曾 靜， 李丹丹， 劉志新， 趙弘軼， 遲麗屹， 黃勇華

神經(jīng)型一氧化氮合酶參與脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腦微出血的相關(guān)性研究

曾 靜1，2， 李丹丹1， 劉志新3， 趙弘軼1， 遲麗屹4， 黃勇華1

目的改進(jìn)并穩(wěn)定脂多糖(LPS)誘導(dǎo)腦微出血(CMBS)動(dòng)物模型的建立方法，為進(jìn)一步研究提供穩(wěn)定成熟的技術(shù)手段；探討神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)在CMBS過程中的作用。方法40只SD大鼠，隨機(jī)分成LPS給藥組(n=20)和生理鹽水對(duì)照組(n=20)，分別于0 h、12 h和24 h腹腔注射1 mg/ml、3 mg/kg LPS或相同劑量的生理鹽水，48 h后行頭部MRI掃描，SWI序列顯示出血灶；免疫熒光染色顯示小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記分子Iba的表達(dá)；蛋白印跡法分析nNOS和ZO-1(血腦屏障標(biāo)記分子)的表達(dá)情況。結(jié)果3 mg/kg LPS給藥后，MRI顯示散在SWI序列點(diǎn)狀低信號(hào)影，蛋白印跡法及免疫熒光結(jié)果顯示ZO-1明顯減少，Iba及nNOS表達(dá)顯著增多。結(jié)論LPS可能通過增加全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，增加nNOS的表達(dá)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障產(chǎn)生破壞作用，從而導(dǎo)致微出血的產(chǎn)生。

腦微出血； 脂多糖； 神經(jīng)型一氧化氮合酶； 磁敏感加權(quán)成像； 血腦屏障

腦小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)是指在多種病因共同作用下，導(dǎo)致腦的穿支動(dòng)脈、小動(dòng)脈(直徑40～200 μm)、毛細(xì)血管和小靜脈受損，進(jìn)而損傷腦深部灰質(zhì)和腦白質(zhì)，進(jìn)而出現(xiàn)一些特征性的病理學(xué)和影像學(xué)改變以及認(rèn)知功能障礙的臨床綜合征[1]。其影像學(xué)改變主要包括新發(fā)的皮質(zhì)下梗死、可能為血管起源的腔隙、可能為血管起源的白質(zhì)高信號(hào)、血管周圍間隙擴(kuò)大、腦萎縮以及腦微出血[2]。

腦微出血(cerebral microbleeds，CMBS)是腦內(nèi)微小血管破裂導(dǎo)致的微小出血，病理上表現(xiàn)為受損血管周圍小的陳舊性出血灶以及含鐵血黃素沉積[3]。然而，這種出血灶在常規(guī)的影像學(xué)檢查上難以發(fā)現(xiàn)，較多的研究顯示，磁敏感加權(quán)成像(SWI)顯示CMBS的敏感性明顯優(yōu)于常規(guī)序列，顯示出較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[4]。CMBS在SWI上表現(xiàn)為多發(fā)性小灶性(<10 mm)的信號(hào)缺失，周圍沒有水腫形成。關(guān)于CMBS，目前認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是其重要的發(fā)病機(jī)制之一[5]。

神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)是NOS3種亞型之一，又稱為NOS1，在中樞和外周的神經(jīng)元持續(xù)表達(dá)，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性、調(diào)節(jié)血壓、松弛血管平滑肌、舒張血管等作用[6]。nNOS為Ca2+依賴型，高活性的nNOS，刺激大量的Ca2+內(nèi)流，激活NMDA受體介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7]。

脂多糖(LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分之一，是一種良好的炎癥刺激因子。Sumbria等[8]通過 C57BL/6小鼠腹腔注射LPS構(gòu)建腦微出血?jiǎng)游锬Ｐ?。本課題參考并改進(jìn)該方法建立SD大鼠腦微出血?jiǎng)游锬Ｐ?，并探討nNOS在腦微出血病理進(jìn)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重(220±20)g，購于斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司；7.0T核磁(BioSpec，首都醫(yī)科大學(xué))；脂多糖(086M4159V，Sigma)；NOS1(A-11)(sc-5302，SANTA CRUZ)；ZO-1 Polyclonal ANTIBODY(21773-1-AP，proteintech)；Anti-Iba1 antibody(ab178847，abcam)；Mouse anti β-tubulin antibody(GB13017-2，谷歌生物)；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(GB23301，谷歌生物)；Goat Anti-Rabbit IgG-HRP(M21002，Abmart)；Alexa Fluor 488 標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(A0423，碧云天)。

1.2 分組處理 配制1 mg/ml的脂多糖。將40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分成LPS給藥組(n=20)和生理鹽水對(duì)照組(n=20)，LPS給藥組從第一天晚上20：00開始，分別于0 h、12 h、24 h后腹腔注射LPS 3 mg/kg，對(duì)照組給予等量生理鹽水。

1.3 MRI LPS給藥后48 h，采用7.0T核磁進(jìn)行頭部冠狀位全層掃描，層厚為0.7 mm，SWI序列評(píng)估微出血的部位及數(shù)目。

1.4 免疫熒光 LPS給藥后48 h，每組各取10只大鼠，4 ml/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，依次經(jīng)心臟灌注生理鹽水300 ml、4%多聚甲醛溶液300 ml，完整取出腦組織，依次置入4%多聚甲醛溶液、20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液各6 h固定腦組織，然后進(jìn)行冰凍切片，厚度為10 μm，每隔100微米取一層。采用免疫熒光的方法標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物Iba，確定LPS誘導(dǎo)的腦微出血炎癥反應(yīng)的程度。其中一抗為Anti-Iba1 antibody(1∶100);二抗為Alexa Fluor 488 標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500)，DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。

1.5 蛋白印跡法 LPS給藥后48 h，每組各取10只大鼠，足量水合氯醛充分麻醉，快速取出腦組織，然后取額葉、基底節(jié)、小腦對(duì)應(yīng)部位等量大小的腦組織，立即置于液氮中保存，需要時(shí)采用勻漿器充分研磨腦組織，加入RIPA裂解液(PMSF與RIPA Lysis Buffer按1∶500配制)冰上孵育30 min，4 ℃、12000 rpm離心15 min，取上清，加入上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min，然后按蛋白印跡法的操作步驟進(jìn)行，一抗為nNOS(1∶200)和ZO-1(1∶1000)，內(nèi)參為β-tubulin(1∶2000);二抗為Goat Anti-Rabbit IgG-HRP(1∶4000)和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶4000)。利用BIO-RAD XRS+Software顯影，采用Image J圖像分析軟件對(duì)顯影結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 死亡率 給藥后48 h，LPS給藥組大鼠死亡2只，存活率為90%，對(duì)照組因麻醉意外死亡1只。因灌注失敗LPS給藥組和空白組各死亡1只。

2.2 腦表面微出血 給藥后48 h，LPS給藥組經(jīng)過生理鹽水及多聚甲醛灌注后的腦組織表面微出血數(shù)目為(5.4±1.2)個(gè)，顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)(見圖1)。

2.3 MRI LPS或生理鹽水給藥后48 h，MRI的SWI序列，微出血在SWI序列上呈點(diǎn)狀低信號(hào)，LPS給藥組在SWI序列上低信號(hào)的數(shù)目為(8.5±0.9)，顯著高于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)(見圖2)。

2.4 免疫熒光 免疫熒光結(jié)果顯示，相同部位，LPS給藥組小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記分子Iba的數(shù)目為36.30±3.59，生理鹽水對(duì)照組為16.30±3.09，LPS給藥組顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(見圖3)。

2.5 蛋白印跡法 蛋白電泳結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組相比，額葉、基底節(jié)、小腦3個(gè)部位的LPS給藥組血腦屏障標(biāo)記分子ZO-1均明顯減少(P<0.01)，nNOS表達(dá)均顯著增加(P<0.01)(見圖4)。

圖1 灌注后的腦組織，左側(cè)為對(duì)照組，右側(cè)為LPS給藥組，箭頭所指為腦表面微出血

圖2 左側(cè)為生理鹽水對(duì)照組，右側(cè)為LPS給藥組，箭頭所指即為微出血的部位

圖3 左側(cè)上為生理鹽水對(duì)照組，右側(cè)上為LPS給藥組，藍(lán)色熒光為DAPI，綠色熒光為Iba陽性小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物

圖4 額葉、小腦、基底節(jié)3個(gè)部位對(duì)應(yīng)的ZO-1、nNOS分別與內(nèi)參β-tubulin的灰度比值

3 討 論

腦微出血是腦小血管病的表現(xiàn)形式之一，是腦內(nèi)基底核區(qū)或皮質(zhì)下微血管破裂所致的腦實(shí)質(zhì)損害，大多數(shù)患者無臨床癥狀，但CMS卻有很高的發(fā)病率。丁健等[9]通過對(duì)285例急性腦梗死患者研究顯示，急性腦梗死伴CMS的患者占37.5%。而無癥狀或健康老年人群CMS患病率約為5%～6%[10]。CMS的發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚，很多研究表明炎癥反應(yīng)在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，Mitaki等[11]通過對(duì)519個(gè)神經(jīng)功能正常且沒有任何神經(jīng)系統(tǒng)或精神疾病病史的受試者研究表明，CMS與血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)增高相關(guān)。Shoamanesh等[12]對(duì)15種炎癥標(biāo)志物與腦小血管病的相關(guān)性研究表明，循環(huán)中高水平的腫瘤壞死因子2(TNFR2)和髓過氧化物酶與CMS相關(guān)，且不同的炎癥通路可能會(huì)導(dǎo)致缺乏或出血不同的表現(xiàn)。

最近的研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅可以表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶，還可以表達(dá)nNOS，表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的nNOS具有維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定重要作用[13]。在生理?xiàng)l件下，nNOS的表達(dá)產(chǎn)物除了一氧化氮，還可以產(chǎn)生一些非神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)物質(zhì)如過氧化物、超氧化物等[14]。在體內(nèi)，nNOS有單體和二聚體兩種形式混合存在，二聚體是其活性形式，四氫生物蝶呤(BH4)和L-精氨酸是其形成的必要物質(zhì)，缺乏BH4或者L-精氨酸會(huì)導(dǎo)致nNOS解偶聯(lián)，從而增加超氧化物的產(chǎn)生[15]。

通過本次研究，我們改進(jìn)并穩(wěn)定了脂多糖快速誘導(dǎo)腦微出血的大鼠模型，通過大體標(biāo)本、HE染色、MRI的SWI序列均表明腦內(nèi)及腦表面有微出血的存在。全身炎癥反應(yīng)或者炎癥相關(guān)標(biāo)記物的增加與正常老化[16]、腦卒中[17]、高血壓[18]等有顯著的相關(guān)性。急性炎癥可以導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血腦屏障破壞[19]。LPS通過增加全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞增生，對(duì)血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生破壞作用，從而導(dǎo)致微出血的產(chǎn)生。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，生理?xiàng)l件下nNOS的表達(dá)很少，而在LPS誘導(dǎo)的CMBS的病理過程中，nNOS活性顯著增強(qiáng)，參與CMBS的形成。

但是，就目前的研究而言，nNOS活性增強(qiáng)和腦微出血之間的因果關(guān)系及二者之間相互作用的機(jī)制都不十分清楚，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將圍繞這兩方面的問題展開研究，希望對(duì)CMBS有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

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Neuronalnitricoxidesynthaseisinvolvedincerebralmicrobleedsinducedbylipopolysaccharideinrats

ZENGJing，LIDandan，LIUZhixin,etal.

(ArmyGeneralHospitalofPLA，Beijng100700，China)

ObjectiveTo improve the method of cerebral microbleeds(CMBS) model induced by lipopolysaccharide (LPS) and investigate the effect of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in CMBS.MethodsAnimals were classified into two groups:LPS treatment group (n=20) and saline control group (n=20).LPS group were treated with 1 mg/ml,3 mg/kg,LPS or the same dose of saline by intraperitoneal injection on 0 h、12 h and 24 h.After 48 h,head MRI scan,SWI sequence showed microbleeds.Immunofluorescence staining showed that the expression of microglia marker Iba.Western blot analysis the expression of nNOS and ZO-1 (molecular markers of the blood brain barrier).ResultsAdministration of 3 mg/kg LPS group appeared point low signal in the SWI sequence.Western blot and immunofluorescence showed that ZO-1 significantly reduced while Iba and nNOS expression increased significantly.ConclusionLPS may increase the systemic inflammatory response,promote the proliferation of microglia in the brain,increase the expression of nNOS,and destroy the blood-brain barrier of the central nervous system,leading to the occurrence of CMBS.

Cerebral microbleeds; Lipopolysaccharide; Neuronal nitric oxide synthase; SWI; Blood-brain barrier

R743.34

A

1003-2754(2017)10-0868-04

2017-08-14；

2017-10-03

(1.中國人民解放軍陸軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100700；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；3.北京四環(huán)制藥有限公司，北京 101113；4.中國人民解放軍第四五一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710054)

黃勇華，E-mail：huangyh@163.com