曲仕浩，徐楗熒，羅英，陳取欣

（1.廣東省珠海市婦幼保健院 泌尿外科，廣東 珠海 519000；2.廣東省陽江市婦幼保健院 普外科，廣東 陽江 529500）

不同程度精索靜脈曲張不育患者精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)后精子DNA碎片分析

曲仕浩1，徐楗熒1，羅英1，陳取欣2

（1.廣東省珠海市婦幼保健院 泌尿外科，廣東 珠海 519000；2.廣東省陽江市婦幼保健院 普外科，廣東 陽江 529500）

目的分析不同程度精索靜脈曲張（VC）不育患者行精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)后精子DNA碎片的情況。方法不同程度VC不育患者57例。其中，診斷為2級(jí)患者27例，3級(jí)患者30例。所有患者行精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)前1個(gè)月及術(shù)后3個(gè)月檢測(cè)并計(jì)算精子DNA碎片指數(shù)（DFI）。結(jié)果57例VC不育患者均行腹腔鏡雙側(cè)精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)。VC 2級(jí)和3級(jí)患者行手術(shù)治療后精子DFI與術(shù)前比較均值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療前VC 2級(jí)和3級(jí)不育患者精子DFI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后2級(jí)患者精子DFI低于3級(jí)患者（P＜0.05），DFI改善情況優(yōu)于3級(jí)患者（P＜0.05）。結(jié)論腹腔鏡精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)能夠改善VC不育患者精子DNA碎片情況，對(duì)于2級(jí)患者效果更佳。

精索靜脈曲張；精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)；精子DNA碎片；不育

精索靜脈曲張（varicocle，VC）是指精索內(nèi)蔓狀靜脈叢的異常伸長(zhǎng)、擴(kuò)張和迂曲。多見于青壯年，發(fā)病率約占男性人群的10.0%～15.0%；在不育男性中發(fā)病率為25.0%～40.0%，是引起男性不育癥的主要病因之一[1-2]。研究顯示[3-5]，VC引起睪丸局部溫度增高，氧自由基（reactive oxygen species，ROS）過多和抗氧化酶的平衡失調(diào)，造成精子DNA單鏈和雙鏈的斷裂，導(dǎo)致精子DNA碎片增多而影響男性生育。精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）是一個(gè)穩(wěn)定性高的指標(biāo)，VC患者的精子活動(dòng)力密度和形態(tài)分析可在正常范圍，但是精子DFI明顯高于正常。20世紀(jì)90年代開始腹腔鏡下進(jìn)行精索內(nèi)靜脈高位結(jié)扎手術(shù)，手術(shù)創(chuàng)傷小、療效好、恢復(fù)快，目前已廣泛應(yīng)用于臨床[6-7]。本研究分析不同程度VC不育患者行精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)后精子DNA碎片的情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年2月-2016年8月在珠海市婦幼保健院和陽江市婦幼保健院就診的VC不育患者共57例。診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：按照《2014版中國(guó)泌尿外科臨床診斷治療指南》將精索靜脈曲張分為4級(jí)。0級(jí)：未表現(xiàn)出VC癥狀，Valsalva試驗(yàn)未出現(xiàn)，經(jīng)彩色多普勒檢查發(fā)現(xiàn)輕微的VC，靜脈管徑超過1.8 mm；1級(jí)：觸診不明顯，但Valsalva試驗(yàn)時(shí)可出現(xiàn)；2級(jí)：在觸診時(shí)極易觸及擴(kuò)張靜脈，但肉眼不能看見；3級(jí)：患者站立時(shí)肉眼能看到擴(kuò)張靜脈在陰囊皮膚突現(xiàn)，如團(tuán)狀蚯蚓，容易觸摸到。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前檢查DFI＞20.0%；②至少一側(cè)為2級(jí)及以上VC；③不育年限≥2年；④無其他不育原因。依據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入本研究的VC 2級(jí)患者27例，年齡（32.6±4.9）歲，不育年限（3.3±1.5）年；VC 3級(jí)患者30例，年齡（33.7±6.5）歲，不育年限（3.8±1.8）年。兩組患者年齡及不育年限比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者均無家族遺傳病史，無其他內(nèi)、外科疾病及手術(shù)禁忌。

1.2 手術(shù)方法

所有患者均行腹腔鏡雙側(cè)精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)。術(shù)前常規(guī)留置導(dǎo)尿管，取平臥位，行氣管插管全身麻醉。麻醉滿意后，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒、鋪巾。于臍下緣作一長(zhǎng)約1.5 cm切口，置入氣腹針，注入二氧化碳CO2氣體建立氣腹，設(shè)定腹腔壓力13～15 mmHg。取15°頭低腳高位，于臍下緣切口置入Trocar后進(jìn)入腹腔鏡，接監(jiān)視器，觀察雙側(cè)腹膜后精索靜脈，于左、右側(cè)髂前上棘與臍連線中點(diǎn)分別作一長(zhǎng)約0.5 cm切口并置入Trocar，距內(nèi)環(huán)口約3.0 cm處將腸管推向近心端，充分暴露術(shù)野，用雙極電凝鉤切開曲張靜脈表面后腹膜，分離出精索動(dòng)脈后，充分游離曲張的精索靜脈并用4號(hào)絲線于近心端及遠(yuǎn)心端分別將其結(jié)扎，觀察術(shù)野無出血后，退出腹腔鏡，將CO2氣體充分釋放，術(shù)后4 h拔除尿管自行排尿。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

應(yīng)用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法（sperm nucleus DNA kit，SCD）檢測(cè)精子核DNA完整性，試劑盒購(gòu)自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。步驟簡(jiǎn)述如下：①試劑盒取出放置室溫平衡30～60 min，將低熔點(diǎn)瓊脂糖管的凝膠完全熔解備用；②用精子稀釋液將精液密度調(diào)至5～10×106/ml，取60μl稀釋的精液標(biāo)本加入到低熔點(diǎn)瓊脂糖管中混勻；③將含有精子的低熔點(diǎn)瓊脂糖懸浮液取出30μl滴加到載玻片，蓋上蓋玻片；④將預(yù)處理后的載玻片置入4℃冰箱冷卻4 min，移走蓋玻片，迅速將預(yù)處理的載玻片放入變性液中7 min，蒸餾水中浸泡5 s，再浸入裂解液中反應(yīng)20 min；⑤反應(yīng)完畢，將預(yù)處理的載玻片浸入洗滌液3 min，再依次浸入70%乙醇、90%乙醇、無水乙醇溶液中脫水各2 min；⑥將預(yù)處理的載玻片自然晾干后用瑞氏染色劑進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察。

精子DNA碎片結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)暈環(huán)與精子頭部直徑比例，分為大暈環(huán)精子（單側(cè)暈環(huán)寬度≥2/3精子頭部最小直徑）、中暈環(huán)精子（1/4精子頭部最小直徑＜單側(cè)暈環(huán)寬度≤2/3 精子頭部最小直徑）、小暈環(huán)精子（單側(cè)暈環(huán)寬度≤1/4精子頭部最小直徑）、無暈環(huán)精子以及退化精子。精子DFI計(jì)算公式[9]：DFI=（小暈環(huán)精子＋無暈環(huán)精子＋退化精子）/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100.0%。

1.4 療效評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

所有患者均于行精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)前1個(gè)月及術(shù)后3個(gè)月檢測(cè)DFI，以精子DFI改善率評(píng)價(jià)療效。DFI改善率[10]=[（治療前DFI-治療后DFI）/（治療前DFI-23.0%）]×100.0%。治療后改善率＜30.0%為無效，30.0%≤改善率＜60.0%為有效，60.0%≤改善率＜90.0%為顯效，DFI≤23.0%或改善率≥90.0%為治愈。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間正態(tài)分布資料比較用兩樣本t檢驗(yàn)，同級(jí)手術(shù)前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，兩組間比較用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

57例VC不育患者均行腹腔鏡雙側(cè)精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)，鏡下觀察精子核DNA完整性（附圖），評(píng)判精子DNA碎片結(jié)果并計(jì)算DFI。2級(jí)和3級(jí)患者行手術(shù)治療后精子DFI與術(shù)前比較均值降低，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。治療前VC 2級(jí)和3級(jí)不育患者精子DFI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后2級(jí)患者精子DFI低于3級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。治療后2級(jí)患者精子DFI改善情況優(yōu)于3級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

附圖 精子核DNA完整性Attached fig. Sperm nucleus DNA integrity

表1 不同程度VC不育患者手術(shù)治療前后精子DFI比較 （%，±s）Table 1 Comparison of sperm DFI before and after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility （%，±s）

表1 不同程度VC不育患者手術(shù)治療前后精子DFI比較 （%，±s）Table 1 Comparison of sperm DFI before and after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility （%，±s）

組別 治療前精子DFI 治療后精子DFI t值 P值2級(jí)（n =27） 37.0±7.6 26.9±5.9 12.75 0.000 3級(jí)（n =30） 37.5±6.9 30.7±6.4 14.95 0.000 t值 0.28 2.29 P值 0.782 0.026

表2 不同程度VC不育患者手術(shù)治療后精子DFI改善情況分析 例（%）Table 2 Improvement of sperm DFI after surgical treatment in patients with different degrees of VC infertility n（%）

3 討論

目前常規(guī)精液分析不能全面評(píng)估男性的生育能力，而精子DNA碎片化程度被認(rèn)為是一個(gè)新的預(yù)測(cè)生育能力的指標(biāo)，間接反映精子遺傳物質(zhì)的完整性，與生育能力呈負(fù)相關(guān)，且不隨季節(jié)發(fā)生變化[11-12]。目前所應(yīng)用的判定方法是觀察特征性的光暈，沒有DNA碎片的精子在經(jīng)過酸變性和去掉核蛋白后DNA擴(kuò)散形成光暈，而帶有DNA碎片化的精子不會(huì)產(chǎn)生這種光暈，根據(jù)光暈的有無和大小判斷精子DNA碎片化的程度。

精子DNA碎片化發(fā)生機(jī)制：①精子發(fā)生過程中異常染色質(zhì)包裝：染色質(zhì)是由一條DNA分子纏繞無數(shù)核小體核心而連成一條串珠樣長(zhǎng)鏈形成的核蛋白纖維。精子發(fā)生過程中染色質(zhì)核蛋白經(jīng)歷了從組蛋白-過渡蛋白-魚精蛋白的轉(zhuǎn)變，魚精蛋白對(duì)于維持精子正常形態(tài)和DNA完整性起到至關(guān)重要的作用，其含量與精子DFI呈負(fù)相關(guān)[13]。魚精蛋白自身缺陷或功能異常，精子染色質(zhì)濃縮過程異常，導(dǎo)致精子DFI指數(shù)升高。而且，內(nèi)源性核酸酶在精子發(fā)生過程中也參與了染色質(zhì)的組裝[14]；②ROS增多：精子DNA對(duì)ROS極為敏感，生理濃度的ROS有利于精子的受精，ROS過多和抗氧化酶的平衡失調(diào)，會(huì)造成精子DNA單鏈和雙鏈的斷裂，導(dǎo)致精子DNA損傷[15]。受損傷的精子DNA更容易受到ROS的攻擊，形成惡性循環(huán)，最終使精子DNA損傷逐漸加重，畸形精子增加影響男性生育。研究顯示[16]，不育癥患者精液中ROS水平及精子DNA損傷的程度明顯高于正常人。而且，精液中異常增多的白細(xì)胞也可以誘導(dǎo)精子產(chǎn)生過量的ROS，損傷精子DNA結(jié)構(gòu)的完整性；③凋亡異常：凋亡是細(xì)胞死亡方式中的一種，是指細(xì)胞的程序化死亡。在一定的生理和病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自動(dòng)結(jié)束其生命的過程，F(xiàn)as、Bcl-x和p53是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要基因[17]。當(dāng)控制凋亡的基因異常表達(dá)，細(xì)胞凋亡發(fā)生異常，不能及時(shí)去除DNA受損的精子，導(dǎo)致精子DNA碎片化。而且，精子DNA損傷影響精子密度，這部分精子比例增高時(shí)精子密度降低，精子的質(zhì)量也受到影響，引起受精功能障礙及胚胎發(fā)育異常等，導(dǎo)致男性不育[18]。

目前，已公認(rèn)VC可影響男性生育，但其病理和生理機(jī)制尚未十分明確。VC引起精索靜脈內(nèi)血液滯留，睪丸局部缺氧、代謝性酸中毒、無氧酵解增強(qiáng)，腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）被分解為次黃嘌呤，并在黃嘌呤氧化酶的作用下產(chǎn)生ROS。VC患者睪丸組織中存在高水平的脂質(zhì)過氧化，ROS的過度產(chǎn)生導(dǎo)致精子DNA碎片增多，引起不育[19]。而且，VC也會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡異常及精子凋亡相關(guān)表型增加，包括精子質(zhì)膜磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻、線粒體功能障礙及精子DNA損傷[20]。研究顯示[21]，VC患者行精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)能改善精液質(zhì)量和睪丸容積，精液參數(shù)明顯改善，精子DNA碎片明顯減少，精子DFI降低后能夠有效提高女方受孕率。本研究顯示，2級(jí)和3級(jí)精索靜脈曲張不育患者術(shù)前存在不同程度的精子DNA碎片，行腹腔鏡精索靜脈高位結(jié)扎術(shù)后精子DFI降低，精子DNA碎片情況得到改善。與3級(jí)VC不育患者比較，2級(jí)患者治療效果更為顯著。

本研究存在的不足之處：①常規(guī)精液分析是用于判斷男性生育力最基本的臨床指標(biāo)，但是部分患者手術(shù)前的精液分析是正常的，本研究未對(duì)患者行手術(shù)治療前后精液常規(guī)的比較；②VC 1級(jí)患者無臨床不適癥狀，即使已影響生育，能夠接受腹腔鏡手術(shù)的患者較少，所以本研究未納入此部分患者；③由于進(jìn)行研究的時(shí)間短，樣本量較少，后續(xù)需擴(kuò)大樣本量；④評(píng)價(jià)VC不育患者手術(shù)治療效果具有社會(huì)價(jià)值的方法是女方妊娠情況，對(duì)于妊娠率、胎兒畸形率及新生兒活產(chǎn)率等觀察指標(biāo)，已納入后續(xù)的研究中。

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Analysis of the sperm DNA fragmentation in different degrees of varicocele infertility patients after high ligation of the spermatic vein

Shi-hao Qu1, Jian-ying Xu1, Ying Luo1, Qu-xin Chen2
(1.Department of Urology, Zhuhai Maternal and Children’s Hospital, Zhuhai, Guangdong 519000,China; 2.Department of General Surgery, Yangjiang Maternal and Children’s Hospital,Yangjiang, Guangdong 529500, China)

ObjectiveTo analyze the sperm DNA fragmentation in different degrees of varicocele (VC)infertility patients after high ligation of the spermatic vein.MethodsThere were 57 patients with different degrees of VC infertility patients. 27 patients had been diagnosed with level two VC, and 30 patients had been diagnosed with level three VC. All patients’ sperm DNA fragmentation index (DFI) were detected and calculated at preoperative one month and postoperative three months.Results57 VC infertility patients were all suffered from laparoscopic high ligation of the spermatic vein on both sides. There was no statistically difference on preoperative sperm DFI between level two and level three patients (P＞ 0.05). All patients’ sperm DFI were decreased after laparoscopic (P＜ 0.05), and level two VC infertility patients had signi fi cant greater progress than level three patients(P＜ 0.05).ConclusionLaparoscopic high ligation of the spermatic vein can effectively improve VC infertility patients sperm DFI. It would be better for level two VC infertility patients.

varicocle; high ligation of the spermatic vein; sperm DNA fragmentation; infertility

R697.24

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2017.08.013

1007-1989（2017）08-0061-05

2016-12-19

徐楗熒，E-mail：qsh0601@sohu.com

（吳靜 編輯）