朱超英 溫炬 李婷 趙棋楠 秦思 馬靜 鄭榮昌 馮潔瑩

510317廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省第二人民醫(yī)院皮膚科

白細(xì)胞介素36α對小鼠銀屑病樣皮損及趨化因子CCL20的影響

朱超英 溫炬 李婷 趙棋楠 秦思 馬靜 鄭榮昌 馮潔瑩

510317廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省第二人民醫(yī)院皮膚科

目的探討白細(xì)胞介素（IL）36α對小鼠銀屑病樣皮損及CC趨化因子配體20（CCL20）的影響。方法30只BALB/c雌性小鼠分為3組：凡士林空白對照組（對照組）、咪喹莫特模型組（模型組）以及IL?36α實驗組（實驗組）。用小鼠銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度評分（PASI）觀察銀屑病樣小鼠皮損動態(tài)變化。光鏡下觀察皮損組織形態(tài)學(xué)變化，并測量表皮層厚度。用實時熒光定量PCR、Western印跡檢測對照組與模型組小鼠皮損中IL?36α表達(dá)情況，用實時熒光定量PCR、Western印跡法、免疫組化方法檢測小鼠皮損中CCL20的含量變化。結(jié)果模型組皮損中IL?36α mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組（?Ct值分別為0.0195±0.0059、0.0012±0.0004，兩組比較，P＜0.05）；模型組皮損中IL?36α蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組（分別為3.922±0.248、0.690±0.025，兩組比較，P＜0.05）。對照組、實驗組CCL20 mRNA表達(dá)（?Ct值）分別為0.378±0.075、2.152±0.793，與模型組（0.999± 0.178）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、實驗組CCL20蛋白表達(dá)結(jié)果分別為0.025± 0.009、0.397±0.033，與模型組（0.145±0.030）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果表明，實驗組皮損中CCL20的含量較模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.294，P＜0.05）。結(jié)論IL?36α可通過促進(jìn)CCL20表達(dá)，加重銀屑病樣小鼠皮損病變。

銀屑??；疾病模型，動物；趨化因子CCL20；咪喹莫特；白細(xì)胞介素36α

白細(xì)胞介素（IL）36是一種促炎性因子，屬于IL?1家族，由IL?36α、IL?36β及IL?36γ組成，其受體為IL?36R，主要表達(dá)于皮膚組織中，通過與受體結(jié)合，激活絲裂原活蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase p38，MAPK）和核因子κB（NF?κB）信號途徑在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用［1］。既往研究表明，Th17細(xì)胞及其分泌的炎癥因子如，IL?17、IL?22、IL?23直接參與了銀屑病皮損及免疫反應(yīng)，并起到了關(guān)鍵作用［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，IL?36在銀屑病患者皮損及銀屑病動物模型中過度表達(dá)，敲除基因IL?36的咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型比敲除基因IL?17的小鼠表現(xiàn)出更大的治療作用［3?4］。Friedrich等［5］發(fā)現(xiàn)，IL?36是人角質(zhì)形成細(xì)胞分泌CCL20的誘導(dǎo)劑，但對銀屑病的作用缺乏充分研究。本研究以CCL20為靶點，通過咪喹莫特誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠銀屑病樣模型，研究IL?36α對銀屑病樣小鼠皮損中CC趨化因子配體20（CCL20）表達(dá)水平的影響。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

5%咪喹莫特乳膏（艾達(dá)樂，美國3M公司），IL?36α（美國R&D公司，2297?ML）、CCL20單抗（Cat.ab9829，英國abcam公司）、IL?36α抗體（MAB2297，美國RD公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（DBI?2220，美國DBI公司）、熒光定量PCR檢測試劑盒（美國DBI公司）。實驗動物分組及模型的建立。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

二、動物

SPF級雌性BALB/c小鼠30只，6～8周齡，體重18～20 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)（合格證號44002100008294），飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)SPF級動物飼養(yǎng)室，室溫20～24℃，照明時間12 h/d，自由取食。30只小鼠編號后分為3組，每組10只，分別單籠飼養(yǎng)。對照組：凡士林乳膏+皮內(nèi)注射PBS；模型組：咪喹莫特乳膏+皮內(nèi)注射PBS；實驗組：咪喹莫特乳膏+皮內(nèi)注射IL?36α。所有小鼠背部剃毛，面積2 cm×3 cm，外用62.5 mg 5%咪喹莫特乳膏或等量凡士林乳膏，每天1次，連續(xù)8 d；同時皮內(nèi)注射5 μg PBS液或5 μg IL?36α，隔日1次共4次。于第8天取小鼠背部皮損進(jìn)行后續(xù)檢測。

三、方法

1.小鼠銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度評分（PASI）：肉眼觀察并用相機記錄，各組小鼠皮損紅斑、鱗屑及浸潤增厚分別評分。PASI評0～4分：無計0，輕度計1，中度計2，重度計3，極重度計4。3種積分相加得到總分。各組積分取平均值繪制積分趨勢曲線。

2.組織病理學(xué)觀察：取背部皮損組織1cm×1cm，4%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片并行HE染色。顯微鏡下觀察皮損增厚程度、炎癥細(xì)胞浸潤情況等，并繪制皮損增厚柱狀圖。

3.皮損中IL?36α、CCL20的實時定量PCR檢測：取-70℃凍存組織，加入TRIzol Reagent進(jìn)行勻漿處理，提取樣本中總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。實時熒光定量PCR儀擴(kuò)增，引物序列如下：CCL20：F：5′?AGAGCTATTGTGGGTTTCAC?3′，R：5′?TCTTCTTGACTCTTAGGCTG?3′；IL?36α：F：5′?ACCT CTACATTTGAGTCTGC?3′，R：5′?GATGAAGATTTCC CCCAGTT?3′；GAPDH：F：5′?AGGTCGGTGTGAACG GATTTG?3′，R：5′?TGTAGACCATGTAGTTGAGGTC A?3′。擴(kuò)增程序：95℃10 min，95℃10 s、60℃30 s共45個循環(huán)。用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

4.皮損中IL?36α、CCL20的免疫印跡法檢測：RIPA裂解液提取皮膚組織蛋白，BCA蛋白定量試劑測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，轉(zhuǎn)NC膜，經(jīng)3%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h后，稀釋一抗（1∶1 000）4℃過夜，加入1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，ECL顯色，β肌動蛋白為內(nèi)參照。ImageJ圖像分析系統(tǒng)分析條帶的吸光度（A值），以相對A值代表蛋白的表達(dá)量，相對A值=（目的蛋白A值/β肌動蛋白A值）× 100%。

5.皮損中CCL20的免疫組化檢測：石蠟切片脫蠟、水化，抗原修復(fù)，滴加一抗（1∶100）4℃孵育過夜，滴加二抗（1∶1 000）4℃孵育50 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，同步設(shè)立陰性對照。結(jié)果判定：胞質(zhì)、胞核內(nèi)出現(xiàn)淡棕色、淡褐色、棕色、棕褐色以及褐色顆粒為陽性染色。采取雙盲法，每張切片在高倍鏡（×400）下由兩位獨立觀察者隨機觀察5個視野。根據(jù)切片染色的強度及其中陽性細(xì)胞所占百分比綜合評分。陽性細(xì)胞0～5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。染色強度計分：無著色計0分，淡褐色計1分，棕色計2分，棕褐色計3分。兩項相加為綜合積分：0分為（-），1～3分為弱陽性（+），4～5分為（++），6～7分為（+++）。

結(jié)果

一、臨床表現(xiàn)

對照組小鼠背部皮膚未見明顯異常；模型組第2天背部皮膚為淡紅色，第3天出現(xiàn)紅斑、少許鱗屑，隨后皮膚逐漸出現(xiàn)皺褶、增厚，第4～6天紅斑、鱗屑持續(xù)增多，第7、8天呈典型銀屑病樣改變，第8天部分小鼠開始出現(xiàn)脫屑，可見薄膜現(xiàn)象及點狀出血；實驗組從第4～8天起出現(xiàn)的紅斑、增厚、鱗屑較模型組明顯加重（圖1）。各組PASI評分見圖2。

圖1 小鼠背部銀屑病樣皮損形態(tài)學(xué)觀察（第8天） 1A：對照組小鼠皮膚未見明顯異常；1B：模型組小鼠出現(xiàn)典型的紅斑、鱗屑、增厚；1C：實驗組小鼠出現(xiàn)的紅斑、鱗屑、增厚較模型組明顯

圖2 3組小鼠背部皮膚銀屑病嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評分隨時間變化的比較 對照組：凡士林乳膏+皮內(nèi)注射PBS；模型組：咪喹莫特乳膏+皮內(nèi)注射PBS；實驗組：咪喹莫特乳膏+皮內(nèi)注射IL?36α

二、組織病理學(xué)表現(xiàn)

HE染色顯示，第8天，對照組小鼠皮膚未見異常；模型組皮損呈銀屑病樣改變，表皮明顯增厚，可見角化不全及Muro微膿腫，棘層增厚明顯，表皮突延長，皮下可見炎癥細(xì)胞浸潤；實驗組各層改變均較模型組明顯，炎癥細(xì)胞浸潤更明顯（圖3）。測量表皮垂直厚度，對照組為（9.804±1.682）μm，模型組為（68.383±2.499）μm，實驗組為（98.519± 3.442）μm，實驗組與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 22.406，P＜0.05）。

圖3 小鼠背部銀屑病樣皮損組織病理（HE×100） 3A：對照組未見皮膚異常；3B：模型組可見角化不全、角質(zhì)層增厚、棘層增厚明顯、表皮突延長，類似銀屑病樣病理變化；3C：實驗組表皮增厚、角化不全、炎癥細(xì)胞浸潤較模型組明顯

三、皮損中 IL?36α mRNA及蛋白表達(dá)水平

模型組IL?36α mRNA的表達(dá)（0.020±0.006）顯著高于對照組（0.001± 0.001，t=7.523，P＜0.05）。免疫印跡結(jié)果顯示，模型組小鼠皮損中IL?36α的蛋白表達(dá)（3.922±0.248）較對照組（0.690±0.025）增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=31.695，P＜0.05）。見圖4。

四、皮損中CCL20 mRNA及蛋白表達(dá)水平

實時定量PCR結(jié)果示，實驗組皮損中CCL20 mRNA表達(dá)（2.152±0.793）高于模型組（0.999± 0.178），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.478，P＜0.05），模型組高于對照組（0.378±0.075）（t=10.152，P＜0.05）。免疫印跡結(jié)果顯示，實驗組（0.397±0.033）皮損中CCL20的蛋白表達(dá)高于模型組（0.145± 0.030），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.692，P＜0.05），模型組高于對照組（0.025±0.009）（t=11.912，P＜0.05）。見圖5。

五、皮損中CCL20免疫組化

圖4 Westerm印跡檢測IL?36α蛋白的表達(dá) 1：對照組；2：模型組

圖5 Westerm印跡檢測CCL20蛋白的表達(dá) 1：對照組；2：模型組；3：實驗組

對照組小鼠僅少量或者不表達(dá)CCL20；模型組著色細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量增多，廣泛表達(dá)于表皮及真皮；實驗組著色細(xì)胞數(shù)量顯著高于模型組，CCL20染色呈棕褐色，分布于真皮及表皮層（圖6）。采用非參數(shù)檢驗，實驗組、對照組與模型組間表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

圖6 CCL20在小鼠銀屑病樣皮損中的表達(dá)（SP×200） 6A：對照組CCL20表達(dá)呈弱陽性，位于表皮層；6B：模型組CCL20表達(dá)呈陽性，主要位于表皮層；6C：實驗組CCL20表達(dá)呈強陽性，主要位于表皮層

討論

IL?36在多種疾病中過表達(dá)，如銀屑病、干燥綜合征、炎癥性腸病、腫瘤等［6?10］。IL?17/IL?23軸被認(rèn)為在銀屑病中起主要作用［11］，最新研究發(fā)現(xiàn)，IL?36炎癥通路強于該軸在銀屑病中的作用，通過構(gòu)建敲除基因IL?23、IL?17、IL?22、IL?36的咪喹莫特銀屑病小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除基因IL?36的小鼠銀屑病皮損較敲除基因IL?23、IL?17、IL?22小鼠輕［4］，腹腔注射IL?36抗體的小鼠可以使銀屑病小鼠皮損減輕［12］，提示IL?36可能在銀屑病中起重要作用。本實驗分別用實時定量PCR及免疫印跡法檢測對照組與模型組小鼠皮損中IL?36α的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組中IL?36α的表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），表明IL?36α可能在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中起重要作用。

咪喹莫特是一種免疫激活劑，通過激活Toll樣受體，刺激小鼠產(chǎn)生銀屑病樣皮損，如紅斑、鱗屑、角質(zhì)形成細(xì)胞增生以及大量炎癥細(xì)胞浸潤等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于銀屑病研究［13］。本實驗通過直觀現(xiàn)象、PASI評分及HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組與實驗組均出現(xiàn)了明顯的紅斑、鱗屑、增厚現(xiàn)象，并伴有角質(zhì)層、棘細(xì)胞層增厚以及顆粒層消失，而對照組未見明顯異常，表明實驗小鼠造模成功。既往研究發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)注射IL?36α的小鼠背部皮膚出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤［14］，氣管內(nèi)灌注IL?36α的小鼠，肺部出現(xiàn)大量趨化因子、腫瘤壞死因子（TNF）等炎癥因子［15］，我們通過HE染色發(fā)現(xiàn)，實驗組較模型組炎癥反應(yīng)更為嚴(yán)重，表明IL?36α可以加重銀屑病小鼠的炎癥反應(yīng)。趨化因子是一組具有趨化作用的細(xì)胞因子，能吸引免疫細(xì)胞到免疫應(yīng)答局部，參與免疫反應(yīng)。CCL20作為β趨化因子家族中一員，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞分泌，研究表明，銀屑病皮損中CCL20的表達(dá)與銀屑病的嚴(yán)重程度相關(guān)，并且受多種細(xì)胞因子的影響如TNFα、IL?1β、IL?17等［16］。目前已經(jīng)證實，CCL20對樹突細(xì)胞和T細(xì)胞有定向遷移作用，作為CCL20的唯一配體，CCR6主要表達(dá)于Th17細(xì)胞，而

表1 小鼠銀屑病樣皮損CCL20的表達(dá)強度

注：對照組比模型組Z=3.801，P＜0.05；模型組比實驗組Z= 2.294，P＜0.05。對照組：凡士林乳膏+皮內(nèi)注射PBS；模型組：咪喹莫特乳膏+皮內(nèi)注射PBS；實驗組：咪喹莫特乳膏+皮內(nèi)注射IL?36α CCR6的表達(dá)與IL?17的產(chǎn)生呈正相關(guān)［17］。已有研究發(fā)現(xiàn)，IL?36可以促進(jìn)Th17細(xì)胞活化，分泌更多IL?17［5］，Tortola等［4］研究發(fā)現(xiàn)，IL?36通過活化樹突細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)CCL20的分泌。本實驗通過實時熒光定量PCR和Western印跡，分別從mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測CCL20，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組與實驗組CCL20的表達(dá)量均明顯升高，其中實驗組表達(dá)量較模型組更明顯，表明IL?36α可以促進(jìn)銀屑病小鼠CCL20的表達(dá)。另外，本研究采用免疫組化發(fā)現(xiàn)，空白對照組僅少量表達(dá)CCL20，模型組與實驗組著色細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量較空白對照組增多，其中實驗組著色細(xì)胞數(shù)量顯著高于模型組，模型組和實驗組小鼠CCL20主要表達(dá)于表皮層，且實驗組、對照組與模型組間在CCL20表達(dá)方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，模型組皮損中IL?36α的表達(dá)較對照組增加，提示IL?36α可能參與銀屑病的發(fā)病機制；皮內(nèi)注射IL?36α不僅可以加重銀屑病樣小鼠皮損改變，還可促進(jìn)咪喹莫特銀屑病樣小鼠CCL20的表達(dá)，提示IL?36α可能通過促進(jìn)CCL20的表達(dá)而參與銀屑病的發(fā)生與發(fā)展。本研究僅僅對IL?36α因子進(jìn)行了初步探索，未對其抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外，IL?36家族對銀屑病其他相關(guān)協(xié)同因子、信號通路以及與Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL?17在銀屑病作用中的比較尚未進(jìn)行研究，這些亦是我們下一步要研究的課題。

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Effects of interleukin?36α on psoriasiform skin lesions and C?C motif chemokine ligand 20 expression in mice

Zhu Chaoying,Wen Ju,Li Ting,Zhao Qinan,Qin Si,Ma Jing,Zheng Rongchang, Feng Jieying
Department of Dermatology,Guangdong No.2 Provincial People′s Hospital,Affiliated to Southern Medical

Wen Ju,Email:wenju3139@163.com

ObjectiveTo evaluate effects of interleukin?36α（IL?36α）on psoriasiform skin lesions and C?C motif chemokine ligand 20（CCL20）expression in mice.MethodsTotally,30 BALB/c female mice were randomly and equally divided into 3 groups:control group treated with topical vaseline cream on the shaved back and intracutaneous injection with phosphate buffer saline（PBS）,model group treated with topical imiquimod cream on the shaved back and intracutaneous injection with PBS, experimental group treated with topical imiquimod cream on the shaved back and intracutaneous injection with IL?36α solution.Psoriasis area severity index（PASI）was used to evaluate changes of psoriasiform skin lesions in mice,and light microscopy to observe morphological changes of skin lesions and to measure the thickness of the epidermis.Real?time fluorescence?based quantitative PCR（qRT?PCR）and Western blot analysis were performed to determine the expression of IL?36α in skin lesions in the control group and model group,and qRT?PCR,Western blot analysis and immunohistochemical study to evaluate changes of CCL20 levels in skin lesions.ResultsThe model group showed significantly increased mRNA（?Ct value:0.0195±0.0059）and protein expression（3.922±0.248）of IL?36α compared with the control group（mRNA:0.0012±0.0004,P＜0.05;protein:0.690±0.025,P＜0.05）.The mRNA and protein expression of CCL20 were significantly higher in the experimental group than those in the model group（mRNA:2.152± 0.793vs.0.999±0.178;protein:0.397±0.033vs.0.145±0.030;bothP＜0.05）,and higher in the model group than those in the control group（mRNA:0.378±0.075;protein:0.025±0.009;bothP＜0.05）. Immunohistochemical study showed that the expression intensity of CCL20 in skin lesions significantly increased in the experimental group compared with that in the model group（Z=2.294,P＜0.05）.ConclusionIL?36α may aggravate psoriasiform skin inflammation in mice by promoting CCL20 expression.

Psoriasis;Disease models,animal;Chemokine CCL20;Imiguimod;Interleukin?36α

溫炬，Email：wenju3139@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.04.007

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20141008）

University,Guangzhou 510317,China

Fund program:Traditional Chinese Medicine Bureau Foundation of Guangdong Province（20141008）

2016?08?08）

（本文編輯：吳曉初）