種 莉,陳 麗,張李娜,唐 鵬,劉 玥

陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(西安710068)

缺血預(yù)處理和缺血后處理對腦缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究*

種 莉,陳 麗,張李娜,唐 鵬,劉 玥

陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科(西安710068)

目的：比較缺血預(yù)處理和缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注時神經(jīng)功能缺損及MMP-9表達的影響。方法：SD大鼠隨機分為四組，分別是假手術(shù)組(S組)，缺血再灌注組(I/R組)，缺血預(yù)處理組(IPC組)和缺血后處理組(IPost組)，觀察各組神經(jīng)行為學，測定腦組織含水量、TTC染色觀察腦梗死體積，免疫組化染色測定腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達。結(jié)果：與S組相比，I/R組大鼠的神經(jīng)功能損害評分明顯升高，腦組織出現(xiàn)大面積梗死，且腦組織含水量明顯增加，MMP-9的表達升高；而IPC組及IPost組大鼠的經(jīng)功能損害較I/R組有明顯改善，且腦組織梗死面積減小，腦組織含水量降低，MMP-9的表達強度降低。結(jié)論：缺血預(yù)處理及缺血后處理均能降低大鼠腦缺血再灌注大腦損傷，改善大鼠的神經(jīng)行為學。

腦血管疾病是目前人類疾病三大死亡原因之一，在我國,腦血管病已上升為首位死亡原因[1],并且存活者會遺留癱瘓、失語、認知障礙等嚴重殘疾[2]。缺血性腦血管病是最常見的腦血管疾病,最有效的治療措施是早期溶栓,但溶栓后再灌注引起的再灌注損傷、腦水腫等嚴重并發(fā)癥限制著溶栓治療的推廣應(yīng)用。探尋防治腦缺血-再灌注損傷的策略是缺血再灌注研究領(lǐng)域的熱點問題。近年來,出現(xiàn)了一系列預(yù)防與治療腦缺血-再灌注損傷的方法,包括缺血預(yù)處理(IPC)、缺血后處理(IPost)、藥物預(yù)處理等。缺血預(yù)處理能有效的改善缺血-再灌注損傷,但其在臨床中的可操作性卻低于缺血后處理，本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血模型，擬比較缺血預(yù)處理和缺血后處理對大鼠腦缺血再灌注時血-腦屏障(BBB)通透性及MMP-9的影響，旨在探討兩種干預(yù)措施腦保護效應(yīng)的機制,為缺血后處理在臨床中應(yīng)用提供新的思路和實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材 料 SD大鼠由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，兔抗MMP-9單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。SP廣譜超敏試劑盒、DAB 酶底物顯色試劑等均購于上海生工生物工程有限公司。

2 實驗方法 ①腦缺血大鼠模型制備：健康雄性SD大鼠72只，體重280～300 g。動物隨機分為四組,分別是假手術(shù)組(S組),缺血再灌注組(I/R組),缺血預(yù)處理組(IPC組)和缺血后處理組(IPost組)，每組18只。假手術(shù)組：僅手術(shù)暴露、分離頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，不予插線阻斷大腦中動脈血流，術(shù)后22 h斷頭取腦。I/R組：線栓法阻塞大鼠大腦中動脈血流,于栓塞后2 h給予血流再灌注,再灌注后22 h斷頭取腦。IPC組：線栓法阻塞大腦中動脈,阻塞5 min后再灌注5 min，重復3次，恢復再灌注24 h后再予缺血2 h再灌注22 h后處死。IPost組：線栓法阻塞大腦中動脈,阻塞2 h后行缺血后處理，再灌注20 s，而后再阻塞20 s,重復3次,其后實現(xiàn)完全再灌注,22 h后斷頭取腦。②神經(jīng)功能缺損評分：大鼠再灌注22 h后參照改良Bederson評分標準進行神經(jīng)功能缺損評分[3]。③氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和梗死體積計算：每組取6只大鼠,斷頭取腦,迅速置于-20 ℃冰箱中速凍10 min左右。放入鼠腦槽中,去除嗅球,小腦和低位腦干。從額極向后作冠狀切片，切成5～6片，每片厚2 mm。將切片置于2%TTC溶液中，37 ℃溫箱避光染色30 min。玫紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織。蒸餾水沖洗后4%多聚甲醛固定,24 h后數(shù)碼相機照相。利用圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)，算出各個腦片梗死區(qū)域的體積和缺血側(cè)的總體積,求出梗死體積占大腦半球總體積的百分比。④腦含水量測定：每組取6只大鼠，斷頭取腦,將大腦半球左右分開，缺血側(cè)半球組織稱濕重后，置110 ℃電烤箱烘烤24 h，再迅速測干重。腦組織水含量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。⑤MMP-9免疫組化染色：每組取6只大鼠，用水合氯醛深度麻醉動物后心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛各約200 ml，斷頭取腦，切取視交叉前緣至垂體后緣組織塊，4%多聚甲醛溶液固定后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，然后置于經(jīng)明膠處理的干凈載玻片上，烤片12 h后進行染色。免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均嚴格按照說明書進行。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能缺損評分 S組大鼠沒有神經(jīng)功能缺損,評分為0。I/R組神經(jīng)功能缺損評分(3.40±0.55)分,顯著高于S組(P<0.05)。IPC組及IPost組評分分別為(2.00±0.71)分及(1.8±0.45)分,組間比較顯示IPC組及IPost組的神經(jīng)功能損傷評分雖高于S組,但與I/R組相比,評分明顯降低(P<0.05)。

2 TTC染色和梗死體積計算 TTC染色結(jié)果顯示，S組大鼠腦組織無梗死，I/R組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶，梗死體積占全腦總體積的(35.12±6.65)%，IPC組及IPost組的梗死體積占全腦總體積的(15.60±2.89)%及(11.38±1.11)%，較I/R組相比明顯減小(P<0.05),見圖1。

A：S組；B：I/ R組；C：IPC組；D：IPost組

3 腦組織含水量測定 S組大鼠的腦組織含水量為(76.49±1.72)%，而I/R組大鼠腦組織的含水量同S組相比，明顯增加，達(83.57±1.13)%(P<0.05)；IPC組及IPost組大鼠腦組織的含水量分別為(81.14±0.85)%及(81.29 ± 0.80)%，與I/R組相比,均有不同程度的降低(P<0.05)。

4 MMP-9免疫組化染色 S組MMP-9表達呈陰性，而I/R組大鼠腦組織MMP-9表達明顯升高，陽性細胞計數(shù)達(25.28±3.13)個/視野；IPC組及IPost組大鼠腦組織MMP-9陽性細胞計數(shù)分別為(20.14±2.85)個/視野及(21.29±2.90)個/視野，表達強度雖較S組有所升高，但明顯低于I/R組(P<0.05)，見圖2。

A：S組；B：I/ R組；C：IPC組；D：IPost組

討 論

治療腦缺血的前提和基礎(chǔ)是迅速恢復缺血腦組織的血流灌注，但再灌注過程中會繼發(fā)腦水腫等多種腦組織損傷，這也是病情加重的一個重要因素。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，得益于血-腦屏障(BBB)的存在。正常狀態(tài)下，除了氣體及脂溶性小分子，其他大分子物質(zhì)難以通過BBB。而急性腦缺血后,BBB破壞,通透性增加，水和血漿成分漏出到周圍腦組織，形成腦水腫，同時大量炎性因子釋放和炎性細胞滲出，加劇炎性反應(yīng)和細胞凋亡[4]，加重腦組織缺血再灌注損傷。

毛細血管基底膜(BM)是維持BBB完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，細胞外基質(zhì)(ECM)構(gòu)成BM的支架，急性腦梗死后多種蛋白水解酶活性上升，其中基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)幾乎能降解除多糖外ECM的所有成分，在腦水腫的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。MMPs家族中以MMP-9對BBB通透性的變化影響最大[5]。腦缺血后MMP-9激活的一個早期的病理作用就是促進血管源性腦水腫形成[6]。其可能的機理為急性腦缺血時血管內(nèi)皮細胞表達MMP-9，增高的MMP-9可破壞基底膜和BBB內(nèi)皮細胞之間的緊密連接而導致BBB受損，通透性增加，產(chǎn)生腦水腫，使病情迅速惡化[7]。研究證實，MMP-9亦會加重腦缺血后炎性反應(yīng)的損傷，腦缺血后中性粒細胞等可分泌MMP-9，后者又進一步促進白細胞浸潤，并且破壞BBB，造成腦內(nèi)微血管的二次損傷，導致神經(jīng)元壞死[5]。因此,BBB通透性的改變以及血管源性水腫的發(fā)生和發(fā)展可以通過監(jiān)測MMP-9水平的變化來預(yù)測。

缺血預(yù)處理是一種已被公認的有效的抗缺血-再灌注損傷措施，指臟器在經(jīng)受多次短暫缺血和再灌注后，能耐受隨后長時間的缺血-再灌注損傷。大量研究證實，這一現(xiàn)象存在于不同種屬的不同組織器官中[8]，包括腦組織。缺血預(yù)處理可誘導內(nèi)源性保護機制，抵御其后發(fā)生的較嚴重的甚至致死性腦缺血事件。而缺血后處理，即在缺血后給予幾個短暫的灌注/再缺血循環(huán)的處理措施。后處理對心肌等組織再灌注損傷的保護作用也在一些動物實驗和臨床研究中得到證實[9]。目前缺血后處理對腦缺血-再灌注損傷的作用也引起了學者們的重視。

本研究顯示,缺血再灌注后大鼠出現(xiàn)不同程度神經(jīng)行為學異常，腦組織有明顯的梗死灶，腦組織的含水量顯著增加，MMP-9的表達升高,而經(jīng)過缺血預(yù)處理及缺血后處理后,神經(jīng)功能缺損評分、梗死灶體積、腦組織含水量及MMP-9表達雖高于假手術(shù)對照組,但與缺血再灌注組大鼠相比,則顯著降低,提示缺血預(yù)處理及缺血后處理均可以在一定程度上減輕腦水腫,降低缺血再灌注對大鼠神經(jīng)的損傷。

臨床上腦缺血的發(fā)生通常是不可知的,而預(yù)處理必須在缺血前實施,因此在臨床上無法掌握缺血預(yù)處理的時機，故其臨床應(yīng)用受到了很大限制。也有研究認為缺血預(yù)處理具有減輕腦組織損傷的作用,但對于改善遠期神經(jīng)功能缺損意義不大[10]。如上所述，針對已缺血的腦組織采取更為合理的處理措施以減輕再灌注的近期和遠期損傷，無疑具有更重要的臨床價值。在急性缺血后給予缺血后處理,可以激發(fā)機體內(nèi)源性保護機制,可操作性大,并且已在部分臨床研究中證實其保護效果確切,因此缺血后處理具有更好的臨床應(yīng)用前景和實用價值。

[1] 馬振國,劉敏君.針藥結(jié)合治療腦血管疾病恢復期190例[J].陜西中醫(yī),2002,23(2):157-158.

[2] Go AS, Mozaffarian D, Roger VL,etal.Hearl disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association[J].Circulation,2014,129(3): 399-410.

[3] Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,etal.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[4] Khanna A,Walcott BP,Kahle KT,etal.Effect of glibenclamide on the prevention of secondary brain injury following ischemic stroke in humans[J].Neurosurg Focus,2014,36(1): E11.

[5] Wu Y,Wang YP,Guo P,etal.A lipoxin A4 analog ameliorates blood-brain barrier dysfunction and reduces MMP-9 expression in a rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion injury[J].J Mol Neurosci,2012,46(3):483-491．

[6] Lenglet S,Monteeucco F,Mach F,etal.Analysis of the expression of nine secreted matrix metalloproteinases and their endogenous inhibitors in the brain of mice subjected to ischaemic stroke[J].Thromb Haemost,2014,112(2):363-378．

[7] Yousuf S,Sayeed I,Atif F,etal.Delayed progesterone treatment reduces brain infarction and improves functional outcomes after ischemic stroke:a time-window study in middleaged rats[J].J Cereb Blood Flow Metab,2014,34(2):297-306．

[8] Hirayama Y,Ikeda-Matsuo Y,Notomi S,etal.Astrocyte-mediated ischemic tolerance[J].J Neurosci, 2015,35(9):3794-3805.

[9] Han Q,Zhang HY,Zhong BL,etal.Antiapoptotic effect of recombinant HMGB 1 A-box protein via regulation of microRNA-21 in myocardial ischemia-repefusion injury model in rats[J].DNA Cell Biol,2016,35(4): 192-202.

[10] Hua Y,Wu J,Pecina S,etal.Ischemic preconditioning procedure induces behavioral deficits in the absence of brain injury[J].Neurol Res,2005,27(3): 261-267.

Effectsofischemicpreconditioningversusischemicpostconditioningonischemia-reperfusioninjury

Chong Li,Chen Li,Zhang Lina,et al.

Department of Neurology,Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective: To Compare the influence of the neuroethology and the expression of MMP-9 after ischemic preconditioning and ischemic postconditioning on ischemia-reperfusion in rats. Methods: SD rats were randomly divided into four groups: control group (S), ischemia reperfusion group (I/R group), ischemic preconditioning (IPC) and ischemic postconditioning group (IPost), to Observe the neuroethology, the ischemia scope by TTC staining, the expression of MMP-9 by Immunohistochemical staining. Results: Compared with the S group, neurologic impairment scores in I/R group were increased significantly, large area of infarction was detected,the brain water content increased obviously,and the expression of MMP-9 was higher. Compared with the I/R group, neurologic impairment scores in IPC and IPost group were lower,inftact volume decreased, the brain water content decreased,and the expression of MMP- 9 was lower. Conclusion: Ischemic preconditioning and ischemic postconditioning can reduce the damage of brain ischemia reperfusion and improve neural function in rats.

Brain ischemia Ischemic preconditioning Ischemic postconditioning Reperfusion injury

*陜西省自然科學基礎(chǔ)研究計劃項目(2012JM4003)

腦缺血 缺血預(yù)處理 缺血后處理 再灌注損傷

R743.32

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.015

(收稿：2017-01-03)