tài)行為；4)生物界面的粘彈性和相互作用。