鄧秋穗, 唐 霞, 蔡 潤(rùn), 許瀚月, 張睿韜, 李冰潔, 李司晨, 徐 恒, 汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610064)

微生物修復(fù)重金屬污染土壤探究

鄧秋穗, 唐 霞, 蔡 潤(rùn), 許瀚月, 張睿韜, 李冰潔, 李司晨, 徐 恒, 汪 紅

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610064)

利用微生物對(duì)重金屬的鈍化作用，制備微生物鈍化劑并應(yīng)用于重金屬污染土壤的治理。通過(guò)研究重金屬污染土壤中微生物的性質(zhì)，篩選出能有效處理土壤中重金屬污染的優(yōu)良菌種CQ7與FQ2;對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行表征，并測(cè)定其生長(zhǎng)曲線,鑒定FQ2為革蘭氏陰性桿菌。進(jìn)一步對(duì)篩選出的菌種進(jìn)行理化條件測(cè)定，測(cè)定得CQ7與FQ2的最適生長(zhǎng)條件均為pH=5、轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度25 ℃。經(jīng)金屬耐受和吸附實(shí)驗(yàn)，選定FQ2為工程菌，測(cè)序確定其為沙雷氏菌屬(Serratiamarcuscens)。將篩選所得菌種與相應(yīng)理化條件相結(jié)合，制備微生物鈍化劑，設(shè)計(jì)自動(dòng)化重金屬污染土壤修復(fù)設(shè)備，對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了初步規(guī)劃。

微生物鈍化劑； 重金屬污染； 自動(dòng)化修復(fù)儀

隨著現(xiàn)代社會(huì)的進(jìn)步，土壤重金屬(As、Cd、Hg、Pb等)污染日益嚴(yán)重，如何修復(fù)重金屬污染土壤成為人類不可忽視的問(wèn)題[1-3]。鎳鉛鉻等重金屬是某些低等生物和植物的必需微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，同時(shí)也是一種致癌的毒性元素[4]。

細(xì)菌尺寸小，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可以用來(lái)作為生物吸附劑[7]， 2010年， Polti報(bào)道從鉻鐵礦中分離并鑒定了一株Bacillusamyloliquefaciens(CSB 9) 。該菌可以耐受900 mg/L Cr(VI)，在最佳條件下具有較快的還原速度(2.22 mg Cr(VI)/(L·h)[8-10]。2014年，Yang 等考察了PannonibacterphragmitetusBB在強(qiáng)化鉻污染修復(fù)過(guò)程中的作用，并且考察了土壤土著微生物群落變化的規(guī)律。結(jié)果表明，在Cr(VI) 濃度為518.84 mg /kg、pH 8.64 的條件下，P．PhragmitetusBB可以在2 d內(nèi)將Cr(VI)全部還原。該菌在接入土壤后的48 h 內(nèi)數(shù)量顯著上升，相對(duì)比例由35.5%上升至74.8%，并維持穩(wěn)定[11]。

已有研究人員針對(duì)微生物修復(fù)，做出了菌種對(duì)部分重金屬污染土壤修復(fù)的研究[12]，但是國(guó)內(nèi)外對(duì)于重金屬污染土壤的綜合高效修復(fù)微生物設(shè)備仍鮮有報(bào)道[13]，缺少微生物鈍化劑的自動(dòng)化產(chǎn)品。本課題綜合前人相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了針對(duì)重金屬污染土壤的高效微生物鈍化劑，并且計(jì)劃最終形成工業(yè)產(chǎn)品，該成果將可能成為治理重金屬污染土壤的有效途徑。

1 材料與方法

1.1高效修復(fù)重金屬污染土壤的菌種篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)

1.1.1 污泥稀釋液的制備

稱取污泥樣品5 g，加入到含有45 mL無(wú)菌水的錐形瓶中(放少許玻璃珠)，恒溫?fù)u床室溫振蕩30 min；然后取1 mL污泥懸液加入到含有9 mL無(wú)菌水的試管中，充分混勻，逐級(jí)稀釋至10-5的污泥懸液[14]。

1.1.2 平板涂布

取10 mL實(shí)驗(yàn)室的水樣，采用系列稀釋涂布法(10-5倍),將10-3、10-4、10-5稀釋度的水樣分別涂布于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)培養(yǎng)皿，37 ℃，培養(yǎng)1～2 d后觀察[15]。對(duì)部分優(yōu)勢(shì)菌繼續(xù)在選擇培養(yǎng)基上劃線分離，直至得到單一菌落。

1.1.3 菌株篩選

挑取菌落特征明顯不同的菌株，分別采用三線法劃線移接到含重金屬離子、濃度逐步提高的LB平板上繼續(xù)培養(yǎng)，得到菌株后再經(jīng)過(guò)多次分離純化,4 ℃保存[16]，記錄單一菌落的特征。

1.2 菌株最適生長(zhǎng)理化條件選擇

1.2.1 基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基正常條件下生長(zhǎng)曲線測(cè)定

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養(yǎng)基中，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min 培養(yǎng)兩株菌0～24 h及24～48 h，每間隔2 h測(cè)定一次600 nm下的吸光值，記為OD600，繪制0～48 h的菌株生長(zhǎng)曲線，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)做2次。

1.2.2 最適生長(zhǎng)的pH條件篩選

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養(yǎng)基中，溫度37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min，pH分別設(shè)置為4、5、6、7、8、10，分別培養(yǎng)兩株菌0～24 h及24～33 h，每間隔4～5 h測(cè)定一次600 nm處的OD值，繪制0～33 h的菌株生長(zhǎng)曲線，每一組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2瓶，取樣2次作對(duì)照，比較不同pH條件下菌株的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 最適生長(zhǎng)的溫度條件篩選

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度分別設(shè)置為25、37、40 ℃，分別培養(yǎng)兩株菌0～24 h及24～33 h，每間隔4～5 h測(cè)定一次600 nm處的OD值，繪制0～33 h的菌株生長(zhǎng)曲線，每一組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2瓶，取樣2次作對(duì)照，比較不同溫度條件下菌株的生長(zhǎng)情況。

1.2.4 最適生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)速條件篩選

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養(yǎng)基中，溫度 37℃，設(shè)置轉(zhuǎn)速分別為140、180 r/min；分別培養(yǎng)2株菌0～24 h及24～33 h，每間隔4～5 h測(cè)定一次600 nm處的OD值，繪制0～33 h的菌株生長(zhǎng)曲線，每一組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2瓶，取樣2次作對(duì)照，比較不同溫度條件下，菌株的生長(zhǎng)情況。

1.2.5 菌對(duì)重金屬耐受力的測(cè)定

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化；分別取2 mL活化菌液涂布于含重金屬離子，濃度逐步提高的LB平板上繼續(xù)培養(yǎng)(通常培養(yǎng)5 d左右)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.6 16S rDNA序列測(cè)定

活化工程菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，利用天根試劑盒提取基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增16S rDNA序列，將產(chǎn)物送至成都飛騰博川生物技術(shù)有限公司測(cè)序,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，鑒定工程菌種屬。

1.2.7 掃描電鏡觀察

活化工程菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，送往四川大學(xué)分析測(cè)試中心，使用掃描電鏡對(duì)FQ2菌株掃描觀察，電子能譜分析，對(duì)其吸附重金屬能力進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 自動(dòng)化重金屬污染微生物修復(fù)儀初步設(shè)計(jì)

產(chǎn)品以現(xiàn)有類似機(jī)械(插秧機(jī))為藍(lán)本，根據(jù)所需的微生物吸附(分泌)處理土壤中重金屬這一目的加以重新設(shè)計(jì)與定向改造,并基于模塊化設(shè)計(jì)理念，主要有自動(dòng)化重金屬檢測(cè)連動(dòng)裝置、微生物鈍化裝置、菌種保藏裝置、負(fù)重輪和發(fā)動(dòng)機(jī)5大主要部件。通過(guò)借鑒現(xiàn)有成熟農(nóng)用機(jī)械系統(tǒng)，降低非必需成本，以達(dá)到較高的安全性和實(shí)用性，同時(shí)間接降低維護(hù)與升級(jí)成本。

2 結(jié)果與分析

2.1高效修復(fù)重金屬污染土壤的菌種篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)共篩選出2株優(yōu)良菌株，CQ7與FQ2。對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行表征測(cè)定，觀察其菌落形成。CQ7菌落呈圓形，形狀規(guī)則，菌落直徑約為2～3 mm，顏色為乳白色，正面與背面顏色相同，菌落表面粗糙、干燥、半透明，邊緣整齊(見圖 1(a))。FQ2菌落呈圓形，形狀規(guī)則，菌落直徑約為1～2 mm；顏色為乳白色，正面與背面顏色相同，菌落表面光滑、濕潤(rùn)、半透明，邊緣整齊(見圖 1(b))；放于25 ℃左右培養(yǎng)時(shí)，菌表面產(chǎn)生紅色素(見圖1(c))，革蘭氏染色顯示為革蘭氏陽(yáng)性桿菌(見圖1(d))。

圖1 CQ7及FQ2菌落形態(tài)與革蘭氏染色

2.2 菌株最適生長(zhǎng)理化條件選擇

2.2.1 基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基默認(rèn)篩選條件下生長(zhǎng)曲線測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖2)表明，F(xiàn)Q2和CQ7 2 h后開始較快增殖，5～20 h平穩(wěn)較快增殖，20 h后FQ2數(shù)目趨于穩(wěn)定，CQ2數(shù)目少許增長(zhǎng)。可見FQ2的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為5～20 h,CQ7對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為5～30 h。

2.2.2 最適生長(zhǎng)的pH條件篩選

比較對(duì)數(shù)期(FQ2為5～20 h，CQ7為5～30 h)FQ2和CQ7的生長(zhǎng)情況可知，pH=5更有利于CQ7增殖(見圖3(a))；pH=5至pH=8都有利于FQ2增殖(見圖3(b))。pH=10時(shí)，CQ7和FQ2增殖情況較差，這兩種菌均不耐受堿性環(huán)境。pH=4時(shí)，CQ7不增殖，F(xiàn)Q2正常增殖?？梢姡現(xiàn)Q2比CQ7更能適應(yīng)酸性環(huán)境。

圖2 基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基正常條件下生長(zhǎng)曲線

2.2.3 最適生長(zhǎng)的溫度條件篩選

比較對(duì)數(shù)期時(shí)FQ2和CQ7的生長(zhǎng)情況可知，CQ7和FQ2的最適生長(zhǎng)溫度都為25 ℃(見圖4)。

圖4 CQ7和FQ2的最適溫度條件篩選

2.2.4 最適生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)速條件篩選

比較對(duì)數(shù)期時(shí)FQ2和CQ7的生長(zhǎng)情況可知，CQ7的最適轉(zhuǎn)速為180 r/mi,轉(zhuǎn)速對(duì)FQ2的影響不大(見圖5)。

圖5 CQ7和FQ2的最適生長(zhǎng)轉(zhuǎn)速篩選

2.3 微生物菌株鈍化劑設(shè)計(jì)

2.3.1 菌對(duì)重金屬耐受力的測(cè)定

對(duì)獲得的菌株鈍化劑進(jìn)行重金屬耐受力檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果：CQ7抗鎳濃度為100 mg/L，抗鉛濃度為250 mg/L，在鎳和鉛同時(shí)存在的情況下最高耐受30 mg/L，耐受重金屬的能力太弱，故放棄該菌株；FQ2抗鎳濃度為500 mg/L，抗鉛濃度為900 mg/L，在鎳和鉛同時(shí)存在的情況下最高耐受100 mg/L的鎳和100mg/L的鉛。此外，還測(cè)定了CQ7和FQ2的溶磷、產(chǎn)IAA能力(見表1)。比較可見，F(xiàn)Q2具有高效修復(fù)多種重金屬污染土壤的能力。

表1 CQ7與FQ2的溶磷能力與產(chǎn)IAA能力

2.3.2 FQ2 16S rDNA序列測(cè)定

待活化菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，提取菌株基因組DNA，PCR擴(kuò)增16SrDNA序列，將產(chǎn)物送至成都飛騰博川生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得FQ2菌株16S RNA序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，該菌株為沙雷氏菌屬Serratiamarcuscens。菌株的16S rDNA序列如下：

2.3.3 菌株掃描電鏡觀察檢測(cè)

待活化菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，取FQ2菌液進(jìn)行掃描電鏡檢測(cè)。結(jié)果顯示：FQ2為桿菌表面粗糙(見圖 6(a)),加入重金屬后FQ2細(xì)胞變大，出現(xiàn)破裂(見圖6(b))；選定部分區(qū)域，進(jìn)一步進(jìn)行電子能譜分析，發(fā)現(xiàn)FQ2對(duì)重金屬鉛表現(xiàn)出較高的吸附作用(見圖6(c)和6(d)，表2)

圖6 FQ2電鏡掃描檢測(cè)

元素線類型質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%原子百分比/%標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)簽廠家標(biāo)準(zhǔn)CK線系64.2972.31CVit是OK線系32.5627.49SiO2是NiK線系0.000.00Ni是PbM線系3.150.21PbTe是

2.4 自動(dòng)化重金屬污染微生物修復(fù)儀初步設(shè)計(jì)

2.4.1 自動(dòng)化重金屬檢測(cè)連動(dòng)裝置

該修復(fù)儀整體構(gòu)型如一輛自動(dòng)駕駛農(nóng)用車(見圖7(a))，尺寸大小可根據(jù)實(shí)際需要處理的土壤面積需求而定。修復(fù)儀只需開啟便可自動(dòng)運(yùn)行。該修復(fù)儀中后部設(shè)置有重金屬檢測(cè)裝置，底板處檢測(cè)孔(見圖 7(c))接觸土壤，由后部的檢測(cè)裝置自動(dòng)檢測(cè)，數(shù)據(jù)輸出于后上方顯示屏，當(dāng)達(dá)到一定污染值時(shí)，啟動(dòng)土壤pH檢測(cè)裝置，匹配對(duì)應(yīng)土壤pH啟動(dòng)菌種保藏箱選擇該pH最適生長(zhǎng)的菌種，將菌種輸入插入式重金屬污染處理裝置對(duì)土壤進(jìn)行處理，否則修復(fù)儀繼續(xù)向前移動(dòng)。

2.4.2 菌種保藏箱

修復(fù)儀的中部為大規(guī)模的菌種保藏箱(見圖7(e))，采用最適條件培養(yǎng)有篩選出的具有優(yōu)秀處理土壤重金屬污染能力的菌種。培養(yǎng)箱(保藏箱)內(nèi)分多個(gè)培養(yǎng)空間，有兩大類使用方式。方式一：多個(gè)培養(yǎng)空間分別培養(yǎng)有不同最適pH的菌種，該菌種保藏箱與底部伸縮底盤連接，在接到pH檢測(cè)裝置的指令時(shí)，可將對(duì)應(yīng)土壤pH范圍最適生長(zhǎng)的菌種經(jīng)過(guò)下行裝置排放至底板(圖 7(e))，準(zhǔn)備對(duì)土壤進(jìn)行處理；方式二：其一培養(yǎng)空間培養(yǎng)文中菌種，另有空間儲(chǔ)藏有石灰水等調(diào)節(jié)pH的試劑，可在土壤pH檢測(cè)后，根據(jù)菌種生存所需最適pH，先投放pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)土壤pH至菌種生存范圍，再投放菌種。

經(jīng)多方研究，補(bǔ)充可適用于該裝置的菌株，最適生長(zhǎng)pH覆蓋范圍為pH 4～pH 10，范圍廣泛(見表3)。

表3 可適用于自動(dòng)化土壤重金屬污染修復(fù)儀的菌株補(bǔ)充

表3(續(xù))

2.4.3 插入式重金屬污染處理裝置

修復(fù)儀參照扦插裝置，在修復(fù)儀底部設(shè)置了大面積可伸縮底盤，底盤下為多排伸縮高壓槍頭(見圖7(b))。槍頭配備有防土壤堵塞的開關(guān)裝置，進(jìn)入土壤過(guò)程中開關(guān)關(guān)閉，進(jìn)入土壤后開關(guān)打開，可釋放菌液。修復(fù)儀可根據(jù)對(duì)該處土壤的重金屬檢測(cè)情況來(lái)選擇是否打開底盤伸出槍頭進(jìn)行處理，節(jié)約微生物資源。當(dāng)接收到處理土壤的指令時(shí)，對(duì)應(yīng)土壤pH的最適菌種進(jìn)入底盤，底盤伸出，攜帶菌株至槍頭，槍頭開關(guān)打開，經(jīng)壓力裝置使菌液進(jìn)入土壤中。槍頭實(shí)現(xiàn)可伸縮，使其對(duì)土壤的作用深度較深，由表及里，達(dá)到立體去除約1 m深的土壤中主要重金屬離子的效果。

2.4.4 負(fù)重輪和發(fā)動(dòng)機(jī)

由現(xiàn)有的拖拉機(jī)等大型農(nóng)用機(jī)械的履帶式負(fù)重輪改裝，機(jī)動(dòng)性較強(qiáng)，可適應(yīng)四川地區(qū)的多種農(nóng)田作業(yè)。

采用農(nóng)用機(jī)械常用的15～73.5 kW中型柴油發(fā)動(dòng)機(jī)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)獲得沙雷氏菌屬Serratiamarcuscens菌株FQ2，測(cè)定得FQ2對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)開始5 h至20 h，最適條件為pH=5、溫度25℃，轉(zhuǎn)速180 r/min與140 r/min無(wú)明顯區(qū)別。重金屬耐受實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Q2具有較強(qiáng)的重金屬耐受力，其抗鎳濃度為500 mg/L，抗鉛濃度為900 mg/L，在鎳和鉛同時(shí)存在的情況下最高耐受100 mg/L鎳和100mg/L鉛。電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FQ2對(duì)鉛有吸附作用。

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Research on microbial remediation of heavy metal contaminated soil

Deng Qiusui, Tang Xia, Cai Run, Xu Hanyue, Zhang Ruitao, Li Bingjie, Li Sichen, Xu Heng, Wang Hong

(College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

Inactivation of heavy metals by microorganisms is used for preparing the microbial passivating agent and applying it to the treatment of heavy metal contaminated soil. Through the study on the properties of microorganisms in heavy metal contaminated soil, the fine strains CQ7 and FQ2 which can effectively deal with heavy metal pollution in soil are screened out. The screened strains are characterized, their growth curves are measured, and FQ2 is identified as gram negative bacillus. The physical and chemical conditions of the screened strains are further determined. The optimum conditions for the growth of CQ7 and FQ2 are pH=5, the rotational speed is 180 r/min and the temperature is 25℃. Through the metal tolerance and adsorption experiments, FQ2 is selected as the engineering bacteria and identified as the Serratia marcuscens by the sequence test. In combination of the screened strains with the corresponding physical and chemical conditions, the microbial passivator is prepared, and the automatic remedial equipment for the heavy metal contaminated soil is designed whose application prospect is primarily planned.

microbial passivator; heavy metal contamination; automatic remedial instrument

X53

A

1002-4956(2017)10-0043-07

10.16791/j.cnki.sjg.2017.10.013

2017-08-04

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD05B01-5)； 四川省科技支撐項(xiàng)目(2016NZ0050)

鄧秋穗(1996—)，女，廣西北海，本科生，主要從事微生物治理重金屬污染土壤研究

汪紅(1961—)，女，四川成都，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事微生物實(shí)驗(yàn)的教學(xué)和科研工作.

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