吳興饒， 孔慶霞， 褚 旭

TLR9、MyD88在顳葉癲癇大鼠海馬組織中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

吳興饒1， 孔慶霞2， 褚 旭2

目的觀察氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠各期海馬中Toll-樣受體9(TLR9)、髓樣分化因子(MyD88)表達(dá)的變化，探討其是否與顳葉癲癇發(fā)生有關(guān)。方法SD雄性大鼠120只，隨機(jī)分為對(duì)照組(30只)和模型組(90只)，腹腔注射氯化鋰。18 h～20 h后模型組腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)；對(duì)照組予等量生理鹽水取代匹羅卡品腹腔注射。對(duì)照組和造模成功的模型組依據(jù)腹腔注射后時(shí)間隨機(jī)分為10個(gè)亞組：急性模型組(SE后3 h、6 h、9 h、12 h、1 d、3 d、7 d)；潛伏模型組(SE后14 d、28 d)；慢自發(fā)發(fā)作組(SE后56 d)。每亞組動(dòng)物模型組9只，對(duì)照組3只。免疫組化、蛋白印跡、RT-PCR 技術(shù)測(cè)定各亞組癲癇大鼠海馬內(nèi)TLR9、MyD88的表達(dá)。結(jié)果TLR9、MyD88在模型組海馬內(nèi)表達(dá)明顯增多，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.05)。模型亞組內(nèi)，TLR9、MyD88在急性期和慢性期表達(dá)明顯增高，而潛伏期無(wú)明顯表達(dá)變化。其中急性期內(nèi)的增高多集中在癲癇發(fā)作后6 h；3組比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論大鼠海馬內(nèi)TLR9、MyD88表達(dá)增多可能與顳葉癲癇發(fā)病有關(guān)，探討其機(jī)制可能為顳葉癲癇的治療提供新的靶點(diǎn)。

顳葉癲癇； TLR9； MyD88； 細(xì)胞因子

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科的常見(jiàn)疾患之一，多數(shù)經(jīng)藥物治療可緩解，但有約30%患者藥物治療無(wú)效，成為難治性癲癇。參與癲癇的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，近幾年研究證實(shí)免疫炎癥反應(yīng)與癲癇的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，患者腦脊液(CSF)和血清中的促炎性細(xì)胞因子水平的增加提供了神經(jīng)炎癥在癲癇發(fā)生發(fā)展中參與的證據(jù)，而這些細(xì)胞因子多是由外源性和內(nèi)源性配體的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)通過(guò)激活產(chǎn)生的。

TLRs是一類天然免疫的模式識(shí)別受體，屬于跨膜蛋白，由富含亮氨酸重復(fù)序列組成的胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)以及與1L-1受體胞內(nèi)區(qū)保守序列有高度同源性的胞漿區(qū)組成，其能夠識(shí)別微生物脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)或核酸，而在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前與癲癇有關(guān)的TLRs主要有TLR1、TLR3、TLR4、TLR9，其中TLR1、TLR3、TLR4報(bào)道的比較多。而TLR9、MyD88是否與難治性癲癇有關(guān)，其在難治性癲癇中的表達(dá)情況如何，國(guó)內(nèi)外極少報(bào)道。本研究利用氯化鋰-匹羅卡品點(diǎn)燃大鼠，制備難治性顳葉癲癇模型，結(jié)合免疫組化、免疫印跡、RT-PCR技術(shù)測(cè)定各期大鼠海馬內(nèi)TLR9、MyD88的表達(dá)。旨在探討其與顳葉癲癇發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，為顳葉癲癇的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Sprague Dawley大鼠(山東魯抗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證scxk魯20140007)，倒置熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)、恒冷切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司)、熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)、轉(zhuǎn)移電泳儀、垂直式電泳槽、電轉(zhuǎn)移槽(北京市六一儀器廠)、氯化鋰、匹羅卡品、甲基化阿托品(美國(guó)Sigma)，抗TLR9一抗(英國(guó)Abcam)，水合氯醛、普魯士藍(lán)試劑盒(北京索萊寶公司科技有限公司)，TLR9、MyD88引物(生工生物工程上海股份有限公司)，生理鹽水(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)，無(wú)水乙醇、甲醇、氯化鈉、多聚甲醛等實(shí)驗(yàn)室常用藥品(山東省萊陽(yáng)市鐵塔化工用品廠)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物顳葉癲癇模型制作及分組 選擇健康雄性Sprague Dawley大鼠130只，隨機(jī)分對(duì)照組(30只)和造模組(100只)，體重200～250 g，環(huán)境為清潔級(jí)，溫度維持20 ℃，分籠飼養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，固定12 h人工晝夜循環(huán)的環(huán)境。采用氯化鋰-皮羅卡品誘導(dǎo)急性顳葉癲癇模型，具體方法如下：所有SD大鼠第一天提前18～20 h腹腔注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg；第2天提前30 min腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg/kg，30 min后造模組腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品30 mg/kg，并按照Racine癲癇行為標(biāo)準(zhǔn)觀察記錄大鼠行為30 min，若大鼠未達(dá)到Racine分級(jí)的Ⅳ～Ⅴ級(jí)的癇性發(fā)作，繼續(xù)追加匹羅卡品的劑量，每隔10 min重復(fù)注射匹羅卡品一次，每次為10 mg/kg，最大追加劑量可達(dá)60 mg/kg。發(fā)作級(jí)別達(dá)Racine分級(jí)Ⅳ～Ⅴ級(jí)，發(fā)作持續(xù)1 h以上視為成功的顳葉癲癇模型。對(duì)照組則予等量生理鹽水取代匹羅卡品腹腔注射。造模組內(nèi)，在造模成功且存活的顳葉癲癇模型中，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)挑選出90只大鼠編為模型組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，共分3個(gè)大組，10個(gè)亞組:急性模型組(SE后3 h、6 h、9 h、12 h、1 d、3 d、7 d)；潛伏模型組(SE后2 w、4 w)；慢自發(fā)發(fā)作組(SE后8 w)及相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組。每亞組動(dòng)物模型組9只，對(duì)照組3只。

1.3 免疫組化分析檢測(cè)TLR9蛋白在海馬中的表達(dá)

1.3.1 腦組織取材 模型組及對(duì)照組大鼠均在造模后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)立即進(jìn)行心臟灌注后取腦組織，首先麻醉、固定，依次以0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，分離腦組織置4%的多聚甲醛4 ℃ 過(guò)夜固定，后放入30%的蔗糖溶液中4 ℃浸泡至組織塊沉底，后于海馬吻合位置連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚4 μm，-80 ℃保存?zhèn)溆糜诿庖呓M化。每亞組取模型組3只大鼠，對(duì)照組1只大鼠。

1.3.2 免疫組化分析檢測(cè)TLR9蛋白的表達(dá) 免疫組化步驟參照SABC-AP免疫組化染色試劑盒(博士德SA1052-兔Ig-G)說(shuō)明書(shū)操作。冰凍切片于4 ℃下復(fù)溫30 min，室溫置于30% H2O2和純甲醇混合液中(1∶50)30 min，以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次后，加入5%BSA封閉液，室溫30 min。加入稀釋的一抗(TLR9，1∶100;購(gòu)于abcam公司) 4 ℃孵育過(guò)夜。取出后PBS清洗3次，每次5 min。滴加相應(yīng)的二抗(生物素化山羊抗兔Ig-G)，室溫30 min，PBS清洗3次，每次5 min。滴加SABC-AP，室溫30 min，PBS洗5 min×3次。BCIP/NBT染色，鏡下觀察，控制顯色時(shí)間。流水充分沖洗，蘇木素染核，常規(guī)封片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測(cè)TLR9蛋白在海馬中的表達(dá)

1.4.1 海馬總蛋白的提取 取造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組及對(duì)照組大鼠，常規(guī)用10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)麻醉后斷頭取腦，分離海馬。液氮下研磨組織成粉末狀，加入NP40組織裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑，冰上裂解1 h，14000 r/min離心20 min，取上清，分裝并凍存在液氮中備用。每亞組取模型組3只大鼠，對(duì)照組1只大鼠。

1.4.2 Western blot檢測(cè)TLR9蛋白的表達(dá) 取出備用的各組海馬總蛋白,以30 μg上樣量，加入上樣緩沖液后，標(biāo)本煮沸5 min，然后迅速置于冰面冷卻，上樣，12%聚丙稀酰胺凝膠電泳分離(上層膠電泳電壓70 V，1 h；下層膠電泳電壓110 V，1 h)，轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜電壓80 V，90 min)、封閉后，與一抗IL-1β/TLR9(1∶1000 濃度)4 ℃孵育過(guò)夜，與1∶2000濃度的HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫解育1 h后，ECL試劑發(fā)光，顯影和定影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 RT-PCR檢測(cè)TLR9 mRNA、MyD88 mRNA在海馬中的表達(dá)

1.5.1 海馬總RNA的提取 取造模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的模型組及對(duì)照組大鼠，常規(guī)用10%水合氯醛(劑量300 mg/kg)麻醉后斷頭取腦，分離海馬。液氮下研磨組織成粉末狀，按TRIzor法提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和含量，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間證明樣本純度好。每亞組取模型組3只大鼠，對(duì)照組1只大鼠。

1.5.2 RT-PCR檢測(cè)TLR9 mRNA、MyD88 mRNA的表達(dá) 總RNA (1 μg)以O(shè)ligo dTPrimer為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，操作按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(廣州復(fù)能基因有限公司)說(shuō)明進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擴(kuò)增采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒(廣州復(fù)能基因有限公司)，并參照其說(shuō)明進(jìn)行。TLR9、MyD88和β-Actin 引物(上海生工生物工程公司合成)擴(kuò)增大小分別為243 bp、452 bp。TLR9：上游序列：5’-TGCCTTCCTACCCTGTGAAC-3’，下游序列：5’-AGGAAAGGCTGGTGATGTTG-3’；MyD88：上游序列：5’-GATCCCACTCGCAGTTTGTT-3’，下游序列：5’-GATGCGGTCCTTCAGTTCAT-3’；β-Actin：上游序列：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游序列：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱10 min，94 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；循環(huán)25次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 造模情況 SD大鼠腹腔注射匹羅卡品10 min后開(kāi)始出現(xiàn)排便排尿軀體抖動(dòng)行動(dòng)刻板等，直至最終出現(xiàn)全身強(qiáng)直-陣攣癲癇大發(fā)作，待發(fā)作持續(xù)1 h以上后給予水合氯醛終止發(fā)作，并加強(qiáng)呼吸道護(hù)理，給予葡萄糖奶粉能量支持，降低死亡率。造模成功率為95%(100只大鼠，95只成功建立急性期模型，后死亡2只，存活93只)，從成功癲癇模型中隨機(jī)選擇90只癲癇大鼠用于模型組實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 免疫組化結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠海馬組織中可見(jiàn)少量TLR9陽(yáng)性細(xì)胞，而模型組內(nèi)染色陽(yáng)性細(xì)胞增多，呈棕黃色或紅褐色，染色均一，多表達(dá)在細(xì)胞的胞漿，以點(diǎn)狀或者串珠樣分布，偶可見(jiàn)斑片狀分布，表達(dá)明顯部位常伴有細(xì)胞形態(tài)改變。與對(duì)照組相比，模型組海馬內(nèi)TLR9表達(dá)增多，差異有顯著性。模型各亞組內(nèi)TLR9蛋白急性期和慢性期表達(dá)增高顯著，但潛伏期表達(dá)增多不明顯；3組比較差異有顯著性，且在急性期各組內(nèi)明顯見(jiàn)到差異，以3 h、6 h時(shí)期增高較為顯著(見(jiàn)圖1)。

2.3 Western-blot結(jié)果 與對(duì)照組相比，TLR9 蛋白在模型組海馬內(nèi)表達(dá)明顯增多(P<0.05)。模型亞組內(nèi)，急性期和慢性期TLR9蛋白表達(dá)增高顯著，而潛伏期無(wú)明顯表達(dá)變化；3組比較差異有顯著性，且在急性期各組內(nèi)明顯見(jiàn)到3 h，6 h時(shí)期的顯著增高(見(jiàn)圖2)。

2.4 RT-PCR結(jié)果 對(duì)照組相比,TLR9 mRNA、MRP8 mRNA在模型組海馬內(nèi)表達(dá)增多。模型組內(nèi)，TLR9 mRNA、MRP8 mRNA在急性期和慢性期表達(dá)顯著增多(P<0.05)，潛伏期表達(dá)無(wú)明顯改變； 在急性期各亞組內(nèi)明顯見(jiàn)到3 h，6 h時(shí)期的顯著增高(P<0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖1 各組大鼠海馬內(nèi)TLR9 表達(dá)變化(箭頭所示)×200倍

圖2 a、c：TLR9在各亞組海馬中動(dòng)態(tài)表達(dá)的變化； b、d：β-actin在各亞組海馬中表達(dá)的變化

圖3 a、b:TLR9 mRNA、MyD88 mRNA在各亞組海馬中動(dòng)態(tài)表達(dá)的變化

3 討 論

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病，其表現(xiàn)具有發(fā)作性、反復(fù)性、刻板性的特點(diǎn)。癲癇發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)元選擇性損傷，甚至死亡，其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損害并非隨著放電的終止而停止，一次癲癇的急性發(fā)作就足以引起腦部邊緣葉特定區(qū)域神經(jīng)元的脫失[1,2]。在氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇動(dòng)物模型中，癇性發(fā)作包括急性邊緣性發(fā)作，其進(jìn)一步可發(fā)展為癲癇持續(xù)狀態(tài)(epileptic state,SE)，即進(jìn)入急性期，急性期后伴隨一個(gè)潛伏期及稍后出現(xiàn)的自發(fā)性再發(fā)作階段，最后出現(xiàn)以自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作為特征的慢性癲癇階段。癲癇持續(xù)狀態(tài)可引起海馬神經(jīng)元的神經(jīng)病理改變，導(dǎo)致相關(guān)神經(jīng)元的壞死、變性或凋亡，神經(jīng)元內(nèi)DNA進(jìn)而釋放出來(lái)。TLR9作為族中唯一識(shí)別DNA的受體，經(jīng)典配體是非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸序列DNA(CpG-DNA)，其活化的信號(hào)傳導(dǎo)屬于典型的髓樣MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)TLR9有起到維持大腦結(jié)構(gòu)完整性的神經(jīng)保護(hù)作用。Taito Matsuda等人[3]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成年大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的TLR9能夠識(shí)別變性神經(jīng)元的自身DNA活化，分泌TNF-α(腫瘤壞死因子-α)，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的增生來(lái)削弱由癇性發(fā)作引起的異常神經(jīng)再生。也有報(bào)道指出癲癇患者海馬神經(jīng)元損傷的DNA能夠刺激小神經(jīng)膠質(zhì)TLR9，由此引發(fā)的TNF-α產(chǎn)生通過(guò)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響海馬齒狀回神經(jīng)祖細(xì)胞的減少[4,5]，而對(duì)TLR9敲除的癲癇小鼠的研究中，其癲癇發(fā)作的頻率和時(shí)間都要比野生型癲癇小鼠更為嚴(yán)重。Tauber SC等人[6]通過(guò)Morris水迷宮測(cè)試發(fā)現(xiàn)，通過(guò)連續(xù)注射的CpGDNA，刺激TLR9，能夠?qū)е滦∈蟮恼J(rèn)知功能障礙，從一定程度上暗示TLR9與癲癇有一定聯(lián)系，但具體作用尚未明確。我們推測(cè)癲癇發(fā)作引起神經(jīng)元壞死等釋放的DNA可作為T(mén)LR9配體，進(jìn)而激活TLR9，又通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一系列銜接分子如MyD88等的相關(guān)作用，激活NF-κB等一系列信號(hào)途徑，引起相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

在本實(shí)驗(yàn)中，TLR9在顳葉癲癇大鼠海馬內(nèi)表達(dá)增多，暗示TLR9在癲癇中具有潛在研究?jī)r(jià)值。其中急性期及慢性期表達(dá)增高較潛伏期顯著，潛伏期無(wú)明顯表達(dá)變化，提示TLR9的表達(dá)變化與模型組大鼠癲癇發(fā)作呈相關(guān)性。我們推測(cè)，癲癇發(fā)作所致神經(jīng)元等腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，釋放的DNA可能是TLR9被激活的原因。在癲癇發(fā)作初期，血腦屏障未完全破壞打開(kāi)，TLR9增高并不顯著。Michalak[7]等在海人酸急性癲癇模型中的研究也證實(shí)癲癇持續(xù)狀態(tài)后血腦屏障通透性會(huì)增加并于SE后4 h～24 h血腦屏障通透性最大，急性期內(nèi)TLR9的增高多集中在癲癇發(fā)作后6 h左右或與此有關(guān)。隨著病情進(jìn)展，腦屏障逐漸破壞打開(kāi)，大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及膠質(zhì)化，這也可能是慢性期TLR9增高的一個(gè)原因，我們觀察到大約7 d左右，TLR9還會(huì)有一個(gè)上升趨勢(shì)，可能是由于癲癇大鼠處于自發(fā)性發(fā)作階段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，MyD88在難治性顳葉癲癇大鼠海馬內(nèi)表達(dá)在一致性，間接表明TLR9活化的信號(hào)傳導(dǎo)屬于典型的髓樣MyD88依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而二者相互作用關(guān)系如何？MyD88能否單獨(dú)在癲癇中發(fā)揮一定作用？目前國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。

TLR9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)，且主要存在于具有吞噬作用的小膠質(zhì)細(xì)胞中。目前，大量的研究已經(jīng)證實(shí)由TLR9信號(hào)通路參與的炎癥反應(yīng)起到了神經(jīng)損傷作用。 Derkow等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TLR9特有配體通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞后分泌一些可溶性因子，包括IL-1β和IL-23，從而引起依賴MyD88途徑的γ、δT細(xì)胞的激活，使IL-17分泌，進(jìn)而引起了對(duì)神經(jīng)元的毒性作用，這種毒性作用需要神經(jīng)元與γ、δT細(xì)胞之間的直接聯(lián)系。Rosenberger等人[9]在研究單個(gè)和兩兩激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的TLRs對(duì)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和退行性變的影響時(shí)，還發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4、TLR9的兩兩激活比各個(gè)單個(gè)激活引起了更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。如前所述，國(guó)外最新研究也指出，TLR9有起到維持大腦結(jié)構(gòu)完整性的神經(jīng)保護(hù)作用，暗示其在神經(jīng)保護(hù)方面的作用。由此可見(jiàn)TLR9在癲癇病理過(guò)程中的作用機(jī)制復(fù)雜，正性及負(fù)性的調(diào)控均存在于病理過(guò)程之中。 我們推測(cè)，癲癇發(fā)作后，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌促炎因子或抗炎因子，執(zhí)行其神經(jīng)損傷和神經(jīng)保護(hù)雙向作用，TLRs則是小膠質(zhì)細(xì)胞執(zhí)行雙向作用的一類很關(guān)鍵的受體蛋白。TLR9在不同的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中所起到的作用是不同的，在癲癇疾病中，類似的相關(guān)研究比較少，或者TLR9本身分泌了多種因子，既有IL-1β、IL-17等促炎因子，也有TNF-α等抗炎因子，或者其神經(jīng)保護(hù)作用被同時(shí)激活的TLR4等作用較強(qiáng)信號(hào)通路的神經(jīng)損傷作用所掩蓋，目前尚不能明確，這也是我們下一步將要探討的問(wèn)題。

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DynamicexpressionchangesofTLR9andMyD88inhippocampusoftemporallobeepilepsyrats

WUXingrao,KONGQingxia,CHUXu.

(GraduateSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

ObjectiveTo investig ate the dynamic expression changes of TLR9 and MyD88 in hippocampus of the epilepsy rats induced by from lithium chloride-pilocarpine during the development of epilepsy，and to explore whether they induced the pathogenisis of the temporal lobe epilepsy.Methods120 male healthy Sprague-Dawley rats were divided randomly into control group and LiCl-Pilocarpine experimental group.The experimental rats were intraperitoneally injected with LiCl (127 mg/kg) and Pilocarpine (30 mg/kg) to induce status epilepticus(SE).SE was stopped with 10% chloral hydrate intraperitoneally injecting 60 minutes later.The rats in the control group and the experimental group were randomly divided into 10 subgroups:acute group (3 h,6 h,9 h,12 h,1 d,3 d,7 d),latent group (2 w,4 w),chronic group (8 w).Survival rats were continuously observed for onset and recurrence of spontaneous seizures every day and were grouped and sacrificed at corresponding time after the last pilocarpine injection respectively.The control rats were mitted tales doses of 0.9% saline and grouped and sacrificed at the same time after the saline injection.And all groups were executed by using immunohistochemistry，Western-blotting and RT-PCR analysis to examine the dynamic expression of TLR9 and MyD88 in the subfields of each gourps hippocampus.ResultsCompared with control group，the expression of TLR9 and MyD88 increased in all of the model group (P<0.05).In all of model group,the expression of TLR9 and MyD88 increased more significantly in acute stage and chronic stage than the latent stage(P<0.05).Acute phase increase more concentrated in 6 h.ConclusionThe evelated expressions of TLR9 and MyD88 in epilepsy rat hippocampus indicate they could be responsible for the epileptogensis of temporal lobe epilepsy.The TLR9/MyD88 pathway may play an important role in the pathogenisis of temporal lobe epilepsy.

Temporal lobe epilepsy; TLR9; MyD88; Cytokines

R742.1

A

1003-2754(2017)10-0888-05

2017-06-15；

2017-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81371423);濟(jì)寧市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目[濟(jì)科字(2015) 57號(hào)-94]

(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070;2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)寧 272000)

孔慶霞，E-mail:kqx1970@aliyun.com