唐小龍，羅旭，陳波，王小林，楊宋琪，陳海燕，柯瀟

（四川濟(jì)生堂藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

不同產(chǎn)地貫葉金絲桃高效液相色譜指紋圖譜研究

唐小龍，羅旭，陳波，王小林，楊宋琪，陳海燕，柯瀟

（四川濟(jì)生堂藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

目的建立貫葉金絲桃的高效液相色譜指紋圖譜分析方法。方法以高效液相色譜法對(duì)12批次不同產(chǎn)地貫葉金絲桃藥材的指紋圖譜進(jìn)行分析，采用金絲桃苷對(duì)照品進(jìn)行峰指認(rèn)，從相似度、相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積方面進(jìn)行指紋圖譜分析。結(jié)果12批次貫葉金絲桃藥材的相似度均大于0.900。結(jié)論該方法簡便、可行，能有效指導(dǎo)貫葉金絲桃藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

貫葉金絲桃；指紋圖譜；高效液相色譜法

貫葉金絲桃來源于藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分，性平，味辛、苦澀，具有疏肝解郁、清熱利濕、消腫通乳的功效。貫葉金絲桃主要分布于甘肅、新疆等地，主要含有萘并二蒽酮類、間苯三酚類、黃酮類、雙黃酮類、苯丙烯酸類和花青素等成分，還含有少量的單寧酸、氧雜蒽酮、揮發(fā)油和氨基酸等[1－4]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法，建立了一種新的指紋圖譜分析法，并對(duì)不同產(chǎn)地貫葉金絲桃藥材進(jìn)行分析，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括四元泵、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、工作站，安捷倫科技＜中國＞公司）；BP－211D型電子天平(德國賽多利斯公司)；Milli－Q型純水器(美國Milli公司)。

1.2 試藥

試驗(yàn)藥材購于甘肅、陜西、四川等地（見表1），由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)國家企業(yè)技術(shù)中心葉亮教授鑒定為藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分；金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)為111521－201406，含量為92.5%）購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 貫葉金絲桃藥材的產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%磷酸，梯度洗脫（見表2）；柱溫：35℃；檢測(cè)波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

稱取金絲桃苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁金絲桃苷60 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品粉末(過3號(hào)篩)約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

表2 梯度洗脫程序

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：稱取貫葉金絲桃藥材，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，按擬訂色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄60 min色譜圖。以金絲桃苷峰（8號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果的RSD均小于3.0%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取貫葉金絲桃藥材，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄60 min色譜圖。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%(n＝5)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同1份供試品溶液1份，按擬訂色譜條件分別于1，8，16，24，48 h時(shí)測(cè)定，記錄60 min色譜圖。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜分析

取S1～S12 12批不同產(chǎn)地的貫葉金絲桃藥材，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，以8號(hào)峰貫葉金絲桃特征成分金絲桃苷作為參照峰，得出12批次貫葉金絲桃藥材指紋圖譜的15個(gè)共有峰（見圖1）和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（見圖2），各共有峰相對(duì)保留時(shí)間見表3。

圖1 12批貫葉金絲桃藥材指紋圖譜

圖2 貫葉金絲桃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜

表3 貫葉金絲桃指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

2.5 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

將S1～S12 12個(gè)不同產(chǎn)地樣品的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A），考察色譜峰相似度的一致性，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。不同產(chǎn)地的貫葉金絲桃藥材指紋圖譜的主要峰群的整體圖貌基本一致，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，樣品S1～S12相似度分別為0.971，0.978，0.944，0.946，0.985，0.963，0.971，0.956，0.988，0.973，0.986，0.969，均在0.900以上。

3 討論

[5－10]方法，本試驗(yàn)中經(jīng)多次篩選、優(yōu)化，建立了貫葉金絲桃HPLC指紋圖譜方法。分別考察了以乙腈－0.1%磷酸、甲醇－0.1%磷酸為流動(dòng)相時(shí)供試品溶液的分離效果，用乙腈作為有機(jī)相，主要色譜峰的分離效果較好；考察了水、0.1%磷酸、1%磷酸、磷酸氫二鈉等流動(dòng)相，除水出現(xiàn)色譜峰較寬和有拖尾現(xiàn)象外，其他峰形均較好。最后選用經(jīng)濟(jì)、簡便的0.1%磷酸作為水相，因此，綜合考慮乙腈－0.1%磷酸作為流動(dòng)相。

分別考察了260，280，360 nm波長下產(chǎn)生的色譜圖，結(jié)果顯示360 nm波長處峰數(shù)較少，而且峰高較低，260 nm和280 nm波長處峰數(shù)較多，但280 nm波長處峰高較高，且基線平穩(wěn)，峰數(shù)也相對(duì)理想，分離效果也較好，因此選擇280 nm作為檢測(cè)波長。

分別考察了30，35，40℃的柱溫，結(jié)果顯示35℃保留時(shí)間和分離效果較好。

本試驗(yàn)中考察的12批次貫葉金絲桃藥材主要來源于甘肅、陜西、四川、湖北等地，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地貫葉金絲桃藥材色譜圖中15個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致，但不同批次共有峰峰面積有一定差異，可能與藥材產(chǎn)地的土壤、氣候、時(shí)間、種植方式等有關(guān)。

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HPLC Fingerprint of Hypericum Perforatum form different Habitats

Tang Xiaolong,Luo Xu,Chen Bo,Wang Xiaolin,Yang Songqi,Chen Haiyan,Ke Xiao
(Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.,Chengdu,Sichuan,China610041)

ObjectiveTo establish an HPLC fingerprint analysis method for Hypericum perforatum.MethodsTwelve batches of Hypericum perforatum from different habitats were analyzed by HPLC fingerprints method,the peaks were identified by reference substance of Hypericum perforatum,the fingerprints were analyzed from the aspects of similarity,relative retention time and relative peak area.Results The similarity of twelve batches of Hypericum perforatum was more than 0.900.ConclusionThe method is simple and feasible,which can guide the quality evaluation of Hypericum perforatum.

Hypericum perforatum;fingerprint;HPLC

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)21－0012－03

10.3969/j.issn.1006－4931.2017.21.005

四川省重大產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)[2012CD00082]；四川科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目[2012SC0029]。

唐小龍（1987－），男，碩士研究生，工程師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電子信箱）594195569＠qq.com。

柯瀟（1983－），男，碩士研究生，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幮滤?，（電話?28－64287669。

2017－05－23)