皮文輝

綿羊成纖維細(xì)胞中TALE-TFs激活β酪蛋白基因啟動(dòng)子研究

皮文輝

（綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000）

針對(duì)綿羊 β-酪蛋白基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)4個(gè)人工轉(zhuǎn)錄因子TALE-TFs（Transcription activator-like Biffectortranscription factors）。電轉(zhuǎn)染TALE-TFs進(jìn)入綿羊成纖維細(xì)胞中，通過實(shí)時(shí)熒光定量和Western blotting檢測β-酪蛋白基因表達(dá)，篩選獲得激活效果較好的TALE-TF1。將TALE-TF1和β-酪蛋白基因啟動(dòng)子、Red報(bào)告基因質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染進(jìn)入綿羊成纖維細(xì)胞，通過熒光顯微鏡直接觀察報(bào)告基因Red表達(dá)。研究表明，利用TALE人工轉(zhuǎn)錄因子，在綿羊成纖維細(xì)胞中能夠激活β-酪蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)框，為替代乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)驗(yàn)證系統(tǒng)提供了一種檢測途徑。

TALE-TFs；綿羊成纖維細(xì)胞；β-酪蛋白基因啟動(dòng)子；表達(dá)調(diào)控

0 引言

1987年，Gordon等采用原核顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得乳腺生物反應(yīng)器小鼠模型[1]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的發(fā)展，在哺乳動(dòng)物基因組的高表達(dá)乳蛋白基因座，定位整合外源基因，利用乳蛋白基因固有的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制，調(diào)控外源整合基因表達(dá)，可能成為構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器模型的一種途徑[2-4]。

哺乳動(dòng)物β-酪蛋白基因在乳腺中高表達(dá)[5，6]，皮膚[7]和有毒 T淋巴細(xì)胞（cytotoxic Tlymphocytes）[8]中也有所表達(dá)。敲除β-酪蛋白基因小鼠能夠正常生長、繁殖和哺育后代[9]。乳腺中外源基因直接代替內(nèi)源基因，可提高外源基因表達(dá)競爭能力[10]。因此，β-酪蛋白基因位點(diǎn)是制備乳腺生物反應(yīng)器的合適靶點(diǎn)。

為證實(shí)β-酪蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)框是有效的，Kolb等采用乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行了研究[2]。國內(nèi)乳腺生物反應(yīng)器研究方面，也采用乳腺上皮細(xì)胞驗(yàn)證表達(dá)框的有效性[11，12]。如果能夠在成纖維細(xì)胞中激活β-酪蛋白基因啟動(dòng)子，檢測重組表達(dá)框的表達(dá)結(jié)果，將為乳腺生物反應(yīng)器的構(gòu)建提供方便的檢測技術(shù)。

轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子 （transcription activator-like effector，TALE）來源于黃單胞桿菌（Xanthomonas sp.），TALE-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由串聯(lián)重復(fù)單元組成，大部分單元含34（33—35）個(gè)氨基酸，單元的第12和13位氨基酸高度可變，稱為重復(fù)可變區(qū)（repeat vari ablediresidues，RVDs）。TALE 的 RVDs識(shí)別 DNA 序列的4個(gè)堿基具有高度的專一性，TALE重復(fù)單元的第13位氨基酸直接與DNA的堿基特異結(jié)合[13-15]。研究者開發(fā)的模塊化構(gòu)建程序[16]，幾乎能夠針對(duì)任何DNA靶序列，構(gòu)建特異性TALE-DNA結(jié)合域，成就TALEs作為基因組編輯（genome editing）和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控（transcriptional modulation）的有效工具，也是動(dòng)物基因組相關(guān)研究的有力工具[16-18]。

TALE-DNA結(jié)合域串聯(lián)VP64轉(zhuǎn)錄激活因子，構(gòu)成 TALE轉(zhuǎn)錄因子 （TALE transcription factors，TALE-TFs）。TALE特異結(jié)合DNA，VP64同真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子作用，招募RNA聚合酶和其它因子，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體 （transcription preinitiation complex），間接調(diào)控特定基因轉(zhuǎn)錄[16]。

TALE-TFs即能提高表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄水平，還能激活在特定細(xì)胞中不表達(dá)的基因。本文將含綿羊β-酪蛋白基因5'端啟動(dòng)子的紅色熒光蛋白報(bào)告基因質(zhì)粒，與TALE-TFs共轉(zhuǎn)染綿羊胚胎成纖維細(xì)胞，觀察到紅色熒光蛋白 （red fluorescent protein，Red）表達(dá)，證實(shí)在成纖維細(xì)胞中，TALE-TFs能激活質(zhì)粒上的β—酪蛋白基因啟動(dòng)子。反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，證實(shí)TALE-TFs激活了綿羊成纖維細(xì)胞中的β-酪蛋白基因。說明能夠用TALETFs，在綿羊的成纖維細(xì)胞中，檢測重組的β-酪蛋白基因啟動(dòng)子—外源基因表達(dá)框的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，為乳腺生物反應(yīng)器構(gòu)建，提供一種新的篩選核供體細(xì)胞的檢測技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DH5α菌種購自Invitrogen公司，pMD18-T購自 TaKaRa公司，pDsRed2-1和 pEFGFP-N1購自Clontech公司。TALE-TFs由廣州復(fù)能基因有限公司構(gòu)建。綿羊胚胎成纖維細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室原代培養(yǎng)保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中綿羊β-酪蛋白基因序列（X79703.1）和 GAPDH 基因序列（NM_001289746.1）設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物名稱及序列Table 1 PCR primer design and sequences

1.2.2 基因片段擴(kuò)增和克隆

藥物治療管理 （medication therapy management，MTM）是指由具有MTM資質(zhì)的醫(yī)護(hù)人員（主要是藥師），單獨(dú)或通過調(diào)適藥物來優(yōu)化患者個(gè)體醫(yī)療結(jié)果的特殊服務(wù)。合格的藥師在MTM服務(wù)中有著獨(dú)一無二的地位[4]，是MTM的主要提供者。本文作者通過使用 “COPD，Drug-related problems，Medication therapy management，Pharmaceutical care，Pharmaceutical service”等關(guān)鍵詞，檢索COPD MTM服務(wù)相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)COPD患者存在的常見DRPs及MTM工作模式在COPD疾病中運(yùn)用的情況。

以綿羊基因組為模版，ShE1F和ShE2R為引物，PCR擴(kuò)增獲得4 580 bp DNA片段I。以DNA片段I為模版，用引物TYShE1LBF/TYGDShE1LBR和TYShE1RBF/TYShE1RBR擴(kuò)增，獲得綿羊β酪蛋白基因第一外顯子靶點(diǎn)的同源重組左臂DNA片段2和右臂DNA片段3。采用XhoI和HindIII雙酶切片段2和pDS-Red2-1質(zhì)粒，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得過度載體pDS-Red-GDLB。為了將綿羊β酪蛋白基因完整的信號(hào)肽拼接在一起，將ShE2-Oli1/ShE2-Oli2退火復(fù)性，獲得含4個(gè)堿基粘性末端的DNA片段。用HindIII/BsmBI酶切pDS-Red-GDLB載體，膠回收DNA片段，并將該片段同ShE2-Oli1/ShE2-Oli2退火復(fù)性片段經(jīng)T4連接酶連接，獲得pDS-Red-ShE1LB載體。應(yīng)用HindIII/MnuI雙酶切右臂DNA片段3和pDS-RED-ShE1LB載體，膠回收DNA片段，T4連接酶連接對(duì)應(yīng)片段，獲得pTY-ShE1LB-2BsmBIShE1RB。

以DNA片段I為模版，用引物TYShE1LBF/TYShE2LBR和TYShE2RBF/TYShE2RBR擴(kuò)增，獲得綿羊β酪蛋白基因第二外顯子靶點(diǎn)的同源重組左臂DNA片段4和右臂DNA片段5。采用XhoI和HindIII雙酶切片段4和pDS-Red2-1質(zhì)粒，膠回收DNA片段，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得載體pDS-Red-ShE2LB。應(yīng)用HindIII/AflII雙酶切右臂DNA片段3和pDS-REDShE2LB載體，膠回收DNA片段，T4連接酶連接對(duì)應(yīng)片段，獲得載體pTY-ShE2LB-2BsmBI-ShE2RB。

模板采用 pDS-Red 2-1質(zhì)粒，TYShRedF/TYShRedR引物PCR擴(kuò)增，獲得紅色熒光蛋白R(shí)ed+poly A基因片段。BsmBI酶切Red+poly A基因片段、pTY-ShE1LB-2BsmBI-ShE1RB載體和 pTYShE2LB-2BsmBI-ShE2RB載體。膠回收相應(yīng)基因片段。T4連接酶連接Red+poly A基因片段和pTYShE1LB-2BsmBI-ShE1RB載體，獲得pShE1lBRed-pA-ShE1RB報(bào)告基因表達(dá)載體（圖1）。T4連接酶連接Red+poly A基因片段和pTY-ShE2LB-2BsmBI-ShE2RB載體，獲得pShE2LB-Red-pAShE2RB報(bào)告基因表達(dá)載體（圖2）。

載體構(gòu)建過程中，涉及到的PCR擴(kuò)增DNA片段，全部采用TAKARA公司的高保真PrimeSTAR R Max DNA Polymerase（R050A），PCR 擴(kuò)增程序：98 ℃10 s；55 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s；35 個(gè)循環(huán)。

載體構(gòu)建過程中，涉及到連接DNA片段，全部采用TAKARA公司T4 DNA連接酶 （2011A），10μL連接體系，16℃過夜連接。將5μL連接液加入50 μL DH5a大腸桿菌感受態(tài)中，30 min冰浴，42℃熱擊90s，冰浴3 min，涂于含卡納抗性的固體瓊脂糖平板，37℃培養(yǎng)14—16 h。挑取單克隆接種于含卡納抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200 rpm的搖床中培養(yǎng)12 h，菌體裂解提質(zhì)粒。載體序列測定由Invit rogen公司完成。

1.2.3 TALE-TFs靶點(diǎn)設(shè)計(jì)

以綿羊β-酪蛋白基因序列（X79703.1）和TALE（轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子）單元與DNA堿基配對(duì)關(guān)系為基礎(chǔ)，分析設(shè)計(jì)TALE-TFs（轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子—人工轉(zhuǎn)錄因子）靶點(diǎn)序列（圖3）。

1.2.4 綿羊胚胎成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)

圖3 綿羊β-酪蛋白基因人工轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)序列示意圖Figure 3 Target sites of engineered TALE transcript factors in the ovineβ-casein gene

選擇妊娠30日齡的中國美利奴軍墾型細(xì)毛羊胎羊，取肌肉組織剪切成小塊，按0.5 cm間距均勻種植于培養(yǎng)皿，待組織小塊貼壁，加入培養(yǎng)液（Gibco公司的DMEM高糖培養(yǎng)液+15%血清+1%雙抗），置于37℃、5%CO2和完全飽和濕度條件下培養(yǎng)。3—4d換液1次，待原代細(xì)胞匯合成片，占培養(yǎng)皿的80%—90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，獲得綿羊胚胎成纖維細(xì)胞。收獲細(xì)胞用Gibco胰酶替代物TrypLE消化，室溫2 500 r離心5 min，收集綿羊胚胎成纖維細(xì)胞。

1.2.5 綿羊胚胎成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

電轉(zhuǎn)液用純水配制。 SolutionⅠ（10mL）：2g ATPNa2和 1.2 g MgCl2·6H2O；SolutionⅡ （500 mL）：6 g KH2PO4、0.6 g NaHCO3和 0.2 g C6H12O6。 加 SolutionⅠ，使用0.2μm濾器過濾除菌，-20℃保存；SolutionⅡ用NaOH調(diào)節(jié)pH值到7.2，0.2μm濾器過濾除菌，4℃保存；用時(shí)將SolutionⅠ和SolutionⅡ按照1∶50體積比混合。

待細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿的80%時(shí)，消化收集1.8×106個(gè)細(xì)胞，100μL 電轉(zhuǎn)液懸?。⊿1∶S2=1∶50）， 按各2.5μg加入除內(nèi)毒素的TALE-TF質(zhì)粒和紅色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒pShE1lB-Red-pAShE1RB或者pShE2lB-Red-pA-ShE2RB，混勻轉(zhuǎn)入電擊杯中。電轉(zhuǎn)染陽性對(duì)照采用pMax質(zhì)粒，5μg每100μL電轉(zhuǎn)液，檢測轉(zhuǎn)染效率用流式細(xì)胞儀。選擇CZ-165電轉(zhuǎn)程序，對(duì)綿羊胚胎成纖維細(xì)胞實(shí)施電轉(zhuǎn)。靜置10 min，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，將電轉(zhuǎn)染后的綿羊胚胎成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板，37℃、5.0%CO2和飽和濕度條件培養(yǎng)，6 h后換培養(yǎng)液1次。電轉(zhuǎn)細(xì)胞48 h觀察細(xì)胞熒光蛋白基因表達(dá)效果。

1.2.6 qRT-PCR

Trizol（15596-026， invitrogen）試劑提取細(xì)胞總RNA。cDNA的制備按照EasyScript試劑盒說明操作（AT314，北京全式金生物技術(shù)有限公司）。反應(yīng)結(jié)束后cDNA保存于-20℃。選用GAPDH為內(nèi)參基因，以ShbetaRTF/ShbetaRTR和ShGAPDHF/ShGAPDHR為引物，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明操作，擴(kuò)增β-酪蛋白和GAPDH基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為 20μL，包括：2×qPCRMix 10μL，上下游引物各0.4μL，模板 cDNA 1μL，去離子水 8.2μL。 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃5 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，在72℃20 s處收集熒光信號(hào)，共45個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，以0.1℃/s的速度進(jìn)行溶解曲線分析。熒光定量 PCR數(shù)據(jù)分析采用 2-ΔΔCt法， 計(jì)算不同TALE-TFs電轉(zhuǎn)染后對(duì)綿羊胚胎成纖維細(xì)胞β-酪蛋白基因mRNA表達(dá)量的影響。

1.2.7 Western blotting

電轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)至72 h，收集細(xì)胞，用哺乳動(dòng)物蛋白（康為世紀(jì)）抽提試劑提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性5 min，12%SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%BSA溶液4℃過夜封閉，1∶1 000稀釋的 Beta-Casein抗體（AB BIOTEC，250558），室溫孵育 4 h；1 ∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（CW0103，康為世紀(jì)），室溫孵育1.5 h；洗膜后化學(xué)發(fā)光顯色。內(nèi)參對(duì)照為GAPDH。

1.2.8 流式細(xì)胞檢測

電轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，培養(yǎng)至48—72 h，使用熒光顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞GFP和RFP（red fluorescent pro tein，RFP）表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞。重懸在0.5 mL的PBS中，流式細(xì)胞儀分析（BDFACSAriaⅢ，F(xiàn)ACSDiva Version 6.1.3）。FITC通道檢測綠色熒光細(xì)胞。每份樣品細(xì)胞計(jì)數(shù)10 000個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，pMax質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達(dá)93.8%（圖4）。說明實(shí)驗(yàn)選擇的CZ-165電轉(zhuǎn)程序能夠滿足綿羊胚胎成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染后繼實(shí)驗(yàn)。

2.2 TALE-TFs激活綿羊成纖維細(xì)胞β-酪蛋白基因結(jié)果

TALE-TFs 4個(gè)人工轉(zhuǎn)錄因子分別電轉(zhuǎn)染進(jìn)入綿羊成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后提取總RNA，GAPDH做內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析TALE-TFs激活綿羊β-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄效率，結(jié)果見圖5。圖6是綿羊成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子TALE-TF1、兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子TALE-TF1和TALE-TF2共轉(zhuǎn)染、細(xì)胞的Western blotting檢測圖。

熒光定量PCR結(jié)果表明，在綿羊成纖維細(xì)胞中，TALE-TF1激活β-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄效率較高。Western blotting結(jié)果進(jìn)一步確定，TALE-TF1能夠在綿羊成纖維細(xì)胞中激活β-酪蛋白基因轉(zhuǎn)錄，并完成翻譯過程。

2.3 TALE-TF1激活Red報(bào)告基因質(zhì)粒結(jié)果

為了確定TALE-TF1人工轉(zhuǎn)錄因子能否激活β-酪蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)載體，將TALE-TF1和Red報(bào)告基因質(zhì)粒pShE1lB-Red-pA-ShE1RB或pShE2lB-Red-pA-ShE2RB共同轉(zhuǎn)染進(jìn)綿羊成纖維細(xì)胞。電轉(zhuǎn)染36 h時(shí)能夠觀察到綠色熒光報(bào)告基因，說明4個(gè)人工轉(zhuǎn)錄因子都正常表達(dá)。72 h和96 h時(shí)，均能夠觀察到紅色熒光蛋白表達(dá)（圖7），說明在綿羊成纖維細(xì)胞中，TALE-TF1人工轉(zhuǎn)錄因子能夠激活β-酪蛋白基因啟動(dòng)子調(diào)控的目的基因質(zhì)粒。

3 討論

根據(jù)TALE-DNA結(jié)合分子密碼，針對(duì)基因組靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)TALEs，不同的TALEs具有不同的活性，可能與上下文依賴效應(yīng)或染色體狀態(tài)有關(guān)[19]。為了在綿羊成纖維細(xì)胞中得到具有一定活性的TALETF，構(gòu)建多個(gè)TALE-TFs，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)綿羊成纖維細(xì)胞，篩選有生物學(xué)活性的TALE-TFs，能夠解決TALEs靶向局限性。本文針對(duì)綿羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建了4條TALE-TFs，獲得了1條激活效率較高的TALE-TF1人工轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，TALE-TF1能夠激活內(nèi)源和外源β-酪蛋白基因啟動(dòng)子，利用TALE-TF能夠在綿羊成纖維細(xì)胞中進(jìn)行檢測β-酪蛋白基因啟動(dòng)子—外源基因表達(dá)框是否能夠正常表達(dá)，為替代乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)驗(yàn)證系統(tǒng)提供了一種新的檢測途徑。

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Activation ofβ-casein Gene Promoter By Using Engineered TALE-TFs in Ovine Fibroblasts

PIWen-hui
（State Key Laboratory for Sheep Genetic Improvement and Healthy Production， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences， Shihezi832000， Xinjiang）

Four TALE-TFs targeting promoter of ovineβ-casein gene were designed and TALE-TFs of eukaryotic expression plasmid were constructed.These TALE-TFs plasmids were nucleofected into sheep embryo fibroblasts respectively.Compared with the controlgroups,TALE-TF1wasidentifiedtoeffectivelyactivatetheexpressionofsheepβ-caseingenethroughqRT-PCRand Westernblotting.TALE-TF1plasmidandexpressioncassettewithβ-caseingenepromoterand Redfluorescentproteinreportergenewereco-nucleofected into ovine fibroblasts through Amaxa Nucleofector.β-casein gene promoter could be activated by artificial TALE-TFs in ovine fibroblasts.TALE-TFs were adopted to provide a new approach for detecting the expression result ofβ-casein gene promoter interesting gene expression cassettesin ovine fibroblasts.

TALE-TFs； Ovine fibroblasts； β-casein gene promoter； Gene expression modulation

2017-06-07

兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2016AG008);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560321，31360276)

聯(lián)系方式：皮文輝(1972-),男,研究員,研究方向動(dòng)物遺傳育種,Emai l:wzj pwh@163.com