李亞玲，王豐艷，李 歡，王寶玲

西安市第四醫(yī)院(西安710004)

△通訊作者

Nrf2及P62在卵巢癌組織中的表達及臨床意義*

李亞玲，王豐艷，李 歡△，王寶玲

西安市第四醫(yī)院(西安710004)

目的：探討Nrf2及P62在卵巢癌及相應(yīng)的正常組織中的陽性表達情況，為卵巢惡性腫瘤惡性程度及預后的判斷提供理論參考。方法：收集70例卵巢癌組織及正常組織，采用RT-PCR檢測組織中Nrf2 mRNA與P62 mRNA的表達情況；免疫組化法檢測組織中P62和Nrf2蛋白的表達情況。結(jié)果：在卵巢癌組織中，Nrf2與P62蛋白及mRNA的表達量均明顯高于正常組織(P<0.05)。Nrf2 蛋白陽性表達和腫瘤的MDACC分型(P=0.003)、IFGO分期(P=0.036)、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移(P=0.036)密切相關(guān)；而P62蛋白的陽性表達和MDACC分型(P=0.008)、組織學分級(P=0.021)、IFGO分期 (P=0.018)相關(guān)。Nrf2和P62的表達在卵巢癌組織中呈明顯的相關(guān)性(r=0.274，P<0.05)。而Nrf2+/P62+分組中位生存時間28個月，相較于其他分組的患者預后更差。結(jié)論：Nrf2和P62的異常表達與卵巢癌的進展密切相關(guān)，兩者在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中存在協(xié)同作用，Nrf2和P62的共表達往往預示著卵巢癌患者的不良預后。

NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)是一種高度保守的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，對細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)非常敏感，并發(fā)揮著保護細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[1]。P62是一種的自噬底物連接蛋白，當自噬發(fā)生時它可以與多種待降解蛋白結(jié)合，形成復合體并將其運送至自噬小體，進一步與溶酶體結(jié)合而被降解[2-5]。本課題初步探討卵巢癌組織中Nrf2及P62的表達及其與臨床病理特征之間的聯(lián)系。

資料與方法

1 一般資料 選取2010年11月至2011年12月間我院確診的卵巢癌患者70例，所有患者術(shù)前均未接受任何治療，年齡 29～72 歲，中位年齡 51.7 歲；組織學類型：漿液性囊腺癌48例，子宮內(nèi)膜樣腺癌10例，粘液性囊腺癌12例；FIGO分期：I、II期33例，III、IV期37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例。對照組取自同期70例正常卵巢組織(子宮肌瘤、子宮腺肌癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變行手術(shù)切除子宮及雙附件的患者)，年齡28～70 歲，中位年齡 50.7 歲。所有標本置入液氮迅速冷凍，-80℃保存。用于免疫組化的標本離斷后在4%的多聚甲醛中固定24 h。

2 檢測方法 ①實時熒光定量PCR檢測：利用TRIzol試劑提取標本中的總RNA，之后迅速應(yīng)用目的基因特異性上下游引物(P62，上游5'-GAGCAGCATCCAACCAAA-3'，下游5'-CGTCTCCTGGAGGCATA-3'；Nrf2，上游5'-CCAACACACGGTCCACAGCT-3'，下游5'-TCCGTCGCTGACTGAAGTCAA-3')，SYBR Premix Ex TaqTMII (Takara)和iQ5 Multi-color RT-PCR 反應(yīng)系統(tǒng)對目的基因片段進行擴增。引物均由TaKaRa生物技術(shù)公司(Dalian，China)設(shè)計合成。用ABI prime 7000 SDS軟件分別測出每個樣品Nrf2、P62 mRNA的CT值，2-△△Ct方法計算該基因的相對表達量。②免疫組化法檢測：用免疫組化檢測P62和Nrf2的表達情況。一抗購自Abcam公司：Nrf2 (ab62352，1∶200，HK)、CXCR4(ab2074，1∶50，HK)。石蠟標本使用3% H2O2在室溫下作用30 min以完全除去過氧化物酶的活性，用20%的山羊血清結(jié)合非特異性蛋白。在4°C條件下孵育一抗過夜。第2天用TBS洗標本3次并在室溫條件下用孵育生物素標記的二抗作用30 min。對10個隨機視野陽性細胞的百分比計數(shù)，分數(shù)分級如下：1分，<25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>76%。染色強度所得分數(shù)如下分級：0分，無染色；1分，弱表達染色；2分，中度表達染色；3分，強表達染色。將上述兩種評分值相加，并根據(jù)總分值將標本分為4組：6～7分，強表達組()；4～5分，中等表達組()；1～3 分，弱表達組(+)；陰性組 (-)，0分。出現(xiàn)陰性和弱表達情況則判定為該基因陰性表達，而中等和強表達則判定該基因陽性表達。

3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，相關(guān)性應(yīng)用參數(shù)統(tǒng)計中 Spearman 等級相關(guān)進行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Nrf2 mRNA和蛋白表達情況 Nrf2 mRNA在腫瘤組織中的相對表達量較正常組織明顯增高[(3.2543±0.7727)與(1.6463±0.2966)P< 0.01)。腫瘤組織中Nrf2陽性表達率為61.4%(43/70)，明顯高于正常組織中的(25/70，35.7%) (P<0.05)。結(jié)合臨床病例特征，Nrf2 陽性表達和腫瘤的MDACC分型(P=0.003)、IFGO分期(P=0.036)、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移(P=0.036)密切相關(guān)。

2 P62 mRNA和蛋白表達情況 P62 mRN在腫瘤組織中的表達量明顯高于正常組織[ (3.0345±0.7767) 與(1.3232±0.5988)P<0.01]。P62蛋白在腫瘤組織中的陽性表達率為54.3%(38/70)，高于正常組織的(28/70，40.0%) (P<0.01)。結(jié)合臨床病例特征，P62蛋白的陽性表達和與MDACC分型(P=0.008)、組織學分級(P=0.021)、IFGO分期 (P=0.018)相關(guān)。

3 Nrf2和P62表達在卵巢癌組織中的相關(guān)性 見表1。將標本分為4組: Nrf2+/P62+，Nrf2-/P62+，Nrf2+/P62-和Nrf2-/P62-。發(fā)現(xiàn)Nrf2和P62的表達存在顯著相關(guān)性(r=0.274，P<0.05)。提示在卵巢癌組織中P62表達上調(diào)可能受到Nrf2蛋白表達水平的影響。正常組織中未觀察到明顯的相關(guān)性。

表1 Nrf2與P62蛋白表達在卵巢癌組織中的相關(guān)性

4 Nrf2 和P62表達與卵巢癌患者生存時間的關(guān)系 見圖1。

A：Nrf2的表達與預后；B：P62的表達與預后；

70例隨訪持續(xù)到2016年12月，42例在隨訪期間死亡，生存時間9～60個月，中位生存時間52.9個月。卵巢癌患者不同分組(Nrf2+/P62+，Nrf2-/P62+，Nrf2+/P62-和Nrf2-/P62-)的生存情況，其中Nrf2+/P62+組的中位生存時間為28.0個月，相較于其他分組病人的預后更差(P<0.01)。

討 論

本研究探討了卵巢癌患者臨床標本中Nrf2和P62的表達對臨床病理數(shù)據(jù)和生存情況的影響。結(jié)果表明Nrf2和P62基因的mRNA和蛋白在腫瘤組織中的表達要明顯高于正常組織，Nrf2的高表達和腫瘤的MDACC分型(P=0.003)、IFGO分期(P=0.036)、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移(P=0.036)密切相關(guān)，與此同P62高表達和MDACC分型(P=0.008)、組織學分級(P=0.021)、IFGO分期 (P=0.018)相關(guān)。同時表明在卵巢癌患者臨床標本中Nrf2和P62的表達之間有很強的相關(guān)性。同時生存分析表明二者雙陽性表達組往往意味著更差的預后。

在腫瘤生長的過程中，腫瘤細胞的生長增值過程中會產(chǎn)生大量的ROS，最終激活Nrf2通路[6]。作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2可以特異性的識別抗氧化反應(yīng)元件ARE，從而激活下游ARE依賴的相關(guān)酶類[5]。近來相關(guān)證據(jù)表明，Nrf2有助于腫瘤細胞維持干性及抵抗放化療[7]。Nrf2無論是在正常細胞還是惡性細胞中都扮演了保護者的角色。

卵巢癌標本中的Nrf2表達相對較高，同時Nrf2的高表達與腫瘤大小密切相關(guān)。腫瘤越大往往意味著缺氧越嚴重，細胞壓力越高，在這種情況下Nrf2通路將被廣泛激活。同時我們發(fā)現(xiàn)Nrf2與腫瘤分期關(guān)系密切，這提示Nrf2通路在卵巢癌的進展中十分重要，與患者的預后評價密不可分[7-8]。

綜上所述，Nrf2和P62的過表達在卵巢癌進展中扮演了重要的角色，兩者之間可能存在著某種密切的聯(lián)系，且與患者不良預后相關(guān)。因此針對兩者的研究可能幫助我們發(fā)現(xiàn)新的治療卵巢癌的靶點。

[1] Sporn MB.NRF2 and cancer：the good，the bad and the importance of context[J].Nat Rev Cancer，2012，12(8)：564-571.

[2] Sirota R，Gibson D，Kohen R.The role of the catecholic and the electrophilic moieties of caffeic acid in Nrf2/Keap1 pathway activation in ovarian carcinoma cell lines[J]. Redox Biol，2015，4：48-59.

[3] Manandhar S，Choi BH，Jung KA，etal. NRF2 inhibition represses ErbB2 signaling in ovarian carcinoma cells: implications for tumor growth retardation and docetaxel sensitivity[J].Free Radic Biol Med，2012，52(9)：1773-1785.

[4] Efeyan A，Comb WC，Sabatini DM.Nutrient-sensing mechanisms and pathways[J].Nature，2015，517(7534)：302-310.

[5] Jiang X，Overholtzer M，Thompson CB.Autophagy in cellular metabolism and cancer[J].J Clin Invest，2015，125(1)：47-54.

[6] 李興媚.抑制ERK1/2通路對卡鉑誘導人卵巢癌細胞凋亡的影響[J].陜西醫(yī)學雜志，2016，45(5)：522-523.

[7] Martinet W，De Meyer GR. Autophagy in atherosclerosis: a cell survival and death phenomenon with therapeutic potential[J]. Circ Res，2009，104(3)：304-317.

[8] Kim YC，Guan KL.Mtor：a pharmacologic target for autophagy regulation[J]. J Clin Invest，2015，125(1)：25.

*西安市科研教育項目(2013013)

卵巢腫瘤 基因表達調(diào)控，腫瘤 預后 NF-E2相關(guān)因子2 @P62

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.011

(收稿：2017-02-17)