陳 靜，何吉祥，黃 龍，吳本麗，孫和權(quán)，宋光同，陳貴生，王曉健

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽 合肥 230031；2. 安慶市西江水產(chǎn)養(yǎng)殖股份有限公司，安徽 安慶 246053；3. 安徽省巢湖市柘皋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，安徽 合肥 238000；4.安徽省合肥市長豐縣杜集鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，安徽 合肥 231100）

3個中華鱉群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星標(biāo)記分析

陳 靜1，何吉祥1，黃 龍1，吳本麗1，孫和權(quán)2，宋光同1，陳貴生3，王曉健4

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽 合肥 230031；2. 安慶市西江水產(chǎn)養(yǎng)殖股份有限公司，安徽 安慶 246053；3. 安徽省巢湖市柘皋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，安徽 合肥 238000；4.安徽省合肥市長豐縣杜集鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站，安徽 合肥 231100）

為了給武昌湖中華鱉的遺傳資源保護(hù)和利用提供較為準(zhǔn)確的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，對中華鱉武昌湖野生群體和2個養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果顯示：武昌湖鱉群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體的平均等位基因數(shù)（Na）分別為11.5、9.1、7.9，平均有效等位基因數(shù)（Ne）分別為6.3、3.7、3.1，平均觀測雜合度（Ho ）分別為 0.5667、0.5222、0.4462，平均期望雜合度（He）分別為0.6987、0.5953、0.5648，多態(tài)信息含量（PIC）分別為 0.6672、0.5551、0.5303，武昌湖群體遺傳多樣性較高?；贜ei’s遺傳距離和遺傳分化指數(shù)顯示，目前武昌湖群體中華鱉種質(zhì)資源保存較好。

中華鱉；武昌湖；熒光SSR；遺傳多樣性；遺傳分化

中華鱉（Pelodiscus sinensis）蛋白質(zhì)含量高，營養(yǎng)豐富，肉味鮮美，鱉甲、頭、肉、血、膽等均可入藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值，是食療滋補(bǔ)的上品［1］。中華鱉產(chǎn)量由1993年0.44萬t提高到2015年34.16萬t，一度成為集約化程度最高、養(yǎng)殖效益最好的產(chǎn)業(yè)之一，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中具有重要地位。

遺傳多樣性是物種生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提。一個居群或物種的遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)。了解物種的遺傳變異，有利于對其種質(zhì)資源管理保護(hù)和開發(fā)利用［2］。隨著中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，出現(xiàn)了種群混雜、種質(zhì)退化等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其遺傳多樣性。

武昌湖位于安徽省西南部安慶市望江縣東北部，湖泊水面廣闊、資源豐富，是重要的水產(chǎn)基地之一，在2008年被確定為中華鱉國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)，近年來采取了增殖、放養(yǎng)等措施保證野生中華鱉的數(shù)量。但由于缺乏管理措施和有效的鑒定手段，一些人工養(yǎng)殖的中華鱉混入武昌湖，兩者的基因發(fā)生一定程度的交流，破壞野生中華鱉完整遺傳信息的保留。劉陽等［2］、張至允等［3］對中華鱉的代表性群體黃河鱉、黃沙鱉、日本鱉、淮河鱉、洞庭湖鱉、鄱陽湖鱉、太湖鱉等群體進(jìn)行了遺傳變異的微衛(wèi)星分析，尚未見對中華鱉武昌湖群體的遺傳多樣性研究。本研究以養(yǎng)殖日本鱉群體和黃沙鱉群體為參照，采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)對武昌湖野生中華鱉進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期通過對武昌湖鱉的種質(zhì)鑒定了解其遺傳結(jié)構(gòu)特征，為其遺傳資源的保護(hù)和利用提供較為準(zhǔn)確的相關(guān)信息和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年5月6日，于武昌湖采集野生中華鱉30只，在安慶市西江水產(chǎn)養(yǎng)殖股份有限公司采集日本鱉30只和黃沙鱉31只，剪取少許裙邊，放在裝有酒精的EP管中，帶回實驗室于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的組織基因組提取試劑盒（DP304）提取基因組 DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后，用紫外分光光度計檢測DNA的純度和濃度，并稀釋至10 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星檢測 從劉陽等［2］、張志允等［3］、張群英等［4］公開發(fā)表的中華鱉微衛(wèi)星標(biāo)記中選取12個，由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成引物。各對引物的正向引物5′端分別帶有FAM（藍(lán)色）或HEX（綠色）的特異性熒光標(biāo)記用于測算擴(kuò)增目的條帶大小。

PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括模板DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）1.5 μL，dNTPs （10 mmol/μL）各0.3 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各 0.15 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL。PCR 反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 3 min；94℃ 30 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸3 min。

將10倍稀釋的PCR產(chǎn)物1.5 μL、ROX 500內(nèi)標(biāo)0.25 μL和超純?nèi)ルx子甲酰胺12.5 μL充分混勻后，95℃變性5 min，迅速冰浴3 min，置ABI 3700XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 用 Genographer 軟件根據(jù)分子量大小對擴(kuò)增結(jié)果讀帶，統(tǒng)計每個引物在不同個體中的擴(kuò)增情況。利用PopGene 32進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算各群體每個微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、群體間遺傳距離（Da）、遺傳分化指數(shù)（Fst）。利用Picalc程序包計算各引物的多態(tài)信息含量（PIC）?；贜ei’s遺傳距離利用MEGA 5軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星引物擴(kuò)增結(jié)果

供試的12對微衛(wèi)星引物特征和擴(kuò)增結(jié)果見表1。12個位點(diǎn)在3個中華鱉群體中表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性，共檢測到182個等位基因，其平均等位基因數(shù)（Na）、平均有效等位基因數(shù)（Ne）、平均觀測雜合度（Ho）、平均期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）分別為9.5、4.38、0.5116、0.6196、0.5842。

表1 12對微衛(wèi)星引物擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性分析

武昌湖鱉（WC）、日本鱉（RB）和黃沙鱉（HS）的遺傳多樣性參數(shù)見表2。3個群體平均等位基因數(shù)（Na）分別為11.5、9.08、7.92，平均有效等位基因數(shù)（Ne）分別為6.28、3.73、3.13，平均觀測雜合度（Ho）分別為0.5667、0.5222、0.4462，平均期望雜合度（He）分別為0.6987、0.5953、0.5648，多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.6672、0.5551、0.5303。

2.3 群體間的遺傳變異

3個中華鱉群體間的遺傳距離Da和遺傳分化指數(shù)Fst見表3。日本鱉群體和黃沙鱉群體遺傳距離最?。?.1417），武昌湖群體和黃沙鱉群體遺傳距離最大（0.4760），遺傳距離結(jié)果與Fst結(jié)果相符合。依據(jù)Nei’s遺傳距離構(gòu)建聚類圖，結(jié)果（圖1）表明，日本鱉群體和黃沙鱉群體首先聚為一支，然后再與武昌湖鱉群體聚為一支。

圖1 基于遺傳距離的3個中華鱉群體的UPGMA聚類圖

表2 3個中華鱉群體的遺傳多樣性參數(shù)

表3 3群體中華鱉的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)

2.4 Hardy-Weinberg 平衡分析

12個微衛(wèi)星位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗概率值P及遺傳偏離指數(shù)D值見表4。36個群體位點(diǎn)組合中（3群體×12位點(diǎn)），18個位點(diǎn)為顯著偏離，不符合Hardy-Weinberg平衡。36個群體位點(diǎn)組合中，25個群體位點(diǎn)組合D＞0，表現(xiàn)為雜合子過剩，其余11個群體位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子缺失（D＜0）。

表4 Hardy-Weinberg 平衡χ2 檢驗概率值（P）與遺傳偏離指數(shù)（D）

3 討論

3.1 熒光SSR分型更高效更準(zhǔn)確

微衛(wèi)星標(biāo)記是分布于真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs），也稱短串聯(lián)重復(fù)序列（simple tandem repeats，STRs）。因其在基因組中分布廣泛，具較高的多態(tài)性，呈共顯性遺傳等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)生物種群遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳圖譜建立和 QTL 定位等研究中［5-6］。傳統(tǒng)的SSR片段分離采用聚丙烯酰胺凝膠電泳加銀染或放射顯影的方法，費(fèi)時費(fèi)力且分辨率較低。本研究利用目前被廣泛采用的毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過熒光標(biāo)記的PCR引物擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)區(qū)域序列，利用ABI 遺傳分析儀對熒光標(biāo)記的DNA 片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，結(jié)合分子量內(nèi)標(biāo)計算DNA片段長度，使SSR分型更高效與準(zhǔn)確［7］。

3.2 中華鱉武昌湖群體遺傳多樣性較高

有效等位基因數(shù)（Ne）作為群體遺傳變異的一個測度，反映某座位等位基因頻率分布的均勻程度。各等位基因頻率分布越均勻，群體整齊度和群體遺傳一致性越高，遺傳多樣性就越低。本研究中武昌湖群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體平均有效等位基因數(shù)分別為6.28、3.73、3.13，武昌湖群體有效等位基因數(shù)比其他兩個群體略高，說明武昌湖群體遺傳多樣性高于日本鱉群體和黃沙鱉群體。

雜合度又稱為基因多樣度，一般被認(rèn)為是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)。就相同的分子標(biāo)記而言，群體平均雜合度的高低反映了群體的遺傳一致性程度［8］。若群體平均雜合度高于0.5，表明該群體未受到高強(qiáng)度的選擇，擁有豐富的遺傳多樣性；若群體平均雜合度低于0.5，表明該群體遺傳多樣性較低。該研究中，武昌湖群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體平均期望雜合度（He）分別為 0.6987、0.5953、0.5648，日本鱉群體和黃沙鱉群體略低于武昌湖群體，日本鱉群體和黃沙鱉群體長期人工養(yǎng)殖定向選育有關(guān)。張志允等［3］分析得出黃河鱉、淮河鱉、洞庭湖鱉、鄱陽湖鱉、太湖鱉的平均期望雜合度分別為 0.618、0.5515、0.5997、0.5904、0.5796；劉陽等［2］得出洞庭湖鱉、黃河鱉、黃沙鱉、日本鱉的平均期望雜合度分別為0.5194、0.5121、0.4955、0.4278。綜上比較而言，本研究中3個中華鱉群體的雜合度均具有較高水平，尤其是武昌湖鱉群體保持了較高的遺傳多樣性。

多態(tài)信息含量（PIC）是一個評價基因座位在群體中的多樣性程度的標(biāo)準(zhǔn)，平均PIC是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)。當(dāng)PIC＞0.5時，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.25＜PIC＜0.50時，為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)PIC＜0.25時，為低度多態(tài)位點(diǎn)［9］。該研究中武昌湖群體、日本鱉群體、黃沙鱉群體的PIC分別為0.6672、0.5551、0.5303，表明3個中華鱉群體的多態(tài)性屬于高度多態(tài)位點(diǎn)。張志允等［3］分析得出黃河鱉、淮河鱉、洞庭湖鱉、鄱陽湖鱉、太湖鱉的PIC分別為 0.5406、0.4872、0.5328、0.5206、0.5117；劉陽等［2］研究得出洞庭湖鱉、黃河鱉、黃沙鱉、日本鱉的PIC 分別為 0.456、0.423、0.43、0.402?？偟膩碚f，本研究中3個中華鱉群體的PIC值較高，遺傳多樣性較高。

3.3 3個中華鱉群體間的遺傳變異

群體間的遺傳關(guān)系一般表示為以等位基因頻率計算的2個群體之間的遺傳距離，2個群體之間的變異主要由分化時間的長短決定。Crawford 等［10］指出由微衛(wèi)星得出的遺傳距離更能反映分化時間的長短，群體間遺傳距離越小，表示群體間的分化時間越短，群體間的遺傳關(guān)系越近，群體間遺傳變異性越低，相似系數(shù)就越大。遺傳分化指數(shù)是檢測群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)之一［11］。本研究中，武昌湖鱉群體與日本鱉群體、黃沙鱉群體的遺傳距離分別為0.3522、0.4760，遺傳距離較大，同時遺傳分化指數(shù)也較大，說明武昌湖鱉和養(yǎng)殖的中華鱉遺傳分化程度較大，遺傳混雜少，種質(zhì)保存較好。

3.4 基因型分布偏離Hardy-Weinberg平衡的原因

本研究所檢測的36個位點(diǎn)當(dāng)中，有18個位點(diǎn)的基因型分布偏離了Hardy-Weinberg 平衡，25個位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子過剩，11 個位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子缺失，表明群體內(nèi)基因頻率發(fā)生了較大改變。雜合子過剩現(xiàn)象一般出現(xiàn)在研究對象為相對小的群體或者封閉群體中，即一個養(yǎng)殖群體中的子代群體是由有限的親本所產(chǎn)生，創(chuàng)造者效應(yīng)和瓶頸效應(yīng)會導(dǎo)致連鎖不平衡現(xiàn)象，而在一個大的穩(wěn)定群體中，連鎖不平衡現(xiàn)象幾乎為零［12］，而雜合子缺失則可能與自然選擇、種群內(nèi)交、無效等位基因和稀有等位基因丟失等原因有關(guān)［13］。本研究中，日本鱉和黃沙鱉兩個養(yǎng)殖群體經(jīng)過若干代閉鎖繁育和近親繁殖，導(dǎo)致雜合子過剩和缺失現(xiàn)象，而武昌湖野生群體，也出現(xiàn)連鎖不平衡現(xiàn)象，可能與種群近親繁殖或少許養(yǎng)殖中華鱉混入有關(guān)，一些位點(diǎn)隱性有害基因純合可致個體死亡，使純合子的頻率減少，雜合子的頻率增加，從而在某些位點(diǎn)上產(chǎn)生了雜合子過剩的現(xiàn)象，而如果有些位點(diǎn)的隱性純合子是存活的，這就增加了該位點(diǎn)純合子的頻率，減少了雜合子的頻率，從而在該位點(diǎn)上產(chǎn)生了雜合子缺失的現(xiàn)象。因此，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)武昌湖自然保護(hù)區(qū)的中華鱉保護(hù)，防止瓶頸效應(yīng)發(fā)生，保證其充足的親本數(shù)量和較高的遺傳多樣性。

［1］楊振才，牛翠娟，孫儒永. 中華鱉生物學(xué)研究進(jìn)展［J］. 動物學(xué)雜志，1999，34（6）：41-44.

［2］劉陽，史燕，朱新平，等. 中華鱉5個群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2012，31（2）：141-146.

［3］張志允，謝中富，李亞根，等. 中華鱉黃河群體選育F3與大陸代表性群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析［J］. 海洋漁業(yè)，2013，35（4）：439-447.

［4］張群英，黃鶴忠，袁文成，等. 中華鱉（Pelodiscus sinensis）EST-SSR標(biāo)記與生長性狀相關(guān)性分析［J］. 海洋與湖沼，2013，44（6）：1654-1660.

［5］Chauhan T，Rajiv K. Molecular markers and their applications in fisheries and aquaculture［J］.Adv Biosci Biotechnol，2010，1（4）：281-291.

［6］Bornman D M，Hester M E，Schuetter J M，et al.Short-read，high-throughput sequencing technology for STR gene typing［J］. Biotechniques，2012，4（1）：1-6.

［7］孫成飛，葉星，董浚鍵，等. 羅氏沼蝦6個養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析［J］.南方水產(chǎn)科學(xué)，2015，11（2）：20-26.

［8］榮敏，楊福合，邢秀梅，等. 利用微衛(wèi)星分析中國家兔的遺傳多樣性［J］.遺傳育種，2008，44（7）：1-5.

［9］Bostein D，Wllite R L，Skolnick M，et al .Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism（Argopecten irradians）［J］. The American Journal of Human Genetics，1980，32：314-331.

［10］Crawford A M，Littlepohn R P. The use of DNA marker indeciding conservation priorities in sheep and other livestock［J］. Animal Genetic Resources Information，1998，23：21-26.

［11］曾滔，趙福平，王光凱，等. 基于群體分化指數(shù)FST的綿羊全基因組選擇信號檢測［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2013，44（12）：1891-1899.

［12］Sved J A. The stability of linked systems of loci with a small population size［J］. Genetics，1968，59：543-563.

［13］Suci A，Uthairat N N，Worawut K. Study of genetic diversity of orange spotted grouper，Epinephelus coioides，from Thailand and Indonesia using microsatellite markers［J］.Marine Biotechnology，2005，8（1）：1-10.

Microsatellite marker analysis of genetic diversity in three populations of Trionyx sinensis

CHEN Jing1，HE Ji-xiang1，HUANG Long1，WU Ben-li1，SUN He-quan2，SONG Guang-tong1，CHEN Gui-sheng3，WANG Xiao-jian4
（1. Fishery Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China；2. Anqing Xijiang Fishery Limited Corporation，Anqing 246053，China；3. Agricultural Comprehensive Service Station of Zhegao Town，Chaohu City，Anhui Province，Hefei 238000，China；4. Agricultural Comprehensive Service Station of Duji Countyside，Changfeng County，Hefei City，Anhui Province，Hefei 231100，China）

To provide more accurate basic data for the genetic resources ofTrionyx sinensisof Wuchang lake，and protect and utilize their germplasm resources，microsatellite marker technology was used to analyze the genetic diversity ofT. sinensisfrom wild population of Wuchang lake and two breeding populations as experimental objects. The results showed that the average number of alleles（ Na）for the three populations were 11.5，9.1 and 7.9 respectively，average effective numbers of alleles（ Ne） were 6.3，3.7 and 3.1 respectively，average observed heterozygosity （ Ho） were 0.5667，0.5222 and 0.4462 respectively，average expected heterozygosity（ He） were 0.6987，0.5953 and 0.5648 respectively and the average polymorphism information content（ PIC） were 0.6672，0.5551 and 0.5303 respectively，the genetic diversity of Wuchang Lake population was higher，the Nei’s genetic distance and genetic differentiation showed that the germplasm resources preservation of Wuchang Lake population was better now.

Trionyx sinensis；Wuchang Lake；fluorescent SSR marker；genetic diversity；genetic differentiation

S917.4

A

1004-874X（2017）07-0141-06

陳靜，何吉祥，黃龍，等.3個中華鱉群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星標(biāo)記分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（7）：141-146.

2017-05-02

安徽省科技攻關(guān)項目（1604a0702018）；安慶市科技計劃項目；安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院成果推廣項目（16E0505）；安徽省水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系( 皖農(nóng)科［2016］84號)

陳靜（1985-）, 女, 碩士, 助理研究員, E-mail: chenjingok5@163.com

何吉祥（1975-）, 男, 碩士, 副研究員, E-mail: hejixiang813@126.com

（責(zé)任編輯 崔建勛）