王 林， 李亞軍， 張 蓓， 常明則， 石少亭， 張世俊， 折 瀟， 楊春梅

甘草甜素對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

王 林1,2， 李亞軍2， 張 蓓2， 常明則3， 石少亭2， 張世俊2， 折 瀟2， 楊春梅1

目的研究甘草甜素(glycyrrhizin,GL)對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠(status epilepticus,SE)神經(jīng)損傷保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制。方法取清潔健康成年雄性SD大鼠60只，采用腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品的方法建立大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)模型，隨機(jī)分為甘草甜素組(SE+GL)和生理鹽水組(SE+S)，分別經(jīng)尾靜脈給予甘草甜素及生理鹽水進(jìn)行干預(yù)，取正常大鼠作為對(duì)照組(control group,C)；根據(jù)給予GL劑量不同將其分為高劑量組(HGL,20 mg/kg)、中劑量組(MGL,10 mg/kg)及低劑量組(LGL,5 mg/kg)；通過(guò)尼氏染色(NS)觀察各組大鼠SE后24 h時(shí)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷情況，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)各組大鼠SE后24 h時(shí)血清及大腦皮質(zhì)中高遷移率族蛋白(HMGB1)的表達(dá)水平。結(jié)果SE+S組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元在癲癇持續(xù)狀態(tài)后24 h明顯受損，SE+GL各組皮質(zhì)受損神經(jīng)元數(shù)量較SE+S組減少，且在不同給藥劑量組間存在顯著差異(P<0.05)；SE+GL各組在SE后24 h時(shí)大腦皮質(zhì)及血清中HMGB1的表達(dá)水平較SE+S組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論經(jīng)尾靜脈給予GL能有效地減少SE后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，且其神經(jīng)保護(hù)作用呈劑量依賴性，其機(jī)制可能與其抑制血清及大腦皮質(zhì)炎性因子HMGB1的表達(dá)有關(guān)。

癲癇持續(xù)狀態(tài)； 甘草甜素； 大腦皮質(zhì)神經(jīng)元； HMGB1

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)異常放電引起的一種神經(jīng)功能障礙綜合征，目前全世界約有5000萬(wàn)人罹患癲癇，目前的治療措施較多，約有60%～70%的癲癇患者病情得到控制，但仍有部分患者治療效果有限或并發(fā)癥較多，因而進(jìn)一步探索抗癲癇損傷神經(jīng)保護(hù)途徑及機(jī)制顯得愈發(fā)重要[1]。高遷移率組蛋白(high mobility group box-1 protein,HMGB1)的抑制劑甘草甜素(glycyrrhizin,GL)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如大鼠出血性和缺血性卒中的腦保護(hù)作用及機(jī)制已得到越來(lái)越多的關(guān)注[2～6]，但GL在大鼠SE后的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作并依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)篩選SE模型[7]，經(jīng)大鼠尾靜脈給予GL或生理鹽水進(jìn)行干預(yù)，采用尼氏染色(nissl staining,NS)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(western blot,WB)觀察各組大鼠SE后24 h大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷情況以及不同藥物劑量組大腦皮質(zhì)與血清中HMGB1表達(dá)水平的改變，旨在探索GL在大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后的神經(jīng)保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備 造模用氯化鋰、匹羅卡品、甘草甜素(貨號(hào)-1295888)均購(gòu)于Sigma Aldrich公司(中國(guó))，兔抗大鼠HMGB1多克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體均購(gòu)于BOSTER公司(中國(guó)武漢)，紫外分光光度儀為BIO-RAD公司(美國(guó))，高速冷凍離心機(jī)為Fermentas公司(加拿大)，ELISA試劑盒(HMGB1)購(gòu)于BIO-RAD公司(美國(guó))，石蠟切片機(jī)為L(zhǎng)EICA公司(德國(guó))，光學(xué)顯微鏡為NIKON公司(日本)。

1.2 動(dòng)物分組及癲癇持續(xù)狀態(tài)模型建立 健康清潔級(jí)成年(6～8 w)雄性SD大鼠60只，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)新環(huán)境1 w后造模。SE模型：采用Costa-Ferro等沿用的方法建立SE模型[7,8]，將大鼠依次稱(chēng)重后依次經(jīng)腹腔給予氯化鋰(127 mg/kg)，在20 h后經(jīng)腹腔注射阿托品(0.1 mg/kg)以降低匹羅卡品的外周膽堿能反應(yīng)，在給予阿托品后半個(gè)小時(shí)，腹腔注射匹羅卡品(40 mg/kg)，觀察大鼠癲癇發(fā)作的程度，根據(jù)經(jīng)典的Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]篩選入組大鼠，達(dá)到Ⅳ級(jí)或以上的SE大鼠納入實(shí)驗(yàn)，在SE后30 min經(jīng)腹腔給予地西泮(10 mg/kg)終止發(fā)作。隨機(jī)分為甘草甜素組(SE+GL，n=36)、生理鹽水組(SE+S，n=15)和正常對(duì)照組(control group C，n=9)，SE+GL組在大鼠SE終止后30 min經(jīng)尾靜脈單次劑量GL，根據(jù)不同給藥劑量分為3個(gè)亞組(每亞組n=12)，高劑量組(high glycyrrhizin group,HGL,20 mg/kg)；中劑量組(middle glycyrrhizin group,MGL,10 mg/kg)；低劑量組(low glycyrrhizin group,LGL,5 mg/kg)，SE+S組大鼠經(jīng)尾靜脈給予相同劑量的生理鹽水，C組為正常大鼠未作處理。

1.3 Nissl染色計(jì)數(shù)皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量 為觀察各組大鼠(n=4)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量，每組大鼠在SE造模成功后24 h經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉后，4%多聚甲醛進(jìn)行體內(nèi)灌注固定后并取出大鼠完整大腦，將腦組織置入4%多聚甲醛中后固定36 h，之后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制作為石蠟組織塊。在石蠟切片機(jī)上做冠狀連續(xù)切片，切片厚度為1 μm。恒溫箱烤干后進(jìn)行尼氏染色，圖像處理用Image proplus 6.0軟件進(jìn)行，計(jì)算出各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量。

1.4 ELISA測(cè)定各組大鼠血清中HMGB1的表達(dá) 采用ELISA法測(cè)定各組大鼠(n=4)血清中HMGB1表達(dá)水平。各組大鼠在SE后24 h經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剪開(kāi)大鼠胸腔，直視下經(jīng)大鼠右心房取血2 ml，在4 ℃冰箱中靜置30 min后，3000 r/min離心20 min，取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒中操作步驟進(jìn)行檢測(cè)各組樣本的OD值，通過(guò)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值及濃度所建立的線性回歸方程計(jì)算出各組大鼠血清中HMGB1的濃度(μg/L)，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 Western blot測(cè)定各組大鼠大腦皮質(zhì)中HMGB1的表達(dá) 采用Western blot測(cè)定各組大鼠(n=4)大腦皮質(zhì)中HMGB1表達(dá)水平。剪開(kāi)取血標(biāo)本后的大鼠頂骨，取出大鼠完整大腦及小腦組織，冰上切除小腦后快速分離雙側(cè)大腦皮質(zhì)，將分離好的各組大鼠雙側(cè)大腦皮質(zhì)在微量電子稱(chēng)上稱(chēng)重后進(jìn)行總蛋白提取、蛋白濃度定量、SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和雜交、顯影反應(yīng)及Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行條帶光密度分析。

2 結(jié) 果

2.1 GL對(duì)SE后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用 正常對(duì)照組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列規(guī)律，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核清晰；生理鹽水組在SE后24 h大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞體積減小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞漿濃集，細(xì)胞核不清晰；而與生理鹽水組相比，GL組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元受損程度明顯減輕，HGL組、MGL組及LGL組皮質(zhì)正常神經(jīng)元密度均高于生理鹽水組，其中HGL組及MGL組皮質(zhì)神經(jīng)元密度較生理鹽水組顯著增高(P<0.005)，且高于LGL組(P<0.05)，但在HGL組和MGL組兩組間比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。尼氏染色結(jié)果顯示經(jīng)尾靜脈給予GL能夠減少大鼠SE后大腦皮質(zhì)受損神經(jīng)元數(shù)量，對(duì)SE后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用(見(jiàn)圖1)。

2.2 GL對(duì)SE后大鼠血清中HMGB1表達(dá)的影響 采用ELISA檢測(cè)SE后24 h各組大鼠血清中HMGB1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示HGL組、MGL組及LGL組HMGB1的表達(dá)水平較SE+S組均顯著降低(P<0.05)，且隨著GL劑量的增加，血清中HMGB1的水平降低幅度越顯著，表明GL能夠有效地降低SE后的大鼠血清中升高的HMGB1水平，且呈劑量依賴性，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)圖2)。

2.3 GL對(duì)SE后大鼠大腦皮質(zhì)HMGB1表達(dá)的影響 采用Western-blot檢測(cè)各組大鼠大腦皮質(zhì)中HMGB1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示大腦皮質(zhì)HMGB1的表達(dá)情況與血清中的相似，SE+S組的大鼠大腦皮質(zhì)中HMGB1表達(dá)水平顯著高于其他各組，與SE+S組相比，HGL組、MGL組及LGL組的大鼠大腦皮質(zhì)中HMGB1表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，HGL組及MGL組更為明顯地減低了HMGB1表達(dá)水平，但此兩組之間比較無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見(jiàn)圖3)。

C：正常對(duì)照組；SE+S:生理鹽水組；LGL：低劑量組；MGL：中劑量組；HGL：高劑量組。HGL組、MGL組和LGL組與SE+S組之間正常神經(jīng)元密度比較。與SE+S組相比，HGL組和MGL組正常神經(jīng)元密度增多尤為顯著((###P<0.001,##P<0.01)，但HGL組和MGL組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ns)

圖1 各組大鼠腦組織尼氏染色(×40)及神經(jīng)元密度的比較

SE+S：生理鹽水組；LGL：低劑量組；MGL：中劑量組；HGL：高劑量組。與SE+S組相比，HGL組、MGL組和LGL組中大鼠血清中HMGB1表達(dá)水平明顯減低(#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001)

圖2 ELISA檢測(cè)大鼠血清中HMGB1的表達(dá)情況

C：正常對(duì)照組；SE+S：生理鹽水組；LGL：低劑量組；MGL：中劑量組；HGL：高劑量組。與C組相比，SE+S組大鼠大腦皮質(zhì)中HMGB1表達(dá)水平顯著升高；與SE+S組相比，HGL組、MGL組和LGL組中大鼠大腦皮質(zhì)中HMGB1表達(dá)水平明顯減低(##P<0.01,###P<0.001)；與LGL組相比，HGL組和MGL組 HMGB1表達(dá)水平降低更為顯著(**P<0.01)，但HGL組和MGL組之間HMGB1表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ns)

圖3 Western blot檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)HMGB1的表達(dá)情況

3 討 論

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)更是神經(jīng)系統(tǒng)的急重癥，具有極高致死率和致殘率，嚴(yán)重影響著患者及家屬的生活質(zhì)量。目前對(duì)于癲癇發(fā)病相關(guān)病理生理機(jī)制的闡述和涉及的治療手段眾多，如藥物、神經(jīng)刺激及外科手術(shù)等。然而，傳統(tǒng)的藥物及手術(shù)等常受到毒副作用及并發(fā)癥等影響，臨床治療效果并不理想[1]，因此，探索新的SE后神經(jīng)保護(hù)藥物及相關(guān)作用機(jī)制仍顯得刻不容緩。

大量研究表明腦內(nèi)炎癥反應(yīng)與癲癇緊密相關(guān)，特別是腦損傷或癲癇發(fā)作可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎介質(zhì)，從而啟動(dòng)級(jí)聯(lián)的腦組織的炎癥過(guò)程[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明許多炎癥介質(zhì)如細(xì)胞因子、補(bǔ)體、前列腺素等都參與了癲癇發(fā)生過(guò)程，抑制炎癥因子及其受體的干預(yù)措施可以減少癲癇發(fā)生的頻率、嚴(yán)重程度及病理?yè)p害[10～12]。臨床研究資料發(fā)現(xiàn)在難治性顳葉癲癇及腦發(fā)育異常相關(guān)癲癇患者的腦組織中存在顯著的炎癥反應(yīng)[13]。HMGB1作為炎癥因子和炎性趨化因子，廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞，能參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)固胞核結(jié)構(gòu)，且釋放后具有炎癥介質(zhì)功能[14]。近年來(lái)有研究證實(shí)在腦卒中和蛛網(wǎng)膜下腔出血患者血漿或腦脊液中HMGB1升高的現(xiàn)象，認(rèn)為HMGB1可以作為評(píng)價(jià)神經(jīng)功能損傷和預(yù)后的一個(gè)可靠指標(biāo)。GL作為HMGB1的特異性抑制劑，近幾年國(guó)內(nèi)外有關(guān)GL的神經(jīng)保護(hù)作用的研究更是不斷增多。新近研究證實(shí)GL可以通過(guò)抑制HMGB1減少大鼠腦出血引起的腦損傷以及缺血再灌注引起的肝損傷[15]，GL在大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的腦缺血模型中也發(fā)揮了明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制為通過(guò)抑制HMGB1磷酸化，阻斷HMGB1的分泌從而減輕炎癥反應(yīng)[2]。但HMGB1在SE中的作用機(jī)制以及GL在SE后的神經(jīng)保護(hù)作用仍鮮有報(bào)道。

本次研究通過(guò)建立氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)SE后24 h時(shí)神經(jīng)元損傷最重，因此選擇在大鼠SE后24 h時(shí)通過(guò)尼氏染色法檢測(cè)各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷程度，采用ELISA及Western blot檢測(cè)大鼠血清中及大腦皮質(zhì)HMGB1的表達(dá)變化。結(jié)果顯示在SE后24 h大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元明顯受損，大腦皮質(zhì)正常神經(jīng)元數(shù)目減少，血清及腦組織中HMGB1的表達(dá)明顯上調(diào)，而經(jīng)大鼠尾靜脈給予GL干預(yù)后，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷明顯減輕，大鼠血清及大腦皮質(zhì)中HMGB1的表達(dá)下調(diào)，特別是血清中HMGB1的下降與GL給藥量呈明顯劑量依賴性，與LGL組相比，HGL組和MGL組在SE后24 h對(duì)大鼠血清及大腦皮質(zhì)中HMGB1的抑制作用更為明顯，對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用也更為有效，但在抑制皮質(zhì)HMGB1表達(dá)時(shí),HGL組和MGL組兩組間比較沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本次研究結(jié)果表明尾靜脈給予GL可以有效地減輕SE后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與GL抑制腦組織及血清中HMGB1的表達(dá)有關(guān)，SE后HMGB1表達(dá)可能參與SE后神經(jīng)細(xì)胞炎性壞死的病理過(guò)程，而GL通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)從而對(duì)大鼠SE后神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。

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Protectiveeffectsandmechanismofglycyrrhizinonstatusepilepticusrats

WANGLin,LIYajun,ZHANGBei,etal.

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China)

ObjectiveTo study the protective effects and mechanism of glycyrrhizin on neuronal damage of Status Epilepticus (SE) rat hippocampus.Methods60 healthy adult male Sprague-Dawley rats were included in this study.SE rat model were induced by intraperitoneally injected with lithium and pilocarpine method.All rats were randomly divided into three groups:(SE+GL)-treated group,(SE+S) group and normal control group.According to different GL dosage,(SE+GL)-treated group were divided into three subgroup:high glycyrrhizin group (HGL,20 mg/kg),middle glycyrrhizin group (MGL,10 mg/kg),low glycyrrhizin group (LGL,5 mg/kg).The hippocampal neuronal damage was detected by nissl’s staining,levels of HMGB1 in serum and hippocampus were determined with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and western blot.ResultsCompared with those in (SE+S) group,the cortical neurons damage significantly reduced and HMGB1 expressions were significantly decreased in (SE+GL)-treated group (P<0.05).ConclusionGL significantly decreased neuronal damage in the cortex of SE rat models,and it turned out dose-dependent.These results suggest that GL affords neuroprotective effects in lithium-pilocarpine induced SE rats,which may via inhibiting the expressions of HMGB1 in serum and cortical neurons.

Status epilepticus； Glycyrrhizin； Cortical neuron； HMGB1

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0893-04

2017-06-12；

2017-09-28

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃(No.S2015TLSF0010);陜西省教育廳基金(No.11JK0715);陜西省衛(wèi)生廳科研基金(No.2012D43)

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750003；2.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710077；3.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710021)

李亞軍，E-mail：liyajun9@hotmail.com