薛婷婷,陸洪省，程建光

(山東科技大學， 山東 青島 266590)

黃河三角洲鹽堿地固氮細菌的分離鑒定和生長特性研究

薛婷婷,陸洪省，程建光

(山東科技大學， 山東 青島 266590)

本研究采用傳統培養(yǎng)法，在黃河三角洲自然保護區(qū)鹽堿地地區(qū)采集了未經人為干預地區(qū)的土樣，從鹽堿土中分離篩選出耐鹽堿固氮菌，通過菌株個體形態(tài)特征、菌落特征、生理生化特征等方面進行初步鑒定。分析菌株的16S rDNA序列，從基因水平鑒定為固氮菌，并命名為SKDN-1。對耐鹽堿固氮菌的環(huán)境適應性研究表明，該菌株在28℃，搖床(150r/min)培養(yǎng)條件下，最適pH范圍為7～9，最佳利用的碳源為葡萄糖。篩選出的耐鹽堿固氮菌具有較高的堿度適應能力。因此，接種耐鹽堿固氮菌種能夠發(fā)揮固氮菌的固氮性能，提高鹽堿土中生物氮的含量。

鹽堿地；黃河三角洲；固氮細菌；分離鑒定

黃河三角洲的生態(tài)特征明顯,物種豐富,人為干預少,是珍貴物種多樣性的天然基因庫。而細菌作為土壤生態(tài)系統中物質循環(huán)和能量流動的主要參與者,起著非常重要、無法取代的作用。土壤的質量能夠影響植物的生長情況,而土壤中的微生物是其生態(tài)系統的一項重要組成成分,它是評價土壤質量變化最有潛力,且最敏感的指標[1],在整個土壤生態(tài)系統中的作用是重大的[2]。同時,土壤與植物也反作用于細菌群落的構成。因此,研究土壤中細菌的群落特征,分析細菌多樣性,不僅在微生物學的細菌進化方面具有重要意義,而且對鹽堿地土壤的改良提供參考意見。再者,由于鹽漬化土壤中的細菌能夠生存,我們猜想,這些細菌可能具有耐鹽基因,才能夠適應鹽堿環(huán)境的壓力。如果能夠找到調控耐鹽方面的基因,并轉入植物體中成功進行表達,那么這無疑為鹽堿地土壤的改良提供了另一條途徑。

本文采用傳統培養(yǎng)法，利用改良的無氮Burk's選擇培養(yǎng)基[3]，從黃河三角洲鹽堿地中篩選出耐鹽堿固氮菌，以期分離得到適應鹽堿環(huán)境的高效固氮菌，并探究不同培養(yǎng)條件對其生長特性的影響。在最優(yōu)條件下培養(yǎng)固氮菌，得到的純種菌株進行基因鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣品及培養(yǎng)基

從黃河三角洲鹽堿地采集的鹽堿化程度比較深的鹽斑土、星星草及堿蓬根際土(根系和土壤)，采樣深度15～20cm,為便于研究，將根際區(qū)分為：據根系較遠(1cm)土壤(NRS)、根表土壤(RS)、根系表面(RP)和根內(HP)。各樣品按常規(guī)方法分別混合后裝入滅菌信封袋，分別編號1號、2號、3號、4號，帶回實驗室放在4℃的冰箱內保存，供分離固氮菌之需。改良的無氮Burk's選擇培養(yǎng)基：葡萄糖20g，NaCl 10g，K2HPO40. 64g，KH2PO40.16g，MgSO4·7H2O 0.20g，CaSO4·2H2O 0.05g,，鉬酸鈉 2.5mg，FeSO415mg， 水1000mL，(瓊脂15～20g，做固體培養(yǎng)基用；瓊脂5～10g，做半固體培養(yǎng)基用)

1.2 固氮細菌的分離篩選

取5g上述2號混合土樣放50mL燒杯內，用50mL水攪拌、振蕩，約20min后，使樣品與水充分混合，將細胞分散，形成均勻菌懸液。靜置1h等溶液澄清后，吸取5mL懸浮液裝入盛有200mL選擇基培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，100r/min,30℃下培養(yǎng)3～5d后，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，重復5～6次。在改良的Bark's 培養(yǎng)基基礎上加入20g NaCl,分離出耐鹽堿的極端固氮菌，取富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，稀釋涂布于平板分離培養(yǎng)基上。30℃培養(yǎng)7天后，取單菌落重復劃線4次，直至菌落形態(tài)一致，將單菌落保存于鞋面培養(yǎng)基中，4℃冰箱保藏備用。

1.3 細菌的初步鑒定

根據現有的實驗條件,本實驗主要依據《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版) ,從菌落的形態(tài)特征、生理生化特征等方面,用傳統的鑒定方法進行鑒定。

1.3.1 菌株的形態(tài)觀察

將待鑒定菌株活化后， 將改良的無氮Burk's 選擇培養(yǎng)基制成平板，取少量菌苔進行平板劃線，將培養(yǎng)皿倒置，于30℃培養(yǎng)7～15天，觀察菌落形態(tài)特征，如菌落顏色，形狀，大小，透明度及粘度，邊緣和隆起形狀，表面光滑程度以及是否產生非水溶性色素等。

1.3.2 生理生化性質鑒定

生理生化指標包括革蘭氏染色，乙酰甲基甲醇(V.P.)試驗，甲基紅(M.R.)試驗，吲哚試驗，糖醇發(fā)酵試驗，細菌運動性測定，檸檬酸鹽試驗，產氨試驗等，方法參照參考文獻[4-5]。

1.3.3 菌株生長曲線測定

將保存在半固體培養(yǎng)基中的耐鹽堿固氮菌按 1%的接種量(100mL 培養(yǎng)基接種 1mL 活化菌液)轉接至新鮮的種子培養(yǎng)基營養(yǎng)液中，30℃下于搖床(180r/min)中培養(yǎng)，從零時開始，不同時間取出培養(yǎng)液，用722分光光度計在720nm波長下進行光密度測定。

1.4 不同條件下固氮菌生長特性研究

本試驗主要利用控制變量法研究各種因子對固氮菌生長特性的影響。以改良的無氮Burk's選擇培養(yǎng)基為基礎，根據要求相應改變其中一些組分，所有環(huán)境適應性試驗采用液體培養(yǎng)基。

1.4.1 酸堿性對固氮細菌生長的影響

把Burk's 無氮培養(yǎng)基的起始 pH 值設定在 5, 7, 9, 11 共 4 個水平，將保存在半固體培養(yǎng)基中的耐鹽堿固氮菌按 1%的接種量(100mL 培養(yǎng)基接種 1mL 活化菌液)轉接至新鮮的種子培養(yǎng)基營養(yǎng)液中，30℃下于搖床(180r/min)中培養(yǎng)，從零時開始，不同時間取出培養(yǎng)液，用722分光光度計在720nm波長下進行光密度測定。

1.4.2 碳源對耐鹽堿固氮菌生長特性的影響

Burk's 無氮培養(yǎng)基中的蔗糖分別用葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖代替, 碳含量一致, pH 值都為 9.0。將保存在半固體培養(yǎng)基中的耐鹽堿固氮菌按 1%的接種量(100mL 培養(yǎng)基接種 1mL 活化菌液)轉接至新鮮的種子培養(yǎng)基營養(yǎng)液中，30℃下于搖床(180r/min)中培養(yǎng)，從零時開始，不同時間取出培養(yǎng)液，用722分光光度計在720nm波長下進行光密度測定。

1.5 耐鹽堿固氮菌基因水平的鑒定

1.5.1 細菌基因組DNA的提取

采用UNIQ-10柱式細菌基因組抽提試劑盒對菌株進行DNA提取，提取步驟按照試劑盒說明書。

1.5.2 16S rDNA基因序列通用引物進行PCR擴增

以細菌DNA為模板，以通用引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進行PCR擴增。反應體系(25μL)：2.5μL 5×Buffer(with Mg2+)，0.5μL模板DNA，各0.5μL 7F(10uM)和1540R(10uM)，1μL dNTP(各2.5mM)，超純水定容至25μL。PCR反應條件：98℃預變性3min；98℃變性25 S，55℃退火25S，72℃延伸1min， 30個循環(huán)，再72℃延伸10min。PCR擴增產物測序由上海生工生物工程公司完成。

1.5.3 系統發(fā)育樹創(chuàng)建

將分離菌株測得的16S rDNA序列在DDBJ (DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/)數據庫中進行序列比較，選取相似度高。利用CustalX2.1和Mega5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件構建系統發(fā)育樹，系統進化距離矩陣根據Kimura模型估算[6]，創(chuàng)建方法為鄰接法(Neighbor-Joining)[7-9]

2 實驗結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)結構特征

從肉眼觀察，單菌落表面光滑，邊緣齊整，隆起，半透明，淡黃色，濕潤，油狀，粘稠，周邊光滑，但在部分菌落密集處邊緣變得不規(guī)則，菌株的形態(tài)結構特征見表1。

圖1 改良的無氮Burk's選擇固體平板上純化后的菌株

2.2 菌株生理生化性質

耐鹽堿固氮菌生理生化指標鑒定結果見表1。

表1 耐鹽堿固氮菌生理生化指標鑒定結果

注：“+”為陽性；“-”為陰性

2.3 菌株SKDN-1的生長曲線

從圖2可以看出，實驗中培養(yǎng)的固氮菌在0～24h內生長較為緩慢，在24～120h內進入對數生長期，120～192h內生長速度逐漸減慢，200h左右開始進入穩(wěn)定期。

圖2 菌株SKDN-1的生長曲線圖

2.4 酸堿性對固氮細菌生長的影響

固氮菌在不同pH值(如pH值=5，7，9)的生長環(huán)境中的生長曲線如圖3所示，都是先處于生長極其緩慢的停滯期，而后進入高速增殖的對數期，再進入菌數變動不大的穩(wěn)定期，最后進入衰亡期。而在pH=11處生長曲線的趨勢與前者有些相反，菌株直接由穩(wěn)定期進入衰亡期，最后菌數不再變化。

圖3 不同pH值條件下，菌株SKDN-1的生長曲線圖

由于菌株的生長特性主要同菌株本身的固氮酶的活性有關，可以由曲線斷定該固氮菌的固氮酶的活性在pH值處于5～9范圍內時變化不是特別明顯，說明該菌對酸堿度具有較好的適應性，并且在pH值=9時固氮酶活性最高。由于該菌株在pH值=11的生長環(huán)境中對環(huán)境的耐受性較差，可斷定該菌株不能耐受太極端的堿性環(huán)境。

2.5 不同碳源條件下菌株SKDN-1的生長

如圖4，培養(yǎng)液中的耐鹽堿固氮菌對不同碳源的供給表現出了不同的固氮酶的活性，但都能以這四種碳源作為唯一碳源進行生長。其中，固氮菌在以葡萄糖(glucose)作為唯一碳源的生長環(huán)境中生長時，表現出較高的生長特性，其固氮酶活性要高于固氮菌在其他碳源如蔗糖(sugar)、淀粉(starch)和乳糖(lactose)等作為唯一碳源的生長環(huán)境中的固氮酶酶活性。對碳源的高適應性能夠幫助菌種更能適應一般的生長環(huán)境，因此，篩選獲得的耐鹽堿固氮菌能使其在極端環(huán)境中更好地生長，發(fā)揮其固氮特性，從而改善土壤性質。

圖4 不同碳源條件下菌株SKDN-1的生長曲線

2.5 固氮菌系統數的構建

對菌株SKDN-1的16S rDNA序列進行PCR擴增，將擴增序列提交到GenBank獲得收錄號AB826004。用CustalX2.1和Mega5軟件對菌株SKDN-1及其同源性較高菌株的16S rDNA序列進行系統發(fā)育樹創(chuàng)建(圖5)。從圖5可以看出，菌株SKDN-1與分直桿菌聚成一群。因此，菌株SKDN-1應屬于分直桿菌屬，并命名Mycobacterium sp. SKDN-1(AB826001)。

圖5 菌株SKDN-1基于16S rDNA序列N-J法系統發(fā)育樹

Fig.5 The neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain SKDN-1

3 實驗結果討論

為了對菌株的形態(tài)特征和生理生化特性進行進一步的了解，從而初步鑒定該菌株，通過革蘭氏染色和鏡檢、糖醇酵解實驗、M.R.實驗、V.P.試驗、檸檬酸鹽試驗、產氨試驗、吲哚試驗、運動性試驗等對菌株進行一些常規(guī)的鑒定試驗，初步確定該菌株為固氮菌屬。通過對16S rDNA序列相似度分析，把該固氮菌株命名為SKDN-1。同時通過探究在不同pH，不同碳源等條件下菌株的生長狀況，得到該菌的固氮酶在pH值處于7～9范圍內活性較高；該菌株對不同碳源環(huán)境也有較好的適應性，但對葡萄糖的利用程度最高。因此，篩選得到的固氮菌株能夠對鹽堿地土壤的改良提供研究依據。

[1] 孫 波, 趙其國, 張?zhí)伊? 等. 土壤質量與持續(xù)環(huán)境 III. 土壤質量評價的生物學指標[J].土壤,1997, 29(5): 225-234.

[2] 周 桔,雷 霆.土壤微生物多樣性影響因素及研究方法的現狀與展望[J].生物多樣性, 2007, 15(3):306-311.

[3] 張 巍，馮玉杰，陳橋.耐鹽堿固氮細菌的分離篩選及固氮特性研究[J].環(huán)境科學與技術.2008,31(5):22-25.

[4] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001.

[5] 布坎南 R E, 吉本斯 N E. 中國科學院微生物研究所《伯杰氏細菌鑒定手冊》[M]. 8版. 北京: 科學出版社, 1984: 622-651.

[6] Kimura M. A Simple Method for Estimating Evolutionary Rates of Base Substitutions Through ComparativeStudies of Nucleotide Sequences [J]. Journal of Molecular Evolution, 1980, 16: 111-120.

[7] Person W R , Lipman D J. Improved Tools for Biological Sequence Comparison [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1988, 85: 2444-2448.

[8] Saitou N , Nei M. The Neighbor-joining Method: a New Method of Reconstructing Phylogenetic Tress [J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4: 406-425.

[9] Felsenstein J. Confidence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap[J]. Evolution, 1985, 39: 783-791.

TheSeparationandIdentificationofNitrogen-fixingBacteriafromYellowRiverDeltaSaline-alkaliSoilandtheResearchofItsGrowthCharacteristic

XueTingting，Luhongsheng,ChengJianguang

(Shandong University of Science and Technology,Qingdao 266590,China)

By culture-dependent approach, we have collected soil from YRDNRA, in which there is without human intervening and the soil was not transformed artificially. A strain of salt-tolerant Azotobacter were screened from the saline soil., which was identified preliminarily through the conventional methods to study heir morphology of colonies and individual, physiological and chemical characteristics. Through analyszing the 16S rDNA alignment of the strain, make sure it is salt-tolerant Azotobacter in the genetic level ,and named it SKDN-1. The study upon the adaptability of the salt-tolerant nitrogen-fixing bacteria to the environment factors showed that with the growth temperature of 28℃ and 150r/min shaking, strain SKDN-1 showed its optimum pH, carbon source were 7～9, glucose respectively. The strain can tolerate relatively high basicity adaptability. Therefore, the inoculation of salt tolerance azotobacter can play nitrogen-fixing performance of azotobacter and improve the content of biological nitrogen in saline soil.

saline-alkali soil; the Yellow River delta; nitrogen-fixing bacteria; separation and identification

2017-07-11

薛婷婷(1991—)，女，山東膠州人，研究生，環(huán)境工程專業(yè)。

S156.4

A

1008-021X(2017)18-0045-03

(本文文獻格式薛婷婷,陸洪省，程建光.黃河三角洲鹽堿地固氮細菌的分離鑒定和生長特性研究[J].山東化工，2017，46(18)：45-47，51.)