江蕾微 劉志 盧彬 周文明 李遠英 陸洪光

550004貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

·論著·

人羊膜上皮細胞復(fù)合去表皮的真皮構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)裸鼠皮膚缺損的實驗研究

江蕾微 劉志 盧彬 周文明 李遠英 陸洪光

550004貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

目的探索由人羊膜上皮細胞（hAEC）、成纖維細胞與去表皮的真皮（DED）構(gòu)建組織工程皮膚修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損的可行性。方法采用低濃度胰蛋白酶多步消化分離法提取hAEC，并用兩步酶消化法處理健康小兒包皮，獲得成纖維細胞懸液，傳代培養(yǎng)。將體外擴增培養(yǎng)至第3～5代的成纖維細胞和第2代hAEC分別接種在DED真皮面和基底膜面，體外器官培養(yǎng)構(gòu)建組織工程皮膚。取3～4周齡健康雄性裸鼠20只，抽簽法隨機分為2組，在所有小鼠背部正中制備全層皮膚缺損模型。組織工程組用構(gòu)建的組織工程全層皮膚覆蓋創(chuàng)面；對照組創(chuàng)面僅覆蓋凡士林油紗。分別于術(shù)后第7、14、21、28天對裸鼠全身及移植部位大體觀察，比較兩組間創(chuàng)面愈合時間及創(chuàng)面愈合率，并對移植部位行組織學(xué)觀察。結(jié)果hAEC具有干細胞特征，免疫熒光顯示其表達結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT?4）、階段特異性胚胎抗原4（SSEA?4）。器官培養(yǎng)2周后，體外構(gòu)建的組織工程皮膚形成4～9層復(fù)層表皮，且表皮的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)與正常皮膚類似。移植組織工程皮膚至裸鼠創(chuàng)面后肉眼觀察顯示，在移植后第7、14、21天，組織工程組創(chuàng)面愈合率分別為57.49%±6.11%、92.80%±3.10%、98.83%±0.25%，均明顯高于對照組（22.93%±4.26%、54.57%±7.94%、91.16%±4.79%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（n=10，t值分別為27.36、32.23、11.80，均P＜ 0.001），組織工程組創(chuàng)面愈合時間［（21.51± 1.51）d］明顯短于對照組［（28.80± 1.14）d］（n=10，t=42.23，P＜ 0.001），且在移植后第28天移植物顏色與自體皮膚顏色接近。組織學(xué)觀察顯示，組織工程組上皮層次清晰，角化明顯，真皮層細胞生長良好；對照組移植區(qū)上皮較薄且有部分缺損，真皮層次欠佳，且可見炎癥細胞浸潤。結(jié)論用hAEC、成纖維細胞復(fù)合DED構(gòu)建的組織工程皮膚移植后能在裸鼠體內(nèi)存活，且創(chuàng)面愈合更佳，可望成為一種較理想的組織工程皮膚。

組織工程；上皮細胞；真皮；皮膚移植；傷口愈合；去表皮真皮；人羊膜上皮細胞

應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建人工皮膚是解決大面積皮膚缺損患者自體皮膚移植時供皮膚不足問題的最有效的途徑之一。因干細胞來源的組織工程皮膚可以不斷自我更新和增殖，取得不錯的修復(fù)效果，很多學(xué)者已應(yīng)用干細胞作為種子細胞來構(gòu)建組織工程皮膚［1］。但這些干細胞的應(yīng)用都存在一定限制，如來源、數(shù)量、取材創(chuàng)傷等都制約著它的發(fā)展。人羊膜上皮細胞（hAEC）是在受精后第8天從外胚葉發(fā)育而來，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細胞的可塑性。故具有一定的三胚層分化潛能。在一定條件下，hAEC不表達 HLA?A、B、C或DR抗原，一般認為無免疫原性，移植后幾乎不引起排斥反應(yīng)。hAEC易于分離培養(yǎng)，可在體外大量擴增，且具有干細胞的特性，是一種較為理想的組織工程皮膚種子細胞。我們曾報道用人去表皮的真皮（de?epidermized dermis，DED）體外構(gòu)建組織工程皮膚［2］。DED為富含膠原的三維結(jié)構(gòu)，保留Ⅳ型膠原、板層素等基底膜成分，可誘導(dǎo)種子細胞的發(fā)育和分化，在體外皮膚重建中具有較高的應(yīng)用價值［3］。我們構(gòu)建hAEC?DED全層組織工程皮膚，并把構(gòu)建好的組織工程皮膚移植于裸鼠創(chuàng)面，從創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面愈合時間、組織病理學(xué)等方面評估組織工程皮膚的效果，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

低糖型DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco生物公司），胎牛血清（美國Hyclone生物公司），表皮生長因子（EGF，美國PeproTech生物公司），波形蛋白抗體（Denmark生物公司），結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3/4抗體（Oct?3/4抗體）、階段特異性胚胎抗原-4抗體（SSEA?4抗體）（美國SantaCruz生物公司）。

二、實驗方法

1.hAEC分離培養(yǎng)及生物學(xué)特征檢測：羊膜組織來自貴州醫(yī)科大學(xué)產(chǎn)科健康孕婦剖宮產(chǎn)足月胎兒的新鮮胎盤（患者知情同意），機械剝離胎盤羊膜組織，盡量使羊膜完整。采用低濃度胰蛋白酶多步消化分離法提取hAEC。將羊膜組織用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗后剪成細碎小塊，加入0.05%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，37℃消化10 min，棄消化液以去除雜細胞和細胞碎片。重復(fù)上述方法消化上皮細胞，37℃消化30～40 min，200目不銹鋼網(wǎng)過濾。收集單細胞懸液，加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。過濾后組織碎片用同樣方法重復(fù)消化1次。離心收集的細胞用添加10 μg/L EGF的L?DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后首次換液，此后每3天全量換液1次，約10 d后按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)細胞。第2代hAEC爬片后用4%多聚甲醛固定，分別行Oct?3/4、SSEA?4免疫熒光檢測。

2.成纖維細胞（FB）的分離培養(yǎng)及鑒定：取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科3～15歲健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的正常包皮（患者家屬知情同意）組織，分離FB。FB培養(yǎng)方法同文獻［4］。取第5代FB進行細胞爬片，4%多聚甲醛固定后行波形蛋白染色。

3.DED的制備及預(yù)處理：實驗方法同文獻［5］。

4.組織工程皮膚構(gòu)建及組織學(xué)特征分析：將經(jīng)預(yù)處理的DED置于6孔板中，DED基底膜面向下，加入hAEC完全培養(yǎng)基（1 ml/孔），用移液器將備好的FB懸液150 μl接種于第1～5孔的DED上，第6孔中DED上加150 μl PBS作為空白對照。置于5%CO2、37℃環(huán)境中孵育過夜。然后，把DED翻轉(zhuǎn)，使DED的基底膜面朝上，將備好的hAEC細胞懸液150 μl接種于第1～5孔的DED基底膜面上，第6孔中加入150 μl PBS作為空白對照，每孔再加入hAEC完全培養(yǎng)基浸沒DED，置于5%CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)。液下培養(yǎng)3 d，使hAEC達到融合，再將DED置于支撐架上，調(diào)整培養(yǎng)基的量，使hAEC在氣液界面上生長，5%CO2、37℃環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)2周。將構(gòu)建的組織工程皮膚行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色。

5.實驗動物選擇及分組：20只健康雄性BALB/C裸鼠（上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司）作為受體，動物合格證號 SCXK（滬）2006?0007，3～ 4周齡，體重17～25 g。所有實驗用裸鼠均在貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF條件下飼養(yǎng)。使用前檢查有無皮膚疾患。用抽簽法隨機分為2組，即組織工程組和空白對照組，每組10只。

6.實驗動物皮膚缺損模型的建立及植皮：以5%水合氯醛0.01 ml/g腹腔注射，3～5 min后裸鼠進入麻醉狀態(tài)。待裸鼠麻醉后將其固定，常規(guī)用乙醇及聚維酮碘消毒裸鼠背部皮膚，鋪洞巾。以裸鼠背部正中為中心點，用眼科剪剪成直徑約1 cm的圓形缺損，去除該處全層皮膚后，用青鏈霉素混合液清洗傷口，立即用構(gòu)建的組織工程皮膚覆蓋組織工程組裸鼠缺損處創(chuàng)面，空白對照組先不覆蓋，后均立即用凡士林油紗布覆蓋創(chuàng)面，打包縫合創(chuàng)面并稍加壓包扎。每只分籠飼養(yǎng)。術(shù)后1周拆除紗布包并揭去油紗，常規(guī)換藥，連續(xù)觀察4周。

7.術(shù)后創(chuàng)面愈合情況觀察及組織學(xué)檢測：術(shù)后分別于第1、2、3、4周肉眼觀察記錄兩組創(chuàng)面愈合時間。用透明薄膜法［6］計算兩組的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。于術(shù)后4周在裸鼠背部術(shù)區(qū)取材，4%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。

8.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細胞培養(yǎng)及鑒定

1.原代培養(yǎng)的hAEC形態(tài)及特征：原代hAEC呈扁平多角形，核/質(zhì)比例小，胞核呈圓形、卵圓形，約6～8 d形成單層，細胞融合成片呈鋪路石樣（圖1A）。免疫熒光示Oct?4、SSEA?4陽性，且主要表達在高細胞密度區(qū)、小克隆區(qū)或球體結(jié)構(gòu)區(qū)，在hAEC比較稀疏的區(qū)域幾乎無表達（圖1）。

2.原代培養(yǎng)的FB形態(tài)及特征：原代培養(yǎng)的FB細胞呈長梭形，多角形或不規(guī)則形，2～3 d即呈匯合狀態(tài)，密度低時細胞之間排列疏松，有較大細胞間隙，細胞密度高時，細胞相互平行排列或呈放射狀和漩渦狀排列（圖2）。FB特異性標志蛋白波形蛋白染色陽性，胞質(zhì)內(nèi)見大量棕褐色顆粒，核為藍色。

圖1 人羊膜上皮細胞（hAEC）鑒定1A：hAEC呈鋪路石樣生長（倒置顯微鏡×100）；1B：免疫熒光示第2代hAEC細胞核表達Oct?4蛋白（綠色熒光），且主要在高細胞密度區(qū)表達（×40）；1C：DAPI染色對圖1B進行細胞核定位（×40）；1D：免疫熒光示第2代hAEC在細胞表面表達SSEA?4蛋白（綠色熒光），且主要在細胞克隆區(qū)或球體結(jié)構(gòu)區(qū)表達（×40）；1E：DAPI染色對圖1D進行細胞核定位（× 40）

二、體外重建組織工程皮膚肉眼及組織學(xué)觀察

組織工程皮膚體外氣-液面培養(yǎng)2周后觀察，DED表面光滑，上有膜狀物形成（圖3A）。組織學(xué)觀察可見DED上有4～9層完整的新生表皮結(jié)構(gòu)。新生表皮結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，角質(zhì)層角化完全，細胞排列整齊。表皮與DED交錯，表皮突呈高低不平的乳頭狀伸入真皮（圖3B）。

表1 兩組小鼠創(chuàng)面愈合率和愈合時間比較（±s）

表1 兩組小鼠創(chuàng)面愈合率和愈合時間比較（±s）

組別n 創(chuàng)面愈合率（%）組織工程組對照組t值P值10 10移植后7 d 57.49±6.11 22.93±4.26 27.36＜0.001移植后21 d 98.83±0.25 91.16±4.79 11.80＜0.001移植后14 d 92.80±3.10 54.57±7.94 32.23＜0.001創(chuàng)面愈合時間（d）21.51±1.51 28.80±1.14 42.23＜0.001

三、移植術(shù)后動物傷口及存活情況

所有的裸鼠術(shù)后均存活，且未出現(xiàn)感染、化膿、體液滲出等不良反應(yīng)。

四、動物創(chuàng)面愈合情況

見表1。移植后7 d肉眼觀察到組織工程皮膚組移植的hAEC?DED全層皮膚與自體皮膚能較好地融合，沒有觀察到組織排異現(xiàn)象，且創(chuàng)面較前明顯收縮。移植后第14天肉眼觀察，組織工程組創(chuàng)面愈合明顯優(yōu)于對照組，移植物顏色與自體皮膚顏色接近。移植后第21天后，組織工程組創(chuàng)面基本愈合，對照組有部分未愈合的傷口。見圖4。移植4周后，肉眼觀兩組創(chuàng)面均達到完全愈合。移植后第28天組織工程組上皮層次清晰，角化明顯，真皮層細胞生長良好（圖5A）?？瞻讓φ战M移植區(qū)上皮較薄且有部分缺損，真皮層次欠佳，且可見炎癥細胞浸潤（圖5B）。移植后第7天、14天、21天組織工程組創(chuàng)面愈合率明顯高于對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；組織工程組創(chuàng)面愈合時間明顯短于對照組，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 原代培養(yǎng)的成纖維細胞（FB）形態(tài)及特征（倒置顯微鏡×100） FB呈長梭形，多角形或不規(guī)則形

圖3 體外重建組織工程皮膚肉眼觀及組織學(xué)特征 3A：肉眼觀去表皮真皮（DED）表面光滑，上有膜狀物形成；3B：培養(yǎng)2周后組織學(xué)觀察示DED上有4～9層完整的新生表皮，結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，角質(zhì)層角化完全，細胞排列整齊。表皮與DED犬牙交錯，表皮突呈高低不平的乳頭狀伸入真皮（HE×100）

圖4 裸鼠創(chuàng)面愈合情況 移植后第14天，組織工程組移植的組織工程皮膚與自體皮膚能較好地融合，移植物顏色與自體皮膚顏色接近，且其創(chuàng)面愈合明顯優(yōu)于對照組；移植后第21天，組織工程組創(chuàng)面基本愈合，對照組有部分未愈合傷口

圖5 裸鼠背部皮膚移植28 d后組織學(xué)觀察（HE×40） 5A：組織工程組移植后上皮層次清晰，角化明顯，真皮層細胞生長良好；5B：對照組移植區(qū)上皮較薄且有部分缺損，真皮層結(jié)構(gòu)紊亂，有炎癥細胞浸潤

討 論

組織工程皮膚移植是在體外將種子細胞與合適的細胞外基質(zhì)進行器官培養(yǎng)后獲得人工皮膚，并將其移植到皮膚缺損部位，在細胞外基質(zhì)逐步降解的過程中，種植的細胞通過增殖分化形成具有固有功能的活性組織。它在臨床上主要用于大面積燒傷、難治性潰瘍等皮膚缺損性疾病的皮膚移植。目前組織工程皮膚種類繁多，但很多產(chǎn)品仍不成熟，主要存在以下問題：①種子細胞來源缺乏，培養(yǎng)耗時長；②異體種子細胞誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)；③耐磨性差；④治療費用昂貴。理想的組織工程皮膚應(yīng)同時修復(fù)表皮和真皮組織，因為這兩種組織結(jié)構(gòu)不僅決定皮膚的功能和外形，且相互影響，能夠促進彼此分化。因此，探索構(gòu)建組織工程全層皮膚的新方法是今后皮膚組織工程研究的主要方向。現(xiàn)國內(nèi)外很多學(xué)者都在進行組織工程全層皮膚移植的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究，Pellegrini等［7］通過篩選全克隆干細胞集落作為構(gòu)建人工皮膚的表皮種子細胞，在纖維蛋白制備的支架中接種FB來構(gòu)建真皮層，并用構(gòu)建的全層組織工程皮膚來治療大面積燒傷患者。目前組織工程皮膚的細胞基質(zhì)主要選用膠原凝膠，其后期易收縮，不耐磨。因大部分組織工程皮膚基底膜結(jié)構(gòu)不完整或缺乏，故易起泡，且創(chuàng)面愈合后仍會出現(xiàn)瘢痕增生。另外還存在彈性欠佳、柔軟度不足、抗感染力差等問題，故在臨床應(yīng)用中受到很大限制［8］。我們在皮膚重建中應(yīng)用DED組織可減少瘢痕增生，并增加創(chuàng)面愈合后的皮膚彈性、柔軟性及機械耐磨性，另在DED組織中接種FB可促進新生表皮增殖分化，并誘導(dǎo)基底膜形成［9］。

由于裸鼠無胸腺，T細胞生成障礙，是免疫缺陷動物，故容易植入異種細胞和組織，已有多個實驗采用裸鼠為載體研究移植免疫取得良好效果［10?11］。Berthod等［12］以表皮干細胞為種子細胞，將其種植在膠原海綿支架上，體外器官培養(yǎng)后將獲得的人工皮膚移植到裸鼠背部，觀察發(fā)現(xiàn)裸鼠自身的血管逐漸向膠原海綿支架下延伸到表皮下，并在細胞支架內(nèi)形成完整的血管網(wǎng)。故我們選擇裸鼠來制備皮膚缺損的動物模型，用于觀察組織工程皮膚移植后種子細胞在體內(nèi)增殖分化的情況及人工皮膚成活后的結(jié)構(gòu)特征。本實驗中新鮮的組織工程全層皮膚hAEC?DED移植于裸鼠14 d后即與周圍組織基本融合生長，21 d后與周圍皮膚外觀上無明顯差別，約28 d后即能轉(zhuǎn)化為組織結(jié)構(gòu)合理的皮膚組織。組織學(xué)顯示，移植的組織工程皮膚表皮和真皮結(jié)構(gòu)層次清晰，且與正常皮膚結(jié)構(gòu)相似，表皮結(jié)構(gòu)清晰，角質(zhì)層明顯，真皮富含纖維，且真表皮分界清晰。由此可見，我們構(gòu)建的組織工程皮膚具有與正常皮膚相似的功能和生物活性，用于修復(fù)實驗動物皮膚缺損效果良好，為后期的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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Construction of tissue?engineered skin by culture of human amniotic epithelial cells on human de?epidermized dermis for the repair of skin defects in nude mice:an experimental study

Jiang Leiwei,Liu Zhi,Lu Bin,Zhou Wenming,Li Yuanying,Lu Hongguang
Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China

Lu Hongguang,Email:hongguanglu@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the feasibility of repair of full?thickness skin defects in nude mice with tissue?engineered skin which was constructed by culture of human amniotic epithelial cells（hAECs）and fibroblasts on human de?epidermized dermis（DED）.MethodsHealthy human amniotic tissues were treated with trypsin at a low concentration in multi?steps to prepare hAECs,and a two?step collagenase digestion was used to treat healthy children′s prepuce tissues to prepare fibroblast suspensions.When fibroblasts were culturedin vitroup to passage 3-5 and hAECs up to passage 2,they were seeded on the reticular dermal surface and basement membrane surface of the DED respectively to construct the tissue?engineered skin.A total of 20 healthy male nude mice aged 3-4 weeks were enrolled into this experiment,and full?thickness skin defects were made on the middle of the back of mice.Then,these mice were randomly divided into 2 groups by using a lottery method,and reconstructed full?thickness tissue?engineered skin grafts and vaseline oil gauze were used to cover the wounds in the tissue?engineered skin group and control group respectively.The whole body and transplantation sites of the nude mice were observed on day 7,14,21 and 28 after transplantation,the wound healing time and rate were compared between the above two groups,and skin tissues at the transplantation site were harvested at 4 weeks after transplantation and subjected to histological examination.ResultsHAECs had stem?cell characteristics and expressed octamer?binding protein?4（OCT?4）and embryonic marker stage?specific embryonic antigen?4（SSEA?4）.After 2?week organ culture,thein vitroreconstructed tissue?engineered skin showed 4-9 continuous layers of strati fi ed epithelium,and the histological structure of the epidermis was similar to that of the normal human skin.Compared with the control group,the tissue?engineered skin group showed significantly higher wound healing rates on day 7,14 and 21 after transplantation（57.49% ±6.11%vs.22.93%±4.26%,92.80%±3.10%vs.54.57%±7.94%,98.83%±0.25%vs.91.16%±4.79%,respectively;n=10,t=27.36,32.23,11.80,respectively,allP＜ 0.001）,shorter wound healing time［（21.51 ± 1.51）dvs.（28.80±1.14）d,n=10,t=42.23,P＜0.001］,with the color of skin grafts closer to that of autologous skin on day 28 after transplantation.Histological examination revealed distinct stratification of the epithelium,obvious keratinization and favorable growth of cells in the dermis in the tissue?engineered skin group,but thin epithelium with some defects,indistinct stratification of the dermis,and inflammatory cell infiltration in the control group.ConclusionTissue?engineered skin constructed by the culture of hAECs and fibroblasts on human DED can survive in nude mice after transplantation,resulting in a more favorable healing of wounds,and is expected to serve as a kind of ideal tissue?engineered skin.

Tissue engineering;Epithelial cells;Dermis;Skin transplantation;Wound healing;De?epidermized dermis;Human amniotic epithelial cells

陸洪光，Email：hongguanglu@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.07.007

國家自然科學(xué)基金（81673069）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金（黔科合J字［2014］2024號）；貴州省人民醫(yī)院博士基金（GZSYBS［2016］05號）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81673069）;Science and Technology Foundation of Guizhou Province（Guizhou Provincal Department of Science and Technology［2014］2024）;Doctoral Fund of Guizhou Provincial People′s Hospital（GZSYBS［2016］05）

2016?08?31）

（本文編輯：尚淑賢）