權(quán)婭茹，陳 震，邱 平，崔曉雨，李長貴，袁力勇

中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所呼吸道病毒疫苗室，北京 100050

·論著·

國產(chǎn)水痘減毒活疫苗關(guān)鍵基因的序列分析和比較

權(quán)婭茹，陳 震，邱 平，崔曉雨，李長貴，袁力勇

中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所呼吸道病毒疫苗室，北京 100050

目的從基因水平分析國產(chǎn)水痘減毒活疫苗的安全性和一致性。方法對國內(nèi)4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗的關(guān)鍵基因(ORF38、ORF54和ORF62)進行PCR擴增和序列測定，并與Genbank公布的Dumas、P-Oka、V-Oka及國外上市疫苗Varilrix(GSK)、Varivax(Merck)的序列進行比對。結(jié)果4家國產(chǎn)水痘減毒活疫苗的ORF38和ORF54區(qū)基因序列一致，并且同V-Oka、Varilrix完全一致，與Varivax(Merck)有1處差異。4家國產(chǎn)水痘減毒活疫苗的ORF62區(qū)基因序列基本一致，與V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)均存在個別核苷酸差異。結(jié)論4家國產(chǎn)水痘減毒活疫苗的ORF38、ORF54和ORF62區(qū)基因序列基本一致，穩(wěn)定性較好，與V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)存在較小差異，沒有引入新的突變位點。

水痘疫苗；基因變異；ORF38；ORF54；ORF62

水痘是由水痘-帶狀皰疹病毒引起的一種高度傳染病，常見于兒童。接種水痘疫苗是預(yù)防和控制水痘發(fā)生的最有效手段。Oka水痘病毒株(V-Oka)是世界衛(wèi)生組織認可的唯一可用于水痘疫苗生產(chǎn)的減毒株，也是我國水痘減毒活疫苗的生產(chǎn)用毒株[1- 2]。V-Oka是將典型水痘患者皰疹液中分離得到的親本野毒型Oka株(P-Oka)分別在人胚肺成纖維細胞、豚鼠胚胎成纖維細胞、人成纖維細胞株(WI- 38、MRC- 5)中多次傳代獲得，為未經(jīng)純化的混合株，在基因組中存在著多個混合位點[3- 4]。企業(yè)在生產(chǎn)水痘疫苗時因采用的毒種代次、傳代用細胞基質(zhì)等不同，疫苗成品的基因序列會存在差異[2，5]。研究顯示，這種序列差異可能和水痘減毒活疫苗的毒力和其誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)有關(guān)[6- 7]。ORF38、ORF54和ORF62是流行病學(xué)和疫苗學(xué)分析常用的3個區(qū)域，因此，本研究對國內(nèi)4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗樣本進行了ORF38、ORF54和ORF62區(qū)的基因序列測定，并與Dumas(NC001348)、P-Oka(AB097933)、V-Oka(AB097932)、英國葛蘭素史克(GSK)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗(Varilrix)和美國默克(Merck)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗(Varivax)基因序列進行了比對，從而確定我國國內(nèi)4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗在這3個編碼區(qū)的基因變異情況。

材料和方法

材料和試劑A、B、C、D 4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗各1批，批號分別為201510031- 2、201510036- 1、201511073- 2和201602007。DNA提取試劑盒為德國QIAGEN公司的DNeasy?Blood & Tissue kit，核酸擴增為BioLabs的Q5熱啟動超保真2×Master Mix，DL2000 DNA分子量標準購自中國Takara公司。

引物及合成根據(jù)GenBank公布的VZV Dumas株(NC001348)基因序列設(shè)計引物，ORF38分3段擴增，ORF54分6段擴增，ORF62分9段擴增，共18對引物(表1)，委托英濰捷基公司合成。

基因組DNA提取每批水痘減毒活疫苗取4瓶，分別用0.5 ml注射用水溶解，合并混勻后按照DNA提取試劑盒說明書提取水痘病毒基因組DNA。

目的DNA片段擴增及分析以提取的DNA為模板進行PCR擴增。25 μl反應(yīng)體系：2 μl模板DNA，上下游引物(20 μmol/L)各1 μl，12.5 μl 2×Master Mix，8.5 μl去離子水。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，委托天一輝遠(北京)生物科技有限公司進行DNA序列測定。

表 1 PCR引物Table 1 PCR primers used in the analysis

以上引物用NCBI網(wǎng)站的primer-BLAST軟件自行設(shè)計

The above primers were designed by primer-BLAST software of the NCBI website

結(jié) 果

目的基因擴增產(chǎn)物鑒定1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗均可擴增出18條特異性條帶，大小與預(yù)期相符。以A企業(yè)的水痘減毒活疫苗為例，結(jié)果見圖1。

ORF38基因序列分析ORF38全基因序列測定和分析結(jié)果表明：國內(nèi)不同企業(yè)的水痘減毒活疫苗，其ORF38的核苷酸和氨基酸序列完全一致，并且與GenBbank公布的p-OKA、V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)同源性100%。與野生型Dumas相比，僅有2個位點的堿基發(fā)生突變，即69349位點由A突變?yōu)門，69756位點由T突變?yōu)镃。前者為沉默突變，但使疫苗株P(guān)stⅠ酶切位點消失，后者則使氨基酸發(fā)生突變，由絲氨酸(S)突變?yōu)楦拾彼?G)(圖2、3)。

ORF54基因序列分析與ORF38相似，國內(nèi)4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗ORF54基因序列完全一致，并且與GenBank公布的V-Oka和Varilrix序列同源性100%，與Varivax有1個堿基的差異，即國產(chǎn)水痘減毒活疫苗在94167位點是單堿基C，而Varivax是T/C同時存在，但未引起氨基酸突變。國產(chǎn)水痘疫苗株在ORF54與Dumas有6個堿基的差異(圖2、3)，其中95241位由野生型毒株的T突變?yōu)镃，95601由T突變?yōu)镚，前者未引起氨基酸變異，但導(dǎo)致疫苗株增加了1個BglⅠ酶切位點，后者則使谷氨酸(E)突變?yōu)樘於彼?D)。

M：DNA分子量標記；1：ORF381產(chǎn)物；2：ORF382產(chǎn)物；3：ORF383產(chǎn)物；4：ORF541產(chǎn)物；5：ORF542產(chǎn)物；6：ORF543產(chǎn)物；7：ORF544產(chǎn)物；8：ORF545產(chǎn)物；9：ORF546產(chǎn)物；10：ORF621產(chǎn)物；11：ORF622產(chǎn)物；12：ORF623產(chǎn)物；13：ORF624產(chǎn)物；14：ORF625產(chǎn)物；15：ORF626產(chǎn)物；16：ORF627產(chǎn)物；17：ORF628產(chǎn)物；18：ORF629產(chǎn)物

M：DNA Marker DL2000；1：product of ORF381；2：product of ORF382；3：product of ORF383；4：product of ORF541；5：product of ORF542；6：product of ORF543；7：product of ORF544；8：product of ORF545；9：product of ORF546；10：product of ORF621；11：product of ORF622；12：product of ORF623；13：product of ORF624；14：product of ORF625；15：product of ORF626；16：product of 627；17：product of ORF628；18：product of ORF629

圖1 水痘減毒活疫苗ORF38、ORF54和ORF62擴增結(jié)果(A企業(yè)水痘減毒活疫苗)

Fig1 Amplification results of ORF38，ORF54，and ORF62 sequences of a live attenuated varicella vaccine (live attenuated varicella vaccine produced in A company)

a：Tillieux SL et al，2008

圖2 不同來源的水痘毒株ORF38和54核苷酸序列比較

Fig2 Comparison of nucleotide sequences of ORF38 and 54 of varicella virus from different sources

a：Tillieux SL et al，2008

圖3 不同來源的水痘毒株ORF38和54氨基酸序列比較

Fig3 Comparison of amid acid sequences of ORF38 and 54 of varicella virus from different sources

ORF62基因序列分析序列測定結(jié)果顯示，與Dumes株和P-OKA株相比，疫苗株在ORF62突變較多，但國內(nèi)4家企業(yè)的水痘減毒活疫苗基因序列基本一致，與Genbank公布的V-Oka、Varilrix、Varivax序列存在個別核苷酸差異。4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗、V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)的ORF62基因序列同Dumas相比，均有20個突變位點。B企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗在其中一些突變位點以野毒型和減毒型堿基共存，同V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)。而A、C和D 3家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗在這20個位點均以一種堿基存在。其中，106262、107136和107252位點突變分別在4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗中引入了SmaⅠ、BssHⅡ和NaeⅠ酶切位點。另外，20個突變位點中10個位點的堿基突變導(dǎo)致了氨基酸的突變，其余10個位點為沉默突變(圖4、5)。

a：Tillieux SL et al，2008

圖4 不同來源的水痘毒株ORF62核苷酸序列比較

Fig4 Comparison of nucleotide sequences of ORF62 of varicella virus from different sources

a：Tillieux SL et al，2008

圖5 不同來源的水痘毒株ORF62氨基酸序列比較

Fig5 Comparison of amid acid sequences of ORF62 of varicella virus from different sources

討 論

水痘減毒活疫苗V-OKA株是由日本科學(xué)家在20世紀70年代獲得的疫苗株病毒，用其生產(chǎn)的疫苗為接種者提供了持續(xù)性保護，顯著降低了水痘病毒的感染率。目前，國內(nèi)外上市的水痘疫苗均是由V-Oka制備的，包括Merck生產(chǎn)的Varivax、GSK生產(chǎn)的Varilrix和我國4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗。V-Oka是通過將P-Oka在組織細胞中系列傳代來減毒的，未克隆化，加上不同企業(yè)使用的病毒代次不同、細胞基質(zhì)(包括人二倍體細胞MRC- 5和2BS)和生產(chǎn)工藝也有差異，這使得不同企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗基因也存在差異。為了考察我國企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗中病毒基因的變異情況，本研究對4家國產(chǎn)水痘減毒活疫苗中的ORF38、54和62區(qū)基因進行了序列測定和分析。

ORF38、ORF54、ORF62是水痘減毒活疫苗監(jiān)測和流行病學(xué)研究選用的3個基因區(qū)域，并被用來區(qū)分水痘病毒野毒株和疫苗株。研究顯示，4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗的ORF38、54區(qū)基因序列完全相同，并且與V-Oka和Varilrix(GSK)序列保持一致，與Varivax(Merck)在ORF54區(qū)有1處差異。A、C和D企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗的ORF62區(qū)序列完全相同，與B企業(yè)有2處差異，與V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)也均有幾處差異，但沒有引入新的突變位點。

ORF38區(qū)的69349(PstⅠ)、ORF54區(qū)的95241(BglⅠ)和ORF62區(qū)的106262(SmaⅠ)、107136(BssHⅡ)、107252(NaeⅠ)是區(qū)分水痘病毒野毒株和疫苗株常用酶切位點[8- 13]。本研究顯示我國4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗在這5個位置均出現(xiàn)突變，產(chǎn)生了疫苗株特有的SmaⅠ、BssHⅡ、NaeⅠ和BglⅠ酶切位點，缺失了野毒株特有的PstⅠ酶切位點。結(jié)果同V-Oka和Varilrix(GSK)相吻合，Varivax(Merck)在107136位點以T/C混合堿基存在，未產(chǎn)生疫苗株特有的BssHⅡ酶切位點。

V-Oka全基因組中1/3以上堿基突變落在ORF62區(qū)域，ORF62編碼即刻早期蛋白(IE62)，IE62是水痘病毒的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，直接參與病毒復(fù)制。研究顯示ORF62在V-Oka減毒過程中可能起著關(guān)鍵的作用[14- 20]。Gomi等[16]發(fā)現(xiàn)ORF62區(qū)中105310、105356、105544、106262、107252、107599、107797和108838位點堿基突變導(dǎo)致的氨基酸突變可阻礙水痘病毒自身復(fù)制和在感染細胞中的擴散。Quinlivan等[6]發(fā)現(xiàn)水痘疫苗中37個SNP位點中的4個最可能和皮疹爆發(fā)有關(guān)，分別為ORF51區(qū)的89734、105169，ORF62區(qū)的105356和107797。本研究顯示，我國4家企業(yè)生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗在105310、105356、105544、106262、107252和107599位點均發(fā)生了堿基突變和由其導(dǎo)致的氨基酸突變，同V-Oka和Varilrix(GSK)一致，Varivax(Merck)在107599位點以野毒型堿基存在；在108838位點未發(fā)生堿基突變，以野毒型堿基A存在，而V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)以A/G存在。107797位點在本研究中并未被確認為SNP位點，同Tillieux等[5]和Gomi等[16]報道的一致。

綜上，本研究結(jié)果顯示，我國4家企業(yè)雖然用毒株代次、細胞基質(zhì)和生產(chǎn)工藝不同，但生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗的ORF38、54、62區(qū)基因序列基本一致，與V-Oka、Varilrix(GSK)和Varivax(Merck)基因突變位點一致，沒有引入新的突變位點，說明國產(chǎn)水痘減毒活疫苗的ORF38、54、62區(qū)基因序列穩(wěn)定性很好。

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SequenceAnalysisandComparisonoftheKeyGenesofDomesticLiveAttenuatedVaricellaVaccine

QUAN Yaru，CHEN Zhen，QIU Ping，CUI Xiaoyu，LI Changgui，YUAN Liyong

Division of Respiratory Virus Vaccines，Institute for Biological Product Control，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China

YUAN Liyong Tel：010- 67095423，E-mail：yuanly@nifdc.org.cn

ObjectiveTo analyze the safety and consistency of domestic live attenuated varicella vaccines (LAVVs) at gene level.MethodsThe key genes (ORF38，ORF54，and ORF62) of LAVVs produced by four Chinese manufacturers were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and sequenced.The sequencing results were compared with the sequences of Dumas，P-Oka，and V-Oka strains in GenBank and with the sequences of Varilrix (GSK) and Varivax (Merck).ResultsThe ORF38 and ORF54 gene sequences of four domestic LAVVs were the same as each other and completely consistent with the sequences of V-Oka and Varilrix；however，it was different from Varivax (Merck) at one site.The ORF62 gene sequences of four domestic LAVVs were similar，and had individual nucleotide differences with V-Oka，Varilrix(GSK)，and Varivax (Merck).ConclusionsThe sequences of ORF38，ORF54，and ORF62 of four domestic LAVVs are almost the same，showing good stability.They have small differences with V-Oka，Varilrix(GSK)，and Varivax (Merck)，without introducing new mutations.

varicella vaccine；gene mutation；ORF38；ORF54；ORF62

袁力勇 電話：010- 67095423，電子郵件：yuanly@nifdc.org.cn

R373.1+1

A

1000- 503X(2017)05- 0637- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.05.007

ActaAcadMedSin，2017,39(5)：637-642

2016- 12- 01)