馬善義，孫兆樓

安徽省宣城市中心醫(yī)院腫瘤科(宣城242000)

NVP-BEZ235對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480體外增殖的抑制作用及其機(jī)制探討

馬善義，孫兆樓

安徽省宣城市中心醫(yī)院腫瘤科(宣城242000)

目的：探討NVP-BEZ235對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480的抑制、凋亡作用及其可能的作用機(jī)制。方法：以不同濃度的NVP-BEZ235處理體外人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480，分別用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè)NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制作用、細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：NVP-BEZ235對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480的生長(zhǎng)具有顯著的抑制活性，誘導(dǎo)其凋亡，抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表達(dá)，且均與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。結(jié)論：NVP-BEZ235具有抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480的生長(zhǎng)作用并誘導(dǎo)其凋亡，且機(jī)制可能是通過(guò)抑制p-Akt、p-p70S6K蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，目前，傳統(tǒng)的治療手段包括手術(shù)、化療和放療，但對(duì)于腸癌患者生存期沒(méi)有明顯改善，中位生存期不足20個(gè)月[1]。近年來(lái)，隨著分子靶向藥物的出現(xiàn)，例如針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的單克隆抗體對(duì)腸癌晚期患者有明顯療效，使其中位生存期達(dá)到2年[2]，但由于KRAS等的突變導(dǎo)致抗-EGFR單克隆抗體耐藥的發(fā)生使得該靶向藥物治療效果大大降低。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)已成為治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵。NVP-BEZ235是一種新型的PI3K和mTOR雙重抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ATP結(jié)合位點(diǎn)，特異性地抑制PI3K和mTOR的活性[3]。本文以結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480為研究對(duì)象，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期等方面研究NVP-BEZ235對(duì)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)抑制作用，以及相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 NVP-BEZ235購(gòu)自Selleck Chemicals公司(Houston，TX，USA)，人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，Hoechst 33342購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司，Annexin V/PI 雙染凋亡試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司，AKT磷酸化抗體購(gòu)自CST，ECL顯色液購(gòu)自Thermo Scientific公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①SW480細(xì)胞株培養(yǎng)：培養(yǎng)在10%的滅菌牛血清+50 U/ml青霉素+50 U/ml鏈霉素的RP-M11640的培養(yǎng)液中。置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。NVP-BEZ235的配制，NVP-BEZ235的CAS號(hào)為915019-65-7，分子式C30H23N5O，分子量469.6，稱取0.939 mg NVP-BEZ235溶解于100 ml DMSO中，配制20 μmol/L儲(chǔ)存液待用。②MTT法檢測(cè)NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制作用[4]：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，將細(xì)胞以100 μl/well接種于96孔板，使待測(cè)細(xì)胞密度為1×104/孔。5%CO2，37 ℃孵育12 h后，吸棄上清，然后加入不同濃度的NVP-BEZ235(0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μmol/L)，分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。孵育72 h后，每孔加入20 μl 的5 mg/ml 濃度的MTT溶液。繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h后，棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔再加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置低速搖床上振蕩10 min，將試劑對(duì)照調(diào)零。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處檢測(cè)各孔的吸光值。以下面公式計(jì)算細(xì)胞生存率：細(xì)胞生存率= (OD藥物作用孔-OD調(diào)零孔)/(OD對(duì)照孔-OD調(diào)零孔)×100%。以不同濃度的NVP-BEZ235為橫坐標(biāo)，細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線圖。③流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：6孔板中接種5×105個(gè)/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)12 h后，在加藥組中分別加入1、5、10 μmol/L的NVP-BEZ235，對(duì)照組中加入等量的DMSO，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，參考凋亡檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明：胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩遍，用500 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl的Annexin- V和10 μl的 PI，冰上避光15 min后，流式細(xì)胞儀上機(jī)分析。④Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中有關(guān)蛋白的表達(dá)：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480細(xì)胞，按1×106接種至6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)到90%飽和時(shí)。分別用不同濃度的NVP-BEZ235(0.5、1、5、10 μmol/L)處理細(xì)胞，在5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩遍后加入RIPA細(xì)胞裂解液(含10%蛋白酶抑制劑)，冰上放置30 min，期間搖晃2～3次。4℃，13000 g，離心20 min，收集上清，按BCA蛋白定量試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行蛋白濃度定量檢測(cè)。SDS凝膠每樣本加入20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉3 h，加抗體(Caspase-8抗體、Caspase-3抗體、Akt抗體、p-Akt抗體、p70S6K抗體、p-p70S6K1抗體，1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次后，加入HRP偶聯(lián)的二抗(1∶10000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次后，加入ECL顯色試劑于Bio-Rad ChemiDox XRS掃膜儀上掃描目的蛋白的表達(dá)。

結(jié) 果

1 MTT法檢測(cè)NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制作用 見(jiàn)圖1。NVP-BEZ235能顯著抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的增殖，且隨著NVP-BEZ235濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果更為顯著，即抑制率與藥物濃度-時(shí)間呈正相關(guān)，在72、96 h，NVP-BEZ235對(duì)SW480的IC50值分別為9.1和4.9 μmol/L。

圖1 不同濃度的NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2 流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)BEZ235誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡 見(jiàn)表1、2。采用0、0.5、1.0、5.0、10 μmol/L濃度的NVP-BEZ235分別處理SW480細(xì)胞48 h。單因素方差分析顯示，各濃度組間細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LSD-t檢驗(yàn)顯示，5、10 μmol/L濃度組細(xì)胞凋亡率均顯著大于0 μmol/L濃度組(P<0.05)。Western blot檢測(cè)顯示，各濃度組間細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，LSD-t檢驗(yàn)顯示，1、5、10 μmol/L濃度組細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3表達(dá)均顯著大于0 μmol/L濃度組(P<0.05)。

表1 不同濃度NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05

表2 不同濃度NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3表達(dá)的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05

3 Western blot法檢測(cè)NVP-BEZ235對(duì)Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K蛋白的影響 見(jiàn)表3。采用0、0.5、1、5、10 μmol/L濃度的NVP-BEZ235處理人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，48 h后采用Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K表達(dá)。單因素方差分析顯示，各濃度組間Akt和p70S6K蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而各濃度組間p-Akt和p-p70S6K表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。LSD-t檢驗(yàn)顯示，5、10 μmol/L濃度組細(xì)胞p-Akt和p-p70S6K表達(dá)均顯著小于0 μmol/L濃度組(P<0.05)。

表3 不同濃度NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞Akt、p-Akt、p70S6K、p-p70S6K表達(dá)的影響

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05

討 論

NVP-BEZ235為咪唑喹啉類抗腫瘤化合物，主要作用于PI3K/mTOR信號(hào)通路。楊芬等[5]通過(guò)MTT法、Western blot法、DAPI染色法及TUNEL染色法研究發(fā)現(xiàn)，NVP-BEZ235可通過(guò)抑制PI3K/mTOR下游通路磷酸化過(guò)程達(dá)到選擇性的抑制鼻咽癌細(xì)胞的增值和誘導(dǎo)其凋亡。另有文獻(xiàn)報(bào)道，NVP-BEZ235可通過(guò)抑制PI3K/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制淋巴瘤細(xì)胞(CA46、RAJI)、骨肉瘤細(xì)胞(MG-63、U2OS、SaOs-2)及突變?nèi)橄侔┘?xì)胞(MDA-MB361、MCF-7)的增值，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[6-7]。

臨床研究表明，人結(jié)直腸癌中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的主要異常是PIK3CA基因突變以及PTEN表達(dá)的丟失，而PIK3CA突變與結(jié)直腸癌分化程度、病理類型有著密切的關(guān)系[8]。目前用于結(jié)直腸癌患者的靶向藥物主要為奧沙利鉑、卡培他濱等，雖具有一定療效，但副作用較大[9]。本課題探究了NVP-BEZ235對(duì)體外人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)抑制及其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的NVP-BEZ235對(duì)SW480細(xì)胞均具有抑制作用，且隨著劑量、作業(yè)時(shí)間增加，抑制作用也隨之增強(qiáng)。說(shuō)明NVP-BEZ235 可以明顯抑制SW480細(xì)胞生長(zhǎng)，并與劑量呈正相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)受精確調(diào)控的程序性死亡的過(guò)程，研究已證實(shí)細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生密不可分[10]。本研究采用流式細(xì)胞法，探究了不同劑量的NVP-BEZ235(0、0.5、1、5、10 μmol/L)對(duì)SW480細(xì)胞處理48 h后凋亡的情況。結(jié)果顯示，0.5～10 μmol/L 的NVP-BEZ235均可誘導(dǎo)SW480細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著NVP-BEZ235濃度的增加，誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)增強(qiáng)，其中5、10 μmol/L的 NVP-BEZ235濃度對(duì)SW480凋亡率與0 μmol/L相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Caspase家族在正常的細(xì)胞中處于無(wú)活性狀態(tài)，而在細(xì)胞的凋亡過(guò)程中異常表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著NVP-BEZ235濃度的增加，SW480中凋亡啟動(dòng)因子Caspase-8和執(zhí)行因子Caspase-3的表達(dá)增強(qiáng)。說(shuō)明NVP-BEZ235可能是通過(guò)活化Caspase-8，繼而活化Caspase-3來(lái)完成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。本研究也發(fā)現(xiàn)，NVP-BEZ235可抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白p-70S6K、p-Akt的表達(dá)，且與濃度呈正相關(guān)。

總之，通過(guò)本研究顯示，新型的PI3K和mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235對(duì)體外人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且促進(jìn)其凋亡，可能是通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，具體的作用機(jī)制后期將會(huì)更深入的研究。

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(收稿：2017-04-10)

InhibitoryandmechanismofNVP-BEZ235onproliferationofhumancoloncancercelllineSW480

Ma Shanyi，Sun Zhaolou.

Department of Oncology， Xuancheng Central Hospital in Anhui Province(Xuancheng 242000)

Objective：To study the effect of NVP-BEZ235 on proliferation of human colon cancer cell line SW480 and its mechanism. Methods：The human colon cancer cell line SW480 were treated with different concentrations of NVP-BEZ235. Proliferation，apoptosis and mechanism of SW480 cells were detected by MTT assay，cells cycle and western blot. Results：NVP-BEZ235 significantly inhibited the growth of SW480 cells and promote the apoptosis of SW480 cells in a time-dependent and dose-dependent manner. Western Blot experiments showed that NVP-BEZ235 could effectively inhibit p-Akt、p-p70S6K protein expression of SW480 cells. Conclusion：NVP-BEZ235 can inhibited SW480 cells proliferation and induce apoptosis. The mechanism may be related to down-regulated of p-Akt、p-p70S6K protein expression.

Colorectal neoplasms Cell enlargement Apoptosis @NVP-BEZ235

結(jié)直腸腫瘤 細(xì)胞增長(zhǎng) 細(xì)胞凋亡 @NVP-BEZ235

R735.37

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.013