董運(yùn)海， 胡 蝶， 鄔敏辰， 唐詩(shī)涵， 王春娟， 李劍芳

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

定點(diǎn)突變改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶學(xué)性質(zhì)

董運(yùn)海1， 胡 蝶2， 鄔敏辰*3， 唐詩(shī)涵1， 王春娟1， 李劍芳1

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

基于糖苷水解酶5家族（GHF5）β-甘露聚糖酶一級(jí)、三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)和分析，對(duì)宇佐美曲霉GHF5 β-甘露聚糖酶AuMan5A的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸實(shí)施定點(diǎn)突變以獲得酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良的突變酶AuMan5AG320D。采用大引物PCR技術(shù)將AuMan5A基因 （Auman5A）中編碼Gly320的密碼子GGT突變?yōu)锳sp320的GAC，構(gòu)建出突變酶基因Auman5AG320D。分別將Auman5A和Auman5AG320D在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了表達(dá)，分析了表達(dá)產(chǎn)物AuMan5A和AuMan5AG320D的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：AuMan5AG320D的最適溫度Topt由突變前的65℃提升至70℃，在70℃的半衰期t1/270由原酶的10 min延長(zhǎng)至25 min；AuMan5AG320D的比活性由突變前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg，其催化效率（kcat/Km）是原酶的9.3倍。將Gly320突變?yōu)锳sp320不僅改善了AuMan5A的溫度特性，而且顯著提高了該酶的比活性和催化效率。

β-甘露聚糖酶；定點(diǎn)突變；溫度特性；比活性；催化效率

β-甘露聚糖酶 （endo-β-1，4-D-mannanases，EC 3.2.1.78）廣泛存在于各種生物體尤其是微生物中，從甘露聚糖分子主鏈的內(nèi)部隨機(jī)切割β-1，4-D-甘露糖苷鍵產(chǎn)生不同聚合度的甘露寡糖，是甘露聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的組分[1]?；谝患?jí)結(jié)構(gòu)同源性比對(duì)和疏水簇分析，β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶家族（GHF） 5、26 和 113，具有相似的（β/α）8-TIM桶狀折疊[2]。隨著甘露寡糖生理功能的發(fā)現(xiàn)、綠色飼料的興起以及半纖維素資源的開(kāi)發(fā)，β-甘露聚糖酶在諸多工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力日益凸顯[3-4]。然而，野生型β-甘露聚糖酶在酶學(xué)性質(zhì)上或多或少存在缺陷，難以滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求[5-6]。采用基因工程技術(shù)定向改造酶蛋白分子，已有較多成功的實(shí)例，但有關(guān)β-甘露聚糖酶分子改造的報(bào)道較少[7]。Li等[8]基于三維結(jié)構(gòu)分析，對(duì)酶蛋白分子進(jìn)行定向改造，提高了假蜜環(huán)菌β-甘露聚糖酶的蛋白酶耐受性。Xu等[9]通過(guò)對(duì)酶分子表面結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計(jì)并結(jié)合定點(diǎn)突變，提高了枯草芽孢桿菌β-甘露聚糖酶的耐酸性。

迄今為止，已有許多絲狀真菌的GHF5 β-甘露聚糖酶編碼基因被克隆和表達(dá)，并分析了它們的酶學(xué)性質(zhì)[10]。作者所在實(shí)驗(yàn)室克隆了Aspergillususamii GHF5 β-甘露聚糖酶基因Auman5A，并對(duì)該基因及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析[6]；其后，本實(shí)驗(yàn)室魏喜換等[11]基于理性設(shè)計(jì)并結(jié)合定點(diǎn)突變，顯著提高了AuMan5A對(duì)底物瓜爾豆膠的親和力。為進(jìn)一步改善AuMan5A的酶學(xué)性質(zhì)，本研究中通過(guò)對(duì)GHF5 β-甘露聚糖酶一級(jí)、三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)和分析，推測(cè)AuMan5A的底物結(jié)合凹槽側(cè)壁上320位點(diǎn)處的氨基酸殘基對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)有較大的影響。據(jù)此，借助定點(diǎn)突變構(gòu)建突變酶基因Auman5AG320D，將該基因在畢赤酵母GS115中表達(dá)，分析AuMan5A突變前后的溫度特性、比活性和催化效率。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌（Escherichia coli）JM109和 DH5α 菌株，畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115菌株和表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA，由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆質(zhì)粒pUCm-T，購(gòu)自上海Sangon公司；重組質(zhì)粒pUCm-T-Auman5A，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏；LB，LLB，YPD，YPDS-Zeocin，BMGY 和 BMMY 培養(yǎng)基的配制，參照 EasySelectTMPichia Expression Kit（Invitrogen公司）操作手冊(cè)。

1.2 主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶，rTaq DNA聚合酶，T4DNA連接酶，250 bpDNA Ladder Marker和低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker，均購(gòu)自大連TaKaRa公司；Zeocin和EZ-10柱式DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自上海Sangon公司；角豆膠和標(biāo)準(zhǔn)甘露糖，為Sigma公司產(chǎn)品；DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75，均為Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 β-甘露聚糖酶一級(jí)、三維結(jié)構(gòu)的分析

以 GHF5 AuMan5A一級(jí)結(jié)構(gòu)（GenBank：ADZ99027）為模板，運(yùn)用BLAST服務(wù)器在GenBank數(shù) 據(jù) 庫(kù) （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中 搜尋絲狀真菌來(lái)源的、分別與AuMan5A序列同源性＞60%的若干 GHF5 β-甘露聚糖酶序列；運(yùn)用ClustalW2 程 序 （http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）和DNAMAN 6.0軟件對(duì)這些酶進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，重點(diǎn)分析這些酶C末端一級(jí)結(jié)構(gòu)的主要差異，以確定擬突變的位點(diǎn)及在其上的氨基酸殘基。

在 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/） 尋找一種與AuMan5A序列同源性高的GHF5 β-甘露聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)，用作AuMan5A及其突變體同源建模的模板；運(yùn)用 MODELLER 9.11 程序（http：//salilab.org/modeller/）進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模。針對(duì)酶蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)，使用PyMol軟件（http：//pymol.org）分析各位點(diǎn)氨基酸殘基之間的距離（?）。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

基于GHF5 β-甘露聚糖酶一級(jí)、三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)和分析，擬將AuMan5A一級(jí)結(jié)構(gòu)中的Gly320突變?yōu)?Asp320。根據(jù) Auman5A核苷酸序列（GenBank：HQ839639）設(shè)計(jì)PCR引物，由上海Sangon公司合成。

G320D-F：5′—GGGAAGTCGCCGGATGACGGG AATACTATCTAC—3′，加框部分為突變密碼子；

Man5A-F：5′—GAATTCTCCTTCGCCAGCACC TC—3′，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；

Man5A-R：5′—GCGGCCGCTTAGGCACTATCA ATAGCAG—3′，下劃線部分為NotⅠ酶切位點(diǎn)。

以 pUCm-T-Auman5A為模板、G320D-F和Man5A-R為引物，PCR擴(kuò)增基因片段GM；再利用同一模板、Man5A-F和GM為引物，采用大引物PCR技術(shù)[12]擴(kuò)增突變酶基因Auman5AG320D。將目的PCR產(chǎn)物與pUCm-T連接，獲重組質(zhì)粒pUCm-TAuman5AG320D，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。將pUCm-T-Auman5A和pUCm-T-Auman5AG320D分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收目的條帶，與經(jīng)同樣雙酶切的pPICZαA連接，獲重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Auman5A和pPICZαA-Auman5AG320D，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α，DNA 測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 β-甘露聚糖酶的表達(dá)和純化

將測(cè)序正確的pPICZαA-Auman5A和pPICZαAAuman5AG320D分別用SacⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115，具體操作參照基因脈沖儀（Bio-Rad公司）說(shuō)明書。重組畢赤酵母的鑒定、多拷貝篩選和誘導(dǎo)表達(dá)等參照EasySelectTMPichia Expression Kit操作手冊(cè)。誘導(dǎo)表達(dá)上清液用80%飽和度的（NH4）2SO4鹽析，離心收集沉淀，溶于適量20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 7.0）；粗酶液經(jīng)透析、超濾濃縮（膜截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000，Millipore公司），上樣DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱（2.0 cm×20 cm）， 用含 0.1～1.0 mol/L NaCl的上述磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分步收集洗脫液；合并具有β-甘露聚糖酶活性的洗脫液，超濾濃縮至1 mL，上樣 Sephadex G-75凝膠層析柱（1.6 cm×80 cm）進(jìn)行純化。

1.6 β-甘露聚糖酶活性和蛋白的分析

β-甘露聚糖酶活性測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]，并略作修改。在2.4 mL 5 mg/mL角豆膠溶液 （pH 3.6、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）中加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，65℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入2.5 mL DNS試劑，在沸水浴中顯色7 min，測(cè)定OD540值。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖（以甘露糖計(jì)）所需的酶量定義為1個(gè)β-甘露聚糖酶活性單位（U）。采用SDS-PAGE分析重組表達(dá)產(chǎn)物；Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.7 pH和溫度對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響

用不同pH值（pH 2.5～7.0）的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制角豆膠溶液，按1.6方法測(cè)定酶活性。最適pH定義為最高酶活性 （以相對(duì)酶活性100%計(jì)）所對(duì)應(yīng)的pH值。將酶液在不同pH值（pH 2.0～10.0檸檬酸-Na2HPO4緩沖液）、40℃保溫60 min，按1.6方法測(cè)定殘余酶活性。酶的pH穩(wěn)定性定義為殘余酶活性在85%以上的pH范圍。

在不同溫度（50～75℃）下，按1.6方法測(cè)定酶活性。最適溫度Topt定義為最高酶活性（以相對(duì)酶活性100%計(jì)）所對(duì)應(yīng)的溫度。將酶液置于70℃下處理0～80 min，按1.6方法測(cè)定殘余酶活性，未經(jīng)處理酶液的酶活性以100%計(jì)。酶的半衰期t1/270定義為經(jīng)70℃處理殘余酶活性為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的時(shí)間。

1.8 β-甘露聚糖酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

以不同濃度 （1.0～10.0 mg/mL）的角豆膠溶液（用 pH 3.6、50 mmol/L檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制）為底物，在酶各自的最適溫度下按1.6方法測(cè)定其活性，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合，計(jì)算β-甘露聚糖酶的Km和kcat值。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuMan5A關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的確定

將 AuMan5A序列 （ADZ99027）分別與其它GHF5 β-甘露聚糖酶序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AuMan5A 與 硫 色 曲 霉 （Aspergillussulphureus，AsMan5A，ABC59553）、 棘 孢 曲 霉 （A.aculeatus，AaMan5A，AAA67426）、 構(gòu) 巢 曲 霉 （A.nidulans，AnMan5A，AGG69666） 和嗜松青霉 （Penicilliumpinophilum，PpMan5A，AEV41143） β-甘露聚糖酶的同源性較高，分別為94%、74%、67%和63%。再運(yùn)用ClustalW2程序?qū)@5種酶進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，其中C末端的比對(duì)結(jié)果如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，AuMan5A 320 位點(diǎn)處為 Gly（G），而其它 4 種 β-甘露聚糖酶與之對(duì)應(yīng)的均為Asp（D，用紅框表示）。

圖1 5種不同來(lái)源的GHF5 β-甘露聚糖酶C末端的多序列同源性比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of C-termini among fiveGHF5β-mannanasesfrom different organisms

通過(guò)在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋，選定與AuMan5A同源性最高的黑曲霉 （A.niger）β-甘露聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB：3WH9）為模板，對(duì)AuMan5A進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模?；谌S結(jié)構(gòu)的比對(duì)和分析，發(fā)現(xiàn)AuMan5A 320位點(diǎn)處的Gly位于其一個(gè)loop結(jié)構(gòu)（306W～G327） 內(nèi)， 該 loop結(jié)構(gòu)的部分序列（317SPDGGN322）在三維結(jié)構(gòu)上參與構(gòu)成了底物結(jié)合凹槽的側(cè)壁（圖2）。Dilokpimol等[14]分析認(rèn)為該位點(diǎn)氨基酸 （通常為Asp）參與構(gòu)成了底物結(jié)合位點(diǎn)（subsite）-2。 同時(shí)，該位點(diǎn)鄰近于在 GHF5 β-甘露聚糖酶中絕對(duì)保守的Trp位點(diǎn)（如AuMan5A 306位點(diǎn)處的Trp），該保守位點(diǎn)是subsite-1處結(jié)合糖環(huán)的疏水平臺(tái)[15]。Huang等[10]構(gòu)建了AnMan5A的兩個(gè)突變體W306G和W306Y，它們的酶活性分別僅為野生型酶的6%和11%。上述對(duì)GHF5 β-甘露聚糖酶一級(jí)、三維結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，AuMan5A 320位點(diǎn)處的氨基酸殘基可能對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)有較大影響。據(jù)此，借助定點(diǎn)突變將Gly320突變?yōu)槠渌概c之對(duì)應(yīng)的Asp320。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將AuMan5A一級(jí)結(jié)構(gòu)中編碼Gly320的密碼子GGT突變?yōu)榫幋aAsp320的GAC。以pUCm-TAuman5A為模板、G320D-F和Man5A-R為引物，經(jīng)第一輪PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約為100 bp的基因片段GM（圖3泳道1）；再利用同一模板、Man5A-F和GM為引物，經(jīng)第二輪PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約為1050 bp的突變酶基因Auman5AG320D（圖3泳道2）。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。分別將酶基因Auman5A和Auman5AG320D克隆至pPICZαA，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Auman5A 和 pPICZαA-Auman5AG320D。

圖2 AuMan5A三維結(jié)構(gòu)的表面構(gòu)型Fig.2 Surface conformation of the three-dimensional structure of AuMan5A

圖3 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析（12 g/L）Fig.3 AnalysisofPCR productsby agarose gel electrophoresis（12 g/L）

2.3 β-甘露聚糖酶的表達(dá)和純化

挑選若干在 YPDS-Zeocin（400 μg/mL） 平板上生長(zhǎng)良好的單菌落，按照EasySelectTMPichia Expression Kit操作手冊(cè)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選到2個(gè)產(chǎn)AuMan5A和AuMan5AG320D活性最高的轉(zhuǎn)化子GS115/Auman5A和GS115/Auman5AG320D，酶活性分別為50.8和304.2 U/mL，空白對(duì)照GS115/pPICZαA上清液中未檢測(cè)到β-甘露聚糖酶活性。將2個(gè)轉(zhuǎn)化子的表達(dá)上清液分別經(jīng)（NH4）2SO4鹽析、陰離子交換層析和凝膠層析分離純化。SDS-PAGE分析顯示，純化的AuMan5A和AuMan5AG320D均在約49.5×103（表觀相對(duì)分子質(zhì)量）處呈現(xiàn)單一條帶（圖4）。按1.6方法測(cè)得純化酶的比活性分別為351.2 U/mg和 1 729.1 U/mg。

圖4 誘導(dǎo)表達(dá)上清液和純化酶的SDS-PAGE分析Fig.4 Analysisoftheexpression supernatantsand purified enzymes by SDS-PAGE

2.4 β-甘露聚糖酶pH和溫度特性的分析

按1.7方法分析了pH對(duì)AuMan5A和AuMan5AG320D活性的影響，結(jié)果顯示AuMan5A和AuMan5AG320D均在pH值為3.5時(shí)具有最大的催化活性，且在pH 3.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。單點(diǎn)突變并未影響AuMan5A的pH特性。

按1.7方法分析了溫度對(duì)AuMan5A和AuMan5AG320D活性的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5（a） 可見(jiàn)，AuMan5AG320D的最適溫度 Topt為 70 ℃，較AuMan5A的65℃略有提升。由圖5（b）可見(jiàn)，AuMan5AG320D在 70℃的半衰期 t1/270為 25 min，是AuMan5A（t1/270=10 min）的2.5倍。分析結(jié)果顯示，將Gly320突變?yōu)锳sp320改善了AuMan5A的溫度特性。

圖5 AuMan5A和AuMan5AG320D溫度特性的分析Fig.5 Temperature characteristics of AuMan5A and AuMan5AG320D

按1.3方法模擬了AuMan5AG320D的三維結(jié)構(gòu)。在酶蛋白分子三維結(jié)構(gòu)上，利用PyMol軟件測(cè)得在AuMan5AG320D中Asp320與Trp306之間的距離為2.9 ?，處于氫鍵成鍵距離之內(nèi)[16]，而在AuMan5A中Gly320與Trp306的距離超出了形成氫鍵的范圍（圖6）。由此推測(cè)，Asp320與Trp306所形成的氫鍵可使參與底物結(jié)合凹槽側(cè)壁構(gòu)成的部分loop結(jié)構(gòu)（317SPDGGN322）更加穩(wěn)固，增加了酶蛋白分子的剛性[17]。

圖6 AuMan5A和AnMan5AG320D局部結(jié)構(gòu)的比對(duì)和分析Fig.6 Comparison ofthelocalstructuresbetween AuMan5A and AnMan5AG320D

2.5 酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

在AuMan5A和AuMan5AG320D各自的最適溫度（Topt=65℃和70℃）下，按1.8方法測(cè)得AuMan5A和AuMan5AG320D對(duì)角豆膠的Km值分別為1.75和0.99 mg/mL，kcat值分別為 584.2 和 3 058.6 s-1；AuMan5AG320D的催化效率 （kcat/Km）是AuMan5A的9.3倍。測(cè)定結(jié)果顯示，將Gly320突變?yōu)锳sp320顯著提高了AuMan5A的催化效率。

3 結(jié) 語(yǔ)

基于理性設(shè)計(jì)對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)上的氨基酸殘基進(jìn)行單點(diǎn)突變，可使酶的比活性或催化效率大幅度提高。如Srikrishnan等[18]基于內(nèi)切葡聚糖酶一級(jí)、三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)和分析，所獲Thermoascusaurantiacus內(nèi)切葡聚糖酶Eg1單點(diǎn)突變子Y95F的催化效率較野生型酶提高了4.4倍；Cheng等[19]通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)解析，并結(jié)合單點(diǎn)突變（Y61G），將Thermotogamaritima纖維素酶Cel12A的比活性提高了70%。

本研究中以宇佐美曲霉AuMan5A為對(duì)象，基于絲狀真菌的GHF5 β-甘露聚糖酶一級(jí)、三維結(jié)構(gòu)的比對(duì)和分析，推測(cè)AuMan5A底物結(jié)合凹槽側(cè)壁上320位點(diǎn)處的氨基酸殘基對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)有較大的影響。在此分析基礎(chǔ)上，采用大引物PCR技術(shù)將Auman5A中編碼Gly320的密碼子GGT突變?yōu)锳sp320的GAC，構(gòu)建出突變酶基因Auman5AG320D。分別將Auman5A和Auman5AG320D在畢赤酵母GS115中進(jìn)行了表達(dá)，分析了重組表達(dá)產(chǎn)物AuMan5A和AuMan5AG320D的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，將Gly320突變?yōu)锳sp320不僅改善了AuMan5A的溫度特性，而且顯著提高了該酶的比活性和催化效率。產(chǎn)AuMan5AG320D的重組酵母菌株有望用于β-甘露聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

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會(huì)議名稱(中文)：第五屆食用昆蟲(chóng)與微生物轉(zhuǎn)化廢棄物及資源化利用研討會(huì)

所屬學(xué)科：動(dòng)植物微生物學(xué),細(xì)胞生物學(xué),植物營(yíng)養(yǎng)學(xué),農(nóng)林植物保護(hù)學(xué)

開(kāi)始日期：2017-09-22 結(jié)束日期：2017-09-25

所在城市：湖北省 武漢市

主辦單位：中國(guó)微生物學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)微生物專業(yè)委員會(huì)、環(huán)境微生物專業(yè)委員會(huì)和微生物資源專業(yè)委員會(huì)、中國(guó)昆蟲(chóng)學(xué)會(huì)昆蟲(chóng)微生物組專業(yè)委員會(huì)

承辦單位：湖北省暨武漢微生物學(xué)會(huì)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

摘要截稿日期：2017-09-10 聯(lián)系人：鄭龍玉 博士 E-MAIL：ly.zheng@mail.hzau.edu.cn

會(huì)議網(wǎng)站：http://csm.im.ac.cn/templates/team/introduction.aspx?nodeid=9&page=ContentPage&contentid=4835

會(huì)議背景介紹：昆蟲(chóng)在自然界有一百多萬(wàn)種，占地球上生物種類的一半以上。除有害種類外，有益種類在食用（飼用、食用、藥用）、環(huán)境治理、工業(yè)資源、觀賞、土壤改良等方面發(fā)揮著極其重要的作用，它還蘊(yùn)藏著豐富的昆蟲(chóng)微生物資源。昆蟲(chóng)與微生物密不可分，在食用昆蟲(chóng)與微生物聯(lián)合轉(zhuǎn)化廢棄物變廢為寶的過(guò)程中，微生物在提高廢棄物轉(zhuǎn)化效率、拮抗病原微生物、降解抗生素、引誘成蟲(chóng)交配產(chǎn)卵等方面發(fā)揮著極其重要作用，已成為國(guó)內(nèi)外研發(fā)的熱點(diǎn)。我國(guó)每年產(chǎn)生畜禽糞便38億噸，餐廚剩余物上億噸，嚴(yán)重污染了環(huán)境，并可能傳播疾病、威脅人類安全。隨著人口大幅增長(zhǎng)和養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，飼料與人類競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的問(wèn)題日益凸顯，食用昆蟲(chóng)與微生物轉(zhuǎn)化廢棄物，能提供蟲(chóng)體蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能微生物肥料，完全做到零排放，可以創(chuàng)造顯著的經(jīng)濟(jì)效益。在《國(guó)家中長(zhǎng)期科技發(fā)展綱要（2006-2020）》中，已將“綜合治污與廢棄物循環(huán)利用”列為農(nóng)業(yè)重點(diǎn)領(lǐng)域和優(yōu)先主題。為此，由中國(guó)微生物學(xué)會(huì)農(nóng)業(yè)微生物專業(yè)委員會(huì)、環(huán)境微生物專業(yè)委員會(huì)和微生物資源專業(yè)委員會(huì)、中國(guó)昆蟲(chóng)學(xué)會(huì)昆蟲(chóng)微生物組專業(yè)委員會(huì)聯(lián)合主辦，湖北省暨武漢微生物學(xué)會(huì)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院共同承辦的【第五屆食用昆蟲(chóng)與微生物轉(zhuǎn)化廢棄物及資源化利用研討會(huì)】暨【第二屆昆蟲(chóng)腸道微生物與環(huán)境治理學(xué)術(shù)研討會(huì)】，定于 2017年 9月 22-25日在武漢召開(kāi)。

研討會(huì)內(nèi)容：

（1）食用昆蟲(chóng)與微生物聯(lián)合轉(zhuǎn)化畜禽糞便工藝及機(jī)制；（2）食用昆蟲(chóng)的基因組學(xué)與基因工程；（3）昆蟲(chóng)腸道微生物多樣性及研究新技術(shù)；（4）昆蟲(chóng)腸道微生物資源挖掘及應(yīng)用；（5）昆蟲(chóng)腸道微生物功能及其與宿主互作；（6）昆蟲(chóng)抗菌物質(zhì)的研究與應(yīng)用；（7）昆蟲(chóng)與微生物高效降解木質(zhì)纖維素系統(tǒng)；（8）食用昆蟲(chóng)與微生物無(wú)害化處理餐廚剩余物工藝及應(yīng)用；（9）食用昆蟲(chóng)作為飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用（10）食用昆蟲(chóng)與微生物轉(zhuǎn)化有機(jī)廢棄物開(kāi)發(fā)功能肥料及應(yīng)用。

Improvement in the Enzymatic Properties of β-Mannanase（AuMan5A） by Site-Directed Mutagenesis

DONG Yunhai1， HU Die2， WU Minchen*3， TANG Shihan1， WANG Chunjuan1， LI Jianfang1
（1.SchoolofFood Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Schoolof Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Based on comparison and analysis of primary and three-dimensional （3-D）structures of glycoside hydrolase family 5 （GHF5） β-mannanases，an amino acid at the key site of Aspergillususamii GHF5 β-mannanase （AuMan5A） was subjected to site-directed mutagenesis to obtain a mutant enzyme AuMan5AG320Dwith superior enzymatic properties.Using the megaprimer PCR method，the AuMan5AG320D-encoding gene，Auman5AG320D，was constructed by mutating the Gly320-encoding codon GGT of Auman5A into Asp320-encoding GAC.Then，two genes，Auman5A and Auman5AG320D，were extracellularly expressed in Pichia pastoris GS115 and the enzymatic properties of expressed products were analyzed.Results indicated that the optimal temperature ofAuMan5AG320Dwas 70℃ and and its half-life at 70 ℃（t1/270）was 25 min.The specific activity of AuMan5AG320Dwas increased from 351.2 U/mg to 1 729.1 U/mg and its catalytic efficiency（kcat/Km）was 9.3 times higher than that of AuMna5A.Through mutating Gly320into Asp320，this work not only improved the temperature characteristics of AuMan5A，but also significantly enhanced its specific activity and catalytic efficiency.

β-mannanase，site-directed mutagenesis，temperature characteristics，specific activity，catalytic efficiency

TS 201.25

A

1673—1689（2017）08—0819—07

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.006

2015-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271811）。

*通信作者：鄔敏辰（1962—），男，江蘇無(wú)錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與基因工程研究。E-mail：bioch@163.com

董運(yùn)海，胡蝶，鄔敏辰，等.定點(diǎn)突變改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶學(xué)性質(zhì)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（08）：819-825.