陳金媛 劉柏辰 韓瀟倩 周慶華

(浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014)

杭州市冬春季大氣細(xì)顆粒物中多環(huán)芳烴的粒徑分布特征及細(xì)胞毒性研究*

陳金媛 劉柏辰 韓瀟倩 周慶華#

(浙江工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014)

為了解杭州市大氣細(xì)顆粒物中多環(huán)芳烴(PAHs)的粒徑分布特征和主要來(lái)源，于2015年12月至2016年5月在杭州市某商住區(qū)采集了不同粒徑的大氣細(xì)顆粒物樣品，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)其中的PAHs進(jìn)行分析，并進(jìn)行了細(xì)胞毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明，不同粒徑大氣細(xì)顆粒物中PAHs的總濃度冬季均明顯高于春季。冬春兩季的PAHs環(huán)數(shù)粒徑分布基本呈現(xiàn)出4環(huán)>5環(huán)>3環(huán)>6環(huán)>2環(huán)。通過(guò)特征比值法判定，杭州市大氣細(xì)顆粒物中的PAHs主要來(lái)源于燃燒源和機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，粒徑越小的大氣細(xì)顆粒物對(duì)細(xì)胞的毒性作用越強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞膜損傷程度越大。

大氣細(xì)顆粒物 多環(huán)芳烴 粒徑分布 細(xì)胞毒性

隨著城市化的進(jìn)程加快，機(jī)動(dòng)車(chē)保有量急劇增加，城市基礎(chǔ)建設(shè)深入開(kāi)展，顆粒物污染已成為我國(guó)各城市大氣污染的首要問(wèn)題。大氣顆粒物因比表面積大而容易吸附有毒有害物質(zhì)，通過(guò)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入人體后會(huì)對(duì)人體健康造成不良影響[1-2]。多環(huán)芳烴(PAHs)是大氣顆粒物中一類(lèi)常見(jiàn)的有機(jī)污染物，具有致癌、致畸、致突變性。近些年，國(guó)內(nèi)的科研人員已對(duì)不同地區(qū)大氣顆粒物中的PAHs進(jìn)行了相關(guān)研究[3-7]，但主要僅針對(duì)PM2.5和PM10。已有研究表明，大氣顆粒物對(duì)人體健康的負(fù)面影響不僅取決于其吸附的化學(xué)成分，而且與其粒徑大小有關(guān)[8]，粒徑越小可能的負(fù)面影響更大，因此研究大氣細(xì)顆粒物(粒徑小于2.5 μm)中PAHs的粒徑分布特征與細(xì)胞毒性具有重要的意義，然而目前對(duì)于不同粒徑大氣細(xì)顆粒物中的PAHs研究甚少。

杭州市作為浙江省省會(huì)，位于長(zhǎng)江三角洲中心區(qū)域，經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅猛，城市規(guī)模日益擴(kuò)大，給大氣環(huán)境帶來(lái)了巨大的壓力。因此，本研究在杭州市某商住區(qū)采集冬春兩季的不同粒徑大氣細(xì)顆粒物，分析其中的PAHs粒徑分布特征、來(lái)源和細(xì)胞毒性，為后續(xù)的大氣細(xì)顆粒物研究提供參考，為相關(guān)部門(mén)進(jìn)行大氣污染防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣點(diǎn)位置為120°09′44.63″E，30°17′35.28″N，屬于商住區(qū)，采樣高度選擇距地面約15 m[9]，采樣時(shí)間為2015年12月至2016年5月。利用9級(jí)串聯(lián)低壓撞擊器(DLPI)連續(xù)采集不同粒徑的大氣細(xì)顆粒物樣品，采樣濾膜為鋁箔，采樣流量為10 L/min，每72 h收集一次樣品。雨雪天氣不進(jìn)行采樣。

采樣前，鋁箔在索氏提取器中于60 ℃下提取16 h，置于恒溫((25±1) ℃)、恒濕(50%±5%)箱中平衡24 h以上，以去除本底值。使用賽多利斯CPA225D型十萬(wàn)分之一精密電子天平稱(chēng)量采樣前后的鋁箔，所有鋁箔均稱(chēng)量?jī)纱?，保證兩次質(zhì)量差小于0.04 mg，取平均值[10]。采樣后的鋁箔存放于6孔板中冷藏保存。

1.2 樣品預(yù)處理及測(cè)定

在樣品中加入回收率指示物(包括萘-D8、二氫苊-D10、菲-D10、-D12、苝-D12)，質(zhì)量濃度均為2 μg/L，加入量為1 mL，用100 mL二氯甲烷∶正己烷(體積比，下同)=4∶1的混合液在索氏提取器中于65 ℃下提取16 h。提取液經(jīng)R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL以?xún)?nèi)，轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱凈化。層析柱填充物從上到下依次為1 cm硫酸鈉、10 cm硅膠、10 cm氧化鋁，使用前進(jìn)行活化。用70 mL 二氯甲烷∶正己烷=3∶7的混合液淋洗層析柱，淋洗液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2 mL以?xún)?nèi)，轉(zhuǎn)移至樣品瓶，氮吹后加入質(zhì)量濃度為10 μg/L的內(nèi)標(biāo)物六甲基苯200 μL，定容至1 mL，-20 ℃冷藏，待測(cè)。

運(yùn)用Agilent 7890A/5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)測(cè)定不同粒徑大氣細(xì)顆粒物中的16種PAHs，分別是萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[a]蒽、、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[a]芘、茚苯[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝。色譜柱為Agilent DB-5MS毛細(xì)色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為氦氣(純度為99.99%)；進(jìn)樣口溫度為300 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL；程序升溫：初溫50 ℃，保持2 min后以10 ℃/min升至180 ℃，再以6 ℃/min升至230 ℃，最后以3 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；電離源為電子轟擊源(EI)，能量為70 eV，溫度為250 ℃；掃描方式為選擇離子掃描。

1.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

細(xì)胞毒性試驗(yàn)選用傳代系細(xì)胞A549細(xì)胞，在含10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，接種于96孔板上。然后置于37 ℃、含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，用含1%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋不同粒徑的大氣細(xì)顆粒物至1 μg/mL[11]，對(duì)照組用超純水代替大氣細(xì)顆粒物樣品。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別進(jìn)行細(xì)胞存活率和細(xì)胞膜損傷試驗(yàn)。由于粒徑為0.030～0.060、>0.060～0.108 μm的細(xì)顆粒物較少，本研究將兩個(gè)粒徑范圍的樣品合并后用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

細(xì)胞存活率試驗(yàn)：每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液，于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，常溫放置約10 min，待其充分溶解后，用TECAN Infinite F50型酶標(biāo)儀在570 nm下測(cè)定吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率[12]。

細(xì)胞膜損傷試驗(yàn)：每孔加入26 μL基質(zhì)緩沖液和5 μL輔酶Ⅰ(基質(zhì)緩沖液和輔酶Ⅰ購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，混勻后在37 ℃水浴中加熱15 min，加入2,4-二硝基苯肼25 μL繼續(xù)加熱15 min，再加入0.4 mol/L的NaOH溶液250 μL，混勻后在室溫下放置5 min，用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算乳酸脫氫酶(LDH)釋放量，用于表征細(xì)胞膜損傷程度。

1.4 質(zhì)量控制與質(zhì)量保證(QA/QC)

采樣期間共做了5次全流程空白，均符合QA/QC要求。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，相對(duì)偏差均小于5%。每次進(jìn)行樣品測(cè)定前重新校正標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，樣品測(cè)試過(guò)程中每20個(gè)樣品測(cè)定1次標(biāo)準(zhǔn)溶液?？瞻准訕?biāo)回收實(shí)驗(yàn)，除萘(58.7%)回收率略低外，其余15種PAHs在80%～110%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8%，但均符合QA/QC要求?；厥章手甘疚锏幕厥章蕿?4.6%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，符合QA/QC要求。目標(biāo)化合物的定量經(jīng)內(nèi)標(biāo)物六甲基苯校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 PAHs總濃度的粒徑分布

采樣期間，杭州市某商住區(qū)冬春兩季16種PAHs總濃度的粒徑分布如圖1所示。由圖1可知，不同粒徑的大氣細(xì)顆粒物中16種PAHs的總質(zhì)量濃度冬季為2.28～4.38 ng/m3，春季為0.45～1.05 ng/m3，冬季明顯高于春季。經(jīng)方差分析，冬春各個(gè)季節(jié)內(nèi)不同粒徑范圍的大氣細(xì)顆粒物PAHs濃度分布并無(wú)顯著差異(P>0.05)。這是由于杭州市受亞熱帶季風(fēng)氣候的影響，四季分明。據(jù)統(tǒng)計(jì)，杭州市冬季平均氣溫為7.3 ℃，春季為17.2 ℃。冬季氣溫較低，更易于產(chǎn)生逆溫天氣，污染物難以擴(kuò)散，而春季大氣對(duì)流活動(dòng)增強(qiáng)，有利于污染物擴(kuò)散。

圖1 PAHs總質(zhì)量濃度在大氣細(xì)顆粒物中的粒徑分布Fig.1 Size distribution of PAHs’ total concentrations in fine atmospheric particulate matter

圖2 PAHs環(huán)數(shù)在大氣細(xì)顆粒物中的粒徑分布Fig.2 Size distribution of PAHs’ aromatic rings in fine atmospheric particulate matter

2.2 PAHs環(huán)數(shù)的粒徑分布

杭州市大氣細(xì)顆粒物中PAHs環(huán)數(shù)的粒徑分布如圖2所示。冬春兩季PAHs環(huán)數(shù)粒徑分布特征基本一致，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)大致呈現(xiàn)出4環(huán)>5環(huán)>3環(huán)>6環(huán)>2環(huán)。4環(huán)PAHs在不同粒徑的大氣細(xì)顆粒物中所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)冬季為37.99%～63.11%、春季為35.06%～46.11%，5環(huán)PAHs冬季為16.41%～29.45%、春季為21.18%～43.61%。一般情況下，低環(huán)(2環(huán)和3環(huán))的PAHs容易揮發(fā)，顆粒物中含量較小，主要以氣態(tài)形式存在于大氣中；4環(huán)PAHs為半揮發(fā)性有機(jī)物，在氣態(tài)和顆粒物中都有存在；而高環(huán)(5環(huán)和6環(huán))的PAHs揮發(fā)性較差，主要吸附在大氣顆粒物的表面[13]。高環(huán)的PAHs比低環(huán)PAHs有更強(qiáng)的致癌性，對(duì)人體健康危害更大[14]。

2.3 大氣細(xì)顆粒物中PAHs來(lái)源分析

除少數(shù)PAHs由動(dòng)植物合成外，大部分PAHs來(lái)源于化石燃料和生物質(zhì)的燃燒、機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放等。由于燃料種類(lèi)和燃燒條件的不同，生成的PAHs種類(lèi)和相對(duì)含量也有差別。對(duì)PAHs進(jìn)行來(lái)源分析時(shí)，特征比值法應(yīng)用比較廣泛。本研究亦采用特征比值法進(jìn)行大氣細(xì)顆粒物中PAHs的來(lái)源解析。前人在總結(jié)大量PAHs源數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，分析得出了蒽/(蒽+菲)、熒蒽/(熒蒽+芘)、苯并[a]蒽/(苯并[a]蒽+)、茚苯[1,2,3-cd]芘/(茚苯[1,2,3-cd]芘+苯并[g,h,i]苝)、芘/苯并[a]芘的判定依據(jù)[15-17]。

對(duì)不同粒徑的大氣細(xì)顆粒物中PAHs進(jìn)行特征比值分析，結(jié)果如表1所示?？傮w而言，杭州市冬春兩季大氣細(xì)顆粒物中PAHs主要來(lái)源于燃燒源和機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放。這符合杭州市及周邊城市機(jī)動(dòng)車(chē)保有量較大、燃煤鍋爐未全面淘汰或未改造完成的現(xiàn)狀。

事實(shí)上，PAHs的環(huán)數(shù)就能間接反映污染物的來(lái)源。通常，2～4環(huán)PAHs主要來(lái)源于機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放，而5～6環(huán)PAHs多來(lái)源于燃燒源。從圖2同樣可以看出，杭州市大氣細(xì)顆粒物中PAHs的來(lái)源為燃燒源和機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放的綜合污染。

2.4 細(xì)胞毒性研究

細(xì)胞存活率試驗(yàn)結(jié)果如圖3(a)所示，當(dāng)大氣細(xì)顆粒物粒徑為0.030～0.400 μm時(shí)，細(xì)胞存活率明顯低于粒徑為>0.400～2.500 μm時(shí)，說(shuō)明大氣細(xì)顆粒物粒徑越小，其細(xì)胞毒性越強(qiáng)。

此外，本研究通過(guò)測(cè)定細(xì)胞上清液中LDH釋放量來(lái)間接反映細(xì)胞膜的受損程度，試驗(yàn)結(jié)果如圖3(b)所示。LDH釋放量隨粒徑增大而降低。當(dāng)顆粒物粒徑為>1.600～2.500 μm時(shí)，LDH釋放量最低，為755 U/L；顆粒物粒徑為0.030～0.108 μm時(shí)，LDH釋放量最高，為840 U/L。這表明，大氣細(xì)顆粒物能夠引起細(xì)胞膜的損傷，并且損傷的程度與顆粒物的粒徑有關(guān)，顆粒物的粒徑越小對(duì)細(xì)胞膜的損傷越大[18-19]。

表1 不同粒徑大氣細(xì)顆粒物中PAHs的特征比值

注：1)≤0.1來(lái)源于成巖作用，>0.1來(lái)源于燃燒源；2)<0.20主要來(lái)源于成巖作用，0.22～0.55主要來(lái)源于汽油燃燒，0.38～0.64主要來(lái)源于柴油燃燒，>0.50主要來(lái)源于煤燃燒；3)<0.4來(lái)源于成巖作用，0.4～0.5來(lái)源于石油燃燒，>0.5來(lái)源于煤/生物質(zhì)燃燒；4)<0.2來(lái)源于成巖作用，0.2～0.5來(lái)源于石油/汽油燃燒，>0.5來(lái)源于煤/生物質(zhì)燃燒；5)<1來(lái)源于非交通源，1～6來(lái)源于機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放。

圖3 細(xì)胞毒性研究結(jié)果Fig.3 Results of cell toxicity

3 結(jié) 論

杭州市某商住區(qū)大氣細(xì)顆粒物中，PAHs總濃度冬季顯著高于春季，但各個(gè)季節(jié)內(nèi)不同粒徑的細(xì)顆粒物中PAHs濃度分布并無(wú)顯著差異。兩個(gè)季節(jié)的PAHs環(huán)數(shù)粒徑分布基本呈現(xiàn)出4環(huán)>5環(huán)>3環(huán)>6環(huán)>2環(huán)。杭州市大氣細(xì)顆粒物中PAHs主要來(lái)源于燃燒源和機(jī)動(dòng)車(chē)尾氣排放。粒徑越小的大氣細(xì)顆粒物對(duì)細(xì)胞的毒性作用越強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞膜損傷程度越大，需要特別關(guān)注。

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SizedistributionandcelltoxicityofpolycyclicaromatichydrocarbonsinfineatmosphericparticulatematterduringwinterandspringinHangzhou

CHENJinyuan，LIUBaichen，HANXiaoqian，ZHOUQinghua.

(CollegeofEnvironment，ZhejiangUniversityofTechnology，HangzhouZhejiang310014)

To investigate the size distribution and main sources of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in fine atmospheric particulate matter in Hangzhou,samples were collected in a commercial and residential area in Hangzhou from December 2015 to May 2016. PAHs were detected using gas chromatography/mass spectrometry. Cell toxicity tests were also conducted. Results showed that total concentrations of PAHs in different size were all higher in winter than in spring. Furthermore,it was found that the size distribution of PAHs’ aromatic rings almost all showed 4-ring > 5-ring > 3-ring > 6-ring > 2-ring. The diagnostic ratios revealed that the PAHs in Hangzhou mainly originated from the pyrogenic sources and vehicle exhaust emission. Finally,it was demonstrated that the finer particulate matter possessed the higher cell toxicity and cytomembrane damage.

fine atmospheric particulate matter; polycyclic aromatic hydrocarbons; size distribution; cell toxicity

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.02.001

2016-12-15)

陳金媛，女，1963年生，博士，教授，主要從事環(huán)境污染化學(xué)及污染毒理學(xué)研究。#

。

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.21177114)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.LZ15B070001)。