翁昌亞 宋雪 張慧 段亞麗 郭玉 陸晨

·論著·

ELMO1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族糖尿病腎臟疾病易感性相關(guān)研究

翁昌亞 宋雪 張慧 段亞麗 郭玉 陸晨

目的探討新疆維吾爾族吞噬和細(xì)胞運(yùn)動蛋白1(engulfment and cell motility 1，ELMO1)基因多態(tài)性與新疆維吾爾族糖尿病腎臟疾病的關(guān)系，并探討該基因是否為糖尿病腎臟疾病獨(dú)立風(fēng)險因素。方法應(yīng)用PCR測序技術(shù)檢測等位基因的多態(tài)性分布頻率，研究ELM01 rs10951509(A/G)、rs2717972(A/G)多態(tài)性在正常對照組80例、2型糖尿病組84例、2型DKD組97例中的基因頻率分布，使用Logistic回歸分析檢測該基因是否為糖尿病腎臟疾病獨(dú)立風(fēng)險因素。結(jié)果在ELM01 rs10951509中，DKD組(χ2=11.073，P<0.05)及糖尿病組(χ2=4.078，P<0.05)G等位基因頻率明顯高于正常對照組和糖尿病組，而DKD組與糖尿病組等位基因頻率未見統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.758，P>0.05)。在ELM01 rs2717972中，DKD組(χ2=11.073，P<0.05)及糖尿病組(χ2=4.078，P<0.05)G等位基因頻率明顯高于正常對照組，而DKD組與糖尿病組等位基因頻率未見統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.758，P>0.05)。Logistic回歸分析表明，高體質(zhì)量指數(shù)、舒張壓、三酰甘油 和ELMO1 rs10951509 G等位基因為糖尿病腎病發(fā)生的獨(dú)立危險因素。結(jié)論ELM01 rs10951509基因多態(tài)性與糖尿病腎臟疾病相關(guān)，即G等位基因攜帶者可能增加糖尿病腎臟疾病的發(fā)生風(fēng)險，而rs2717972 G等位基因可能是糖尿病腎臟疾病和糖尿病共同易感基因，2型糖尿病患者攜帶高體質(zhì)量指數(shù)、舒張壓、三酰甘油和EMLO1 rs10951509 G等位基因為可能增加糖尿病腎臟疾病患病風(fēng)險。

吞噬和細(xì)胞運(yùn)動蛋白1；糖尿病；糖尿病腎臟疾病；易感性；等位基因

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常見的最嚴(yán)重慢性微血管并發(fā)癥之一，并且己成為引起終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)及糖尿病病死率增加的重要因素。有關(guān)DKD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，許多研究證明遺傳因素、環(huán)境因素和長期的糖代謝紊亂是引起DKD的主要原因[1-3]。吞噬和細(xì)胞運(yùn)動蛋白1(engulfment and cell motility 1，ELMO1)基因位于染色體7p14位置，在死亡細(xì)胞吞噬、細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞形態(tài)變化中起著必不可少的作用[4]。近年來日本學(xué)者的一項全基因組關(guān)聯(lián)研究證明ELMO1基因是DKD的一種新型的候選基因，不僅增加了DKD的易感性，而且在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5]。此后，其他多個國家研究證實ELMO1基因多態(tài)性與DKD易感性具有相關(guān)性。然而，ELMO1基因多態(tài)性與新疆維吾爾人群DKD易感性的關(guān)聯(lián)性卻不得而知。本研究采取候選基因法研究ELMO1 rs10951509(A/G)、rs2717972(A/G)基因多態(tài)性在正常對照組、糖尿病組及DKD組中分布頻率，以探討維吾爾族人群ELMO1基因與DKD的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

1.研究對象 選擇2015年6月至2016年3月期間在新疆自治區(qū)人民醫(yī)院就診的181例確診為2型糖尿病患者，其中男100例，女81例，年齡45～71歲，平均年齡(58.5±8.9)歲。另外選擇同期在該院體檢中心檢查的健康體檢者80例，其中男34例，女46例，年齡40～70歲，平均年齡(50.8±7.7)歲。所有入選對象均為維吾爾族，彼此間無血緣關(guān)系，均簽署知情同意書。

2.納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)1999 年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取的181例確診為2型糖尿病的患者，病程均超過10年，發(fā)病年齡大于40歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤、急慢性感染、自身免疫系統(tǒng)疾病、血液疾病及其他慢性疾病患者；②合并其他原發(fā)或繼發(fā)性腎病患者；③近8周內(nèi)使用過腎毒性藥物、免疫抑制劑或激素；④妊娠或哺乳期婦女；⑤心、腦、肺、肝、血液系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)有嚴(yán)重疾病的患者；⑥近期有嚴(yán)重外傷者或重大手術(shù)者。

二、方法

1.分組 根據(jù)DKD診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)將181例2型糖尿病患者分為糖尿病組和DKD組，80例健康體檢者設(shè)為正常對照組。糖尿病組：84例，其中男44例，女40例，年齡47～70歲，平均年齡(57.5±8.7)歲，白蛋白/肌酐比值(ACR)<30 mg/g。DKD組：97例，其中男56例，女41例，年齡45～71歲，平均年齡(60.3±9.9)歲，ACR≥30 mg/g且合并糖尿病視網(wǎng)膜病變。

2.檢測指標(biāo) 測晨8:00～9:00 時坐位測量右上臂肱動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，入院或體檢時測量腰圍、身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)=體質(zhì)量/身高2)。取空腹靜脈血測定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)。留取晨尿，測定尿白蛋白和肌酐，并計算ACR。

3.EMLO1基因多態(tài)性的檢測 由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供DNA提取試劑盒，按照DNA提取試劑盒操作方法提取外周血DNA，引物采用Primer 3設(shè)計，由北京鼎國公司合成。 位點(diǎn)引物1：5'-GCCTAAAGGGGTTTCAGCA-3'，引物2：5'-AGAATGGGGAAGGGCAGAA-3'。以PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)步驟：95 ℃預(yù)變5 min，95 ℃變性30 s，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次，72 ℃終末循環(huán)5 min，最后置于4 ℃終止反應(yīng)。 717972位點(diǎn)引物1：5'-TCATAGCAAAACCTAAAGT-3'，引物2：5'-CTGGCAGATACACACACTC-3。PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)步驟：95 ℃預(yù)變5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次，72 ℃終末循環(huán)5 min，最后置于4 ℃終止反應(yīng)。樣本PCR擴(kuò)增后測序，鑒定基因型。(圖1～2)

圖1 rs10951509測序結(jié)果

圖2 rs2717972測序結(jié)果

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以M(QR)表示，計數(shù)數(shù)據(jù)以n(%)表示；計量資料符合正態(tài)分布使用單因素方差分析，組間分析采用S-N-K法，不符合正態(tài)分布使用秩和檢驗；計數(shù)資料使用χ2檢驗，相關(guān)因素參與發(fā)病獨(dú)立性使用Logistic回歸分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組臨床和生化指標(biāo)的比較

糖尿病組年齡、BMI、SBP、DBP、SCr、FPG、LDL-C、HbA1c、ACR均高于正常對照組，TC值低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DKD組年齡、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、LDL-C、HbA1c、ACR均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而DKD組與糖尿病組比較，DKD組年齡、BMI、SBP、TG、BUN、SCr、ACR顯著高于糖尿病組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(表1～2)

表1 3組一般資料的比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05;與糖尿病組比較，bP<0.05

二、ELMO1 rs10951509(A/G)變異分布

各組研究對象基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。DKD組G等位基因頻率明顯高于正常對照組(χ2=21.331，P<0.05) 和糖尿病組(χ2=20.520，P<0.05)，而糖尿病組和正常對照組等位基因分布未見明顯差異(χ2=0.026，P>0.05)。AA/AG/GG 基因型頻率在DKD組與正常對照組或糖尿病組間存在統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=12.071，P<0.05或χ2=12.775，P<0.05),而正常對照組和糖尿病組間不存在統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.181，P>0.05)。(表3)

三、ELMO1 rs2717972(A/G)變異分布

各組研究對象基因型分布符合Hardy-Wein-berg 平衡(P>0.05)。DKD組(χ2=11.073，P<0.05) 及糖尿病組(χ2=4.078，P<0.05)G等位基因頻率明顯高于正常對照組和糖尿病組，而DKD組與糖尿病組等位基因頻率未見統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.758，P>0.05)。AA/AG/GG 基因型頻率在DKD組與正常對照組或糖尿病組間存在統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=15.456，P<0.05 或χ2=7.197，P<0.05),而正常對照組和糖尿病組間不存在統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=3.223，P>0.05)。(表4)

表2 3組生化指標(biāo)的比較

注：與正常對照組比較，aP<0.05;與糖尿病組比較，bP<0.05

四、Logistic 回歸分析

以糖尿病患者是否發(fā)生腎病為分類變量，以年齡、性別、腰圍、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、TC、LDL-C、HDL-C、HbA1c和ELMO1 rs10951509、rs2717972基因型為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析，經(jīng)逐步選擇表明，高BMI、DBP、TG 和ELMO1 rs10951509AG/GG等位基因為糖尿病發(fā)生腎病的獨(dú)立危險因素，AG/GG基因型與AA基因型相比對，DKD比值比(OR)為3.014(95% CI:1.160～6.204)，用Logistic回歸校正后OR為3.368(95% CI:1.247～7.337)，而rs2717972基因型未進(jìn)入方程。(表5)

討 論

DKD在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)成為ESRD的首要原因，在我國其導(dǎo)致的ESRD也趨向于發(fā)達(dá)國家水平。DKD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，遺傳因素是決定DKD易感性及其嚴(yán)重程度的重要因素。DKD的發(fā)生并不完全與血糖、血壓等控制情況成正比，有很明顯的家族聚集性和種族差異。有DKD家族史者發(fā)生DKD的概率是正常人的3倍，DKD患者的同胞發(fā)生DKD的風(fēng)險是無腎臟疾病糖尿病患者同胞的2.3倍[6-7]。

DKD主要是糖尿病導(dǎo)致的腎小球疾病，明顯的變化是細(xì)胞外機(jī)制(extracellular matrix,ECM)增生，其病理改變包括腎臟肥大、腎小球與腎小管基底膜增厚、腎小球系膜基質(zhì)增多、腎小球足細(xì)胞損傷、腎小球無細(xì)胞性結(jié)節(jié)狀硬化、腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚等，然而其具體發(fā)病機(jī)理尚無明確因果論證。而ECM在系膜細(xì)胞內(nèi)的過度堆積是DKD的標(biāo)志之一，研究表明，ELMO1可能通過介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)代謝失調(diào)和減少細(xì)胞黏附性，引起ECM沉積，腎小球與腎小管基底膜增厚，以及尿蛋白的增多，導(dǎo)致慢性腎小球和腎小管損傷[8]。ECM在ELMO1過度表達(dá)的細(xì)胞中，其表達(dá)大幅增加；而基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloproteinases, MMPs)的表達(dá)明顯降低。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3.1-ELMO1質(zhì)粒DNA的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染3.1-β-半乳糖普酶基因(3.1-LacZ)的細(xì)胞，I型膠原(IV-1)、纖維連接蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (TGF-β1)的表達(dá)明顯增加，而MMPs的表達(dá)降低[9]。此外，ELMO1還可能通過調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶活性在腎小球細(xì)胞損害中發(fā)揮作用，ELMO1和環(huán)氧化酶兩種蛋白相互作用增強(qiáng)了環(huán)氧化酶活性因而增加了纖維連接蛋白的表達(dá)，致使腎小球中細(xì)胞外基質(zhì)不斷沉積，兩者相互作用增加對腎小球損害，促使DKD的發(fā)生[10]。因此，ELMO1基因過度表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積，致使腎小球和腎小管基膜增厚，而腎小球和腎小管基膜增厚均已被確認(rèn)為DKD發(fā)展至ESRD的重要標(biāo)志。

Shimazaki等[5]對日本2型糖尿病患者進(jìn)行了一項全基因組關(guān)聯(lián)研研究，確定了ELMO1基因參與DKD易感性的作用,ELMO1內(nèi)含子18+1970可能直接影響DKD的易感性并成為藥物預(yù)防和治療DKD的一個有效的新的靶點(diǎn)。Leak等[11]對ELMO1基因在非洲裔美國人2型糖尿病的ESRD患者中作用的研究結(jié)果證明位于ELMO1基因多個位點(diǎn)均與ESRD相關(guān)。Hanson等[12]研究了ELMO1基因多態(tài)性在亞利桑那州的印第安人的DKD易感情況，結(jié)果表明，位于內(nèi)含子13的rs1345365A等位基因和rs10951509 A等位基因與DKD具有高度關(guān)聯(lián)性及配對連鎖不平衡。我國學(xué)者針對ELMO1 rs741301、rs11769038的研究得出ELMO1基因與漢族DKD易感性相關(guān)[13]。

表3 rs10951509的基因型和等位基因分布

表4 rs2717972的基因型和等位基因分布

表5 糖尿病患者腎病和非腎病組Logistic回歸分析

本研究以長期居住于新疆地區(qū)的維吾爾族人群為研究對象，可充分了解維吾爾族人群的基因分布，再者，糖尿病組篩選病程≥10 年，可排除短病程等因素對于該組患者尿蛋白排泄的影響，使結(jié)果更可靠。研究結(jié)果顯示，EMLO1 rs10951509基因 DKD組G等位基因的頻率顯著高于正常對照組和糖尿病組，而正常對照組和糖尿病組間未見統(tǒng)計學(xué)差異，表明EMLO1 rs10951509基因是DKD的易感基因(OR=2.689,95% CI:1.186-6.692)，而非糖尿病易感基因，與國外研究EMLO1 rs10951509 A等位基因為易感基因相反[12]，考慮與種族、地域差異有關(guān)，也有可能因本研究樣本量偏少，后續(xù)加大樣本量研究可能得出不同結(jié)果。ELMO1 rs2717972 G等位基因頻率DKD組和糖尿病組未見統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，兩者與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，因此，ELMO1 rs2717972 G等位基因為DKD組和糖尿病組共同易感基因。經(jīng)Logistic回歸分析表明高BMI、DBP、TG 和EMLO1 rs10951-509 G等位基因為DKD獨(dú)立風(fēng)險因素，糖尿病腎臟疾病患者需對血壓、體質(zhì)量、飲食等高危飲食嚴(yán)格控制，同時攜帶上述2基因位點(diǎn)可能增加糖尿病患者發(fā)生DKD的風(fēng)險。但由于基因作用的復(fù)雜性，ELMO1基因參與DKD的發(fā)生分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究[14-15]。

綜上所述，本課題研究了EMLO1 rs10951509(A/G)、rs2717972(A/G)基因多態(tài)性和新疆維吾爾族DKD具有易感相關(guān)性。但由于樣本量偏少，還不能準(zhǔn)確描述2位點(diǎn)與新疆維吾爾族DKD易感相關(guān)性，需后續(xù)加大樣本量獲取更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。同時從基因?qū)用嫜芯緿KD病因有助于早期篩查、預(yù)防與延緩DKD的發(fā)生發(fā)展對提高糖尿病患者存活率，改善其生活質(zhì)量具有重要意義[7]，同時對遺傳學(xué)不斷深入的研究可能成為DKD藥物預(yù)防和治療一個新的靶點(diǎn)。

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Association of ELMO1 polymorphism with risk of Xinjiang Uygur diabetic kidney diseases

WENGChang-ya,SONGXue,ZHANGHui,DUANYa-li,GUOYu,LUChen.

DepartmentofNephrology,People'sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830001,China

Correspondingauthor：LUChen,E-mail:luchen706@163.com

ObjectiveTo study whether the engulfment and cell motility 1 gene (ELMO1) polymorphism is associated with a high risk of Xinjiang Uygurdiabetic kidney diseases, analyze the clinical index and biochemical index among the normal controls, simple diabetes and diabetic kidney diseases, and discuss whether the ELMO1 was independent risk factor for diabetic kidney diseases.MethodsThe allele frequency and the genotype distribution of the ELMO1 rs10951509 (A/G), and rs2717972(A/G) polymorphism were studied in normal controls (80 cases), simple diabetes (84 cases), and diabetic kidney diseases (97 cases) by means of PCR sequencing technology. The Logistic regression analysis was done to detect whether the ELMO1 was an independent risk factor for diabetes kidney disease.ResultsPatients with diabetic kidney disease had a higher frequency of G allele of the ELMO1 rs1095150 polymorphism than that of normal controls (χ2=11.073,P<0.05) and simple diabetes (χ2=4.078,P<0.05), but there was no significant difference in frequency of G allele between the normal controls and patients with simple diabetes (χ2=1.758,P>0.05). Patients with diabetic kidney disease (χ2=11.073,P<0.05) and simple diabetes (χ2=4.078,P<0.05) had a higher frequency of G allele of the ELMO1 rs2717972 polymorphism than that of normal controls (P<0.05), but there was no significant difference in frequency of G allele between the patients with diabetic kidney disease and those with simple diabetes (χ2=1.758,P>0.05). Logistic regression analysis indicated that higher BMI, DBP, TG, and the ELMO1 rs10951509G allele were the independent predictors for diabetic kidney disease.ConclusionsThe patients with ELM01 rs10951509 may be more susceptible to diabetic kidney disease than diabetic patients with G allele. And the rs2717972 G allele may be common susceptible gene to diabetic kidney disease and diabetic patients. The patients with type 2 diabetes mellitus with high BMI, DBP, TG, and EMLO1 rs10951509 G allele may increase the risk of diabetic kidney disease.

Engulfment and cell motility 1; Diabetes; Diabetic kidney disease; Susceptibility; Allele frequency

2016-12-25

2017-08-15)

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.09.002

基金名稱：新疆維吾爾自治區(qū)自然基金課題(No.2012211A088)

830001 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腎病科

陸晨，E-mail：luchen706@163.com