張婷婷，彭慧霞

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安710004)

△通訊作者

microRNA217逆轉(zhuǎn)人宮頸癌細(xì)胞順鉑耐藥及其作用機(jī)制

張婷婷，彭慧霞△

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安710004)

目的:探討microRNA217(miR-217)與宮頸癌順鉑耐藥的關(guān)系及其可能作用機(jī)制。方法:建立具有不同順鉑耐藥性的細(xì)胞株Siha及Siha/CDDP，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-217在其中的表達(dá)差異。采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot法分別在核酸和蛋白水平檢測(cè)果蠅zeste 基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)在Siha及Siha/CDDP細(xì)胞系的表達(dá)差異。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-217模擬物 (miR-217mimics) 檢測(cè)其對(duì)宮頸癌耐藥的作用及其可能作用靶點(diǎn)。結(jié)果:相較于Siha細(xì)胞，Siha/CDDP細(xì)胞中miR-217呈低表達(dá)，而EZH2在核酸和蛋白水平均相對(duì)高表達(dá) (P<0.05)。Siha/CDDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-217 mimics后，EZH2在核酸及蛋白水平均明顯下降(P<0.05)，對(duì)順鉑的敏感性顯著增強(qiáng) (P<0.05)。結(jié)論: 在Siha/CDDP中上調(diào)其表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性，這可能為宮頸癌耐藥的臨床前期研究提供新的靶點(diǎn)，miR-217可能通過(guò)作用于EZH2參與宮頸癌順鉑耐藥的調(diào)控。

microRNAs(miRNAs)是一組非編碼保守小RNAs，可通過(guò)與同源性mRNA靶點(diǎn)上的3＇未翻譯區(qū)(UTRs) 進(jìn)行序列特異性的結(jié)合[1]。近年來(lái)，已有大量研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可通過(guò)調(diào)控癌基因/抑癌基因繼而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及放化療敏感性等生物學(xué)行為。miR-217位于染色體2P16.1上，目前已有部分研究表明其在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中可能起到重要作用[2]。本研究旨在探討miR-217在宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中的作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 材 料 人宮頸癌細(xì)胞株Siha(ATCC公司)。RNAiso 小RNA 提取試劑、PrimeScript miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix Ex Taq 試劑盒、miR-217引物(TaKa-Ra) ; 6 孔板、24 孔板、96 孔板(Costar) ; MTT(南京凱基) ; 二甲基亞砜(DMSO)(Sigma) ; 酶標(biāo)儀(Invitrogen) 。EZH2單克隆抗體(Cell Signaling Technology，USA); β-actin 單克隆抗體(sc-130756，Santa Cruz); 羊抗鼠抗體(sc-130656，Santa Cruz)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①宮頸癌耐順鉑細(xì)胞株的誘導(dǎo)：利用低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法產(chǎn)生人宮頸癌耐 CDDP細(xì)胞株[3]。誘導(dǎo)方法如下: 0. 1μg/ml 順鉑處理宮頸癌細(xì)胞Siha 2 周，0. 5 μg/ml 處理 6 周，1 μg/ml 處理12 周，2 μg/ml 處理8 周，4 μg/ml 處理 12 周。經(jīng)過(guò)總共 40 周的誘導(dǎo)，Siha細(xì)胞可在含CDDP (4 μg/ml) 的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)且正常傳代，成功建立了人宮頸癌耐順鉑細(xì)胞株Siha/CDDP。②細(xì)胞培養(yǎng)：Siha細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司)中加入 5%的小牛血清(Gibco 公司)以及100 U/ml青霉素和100 μg/ml 鏈霉素，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 耐順鉑細(xì)胞株Siha/CDDP 常規(guī)培養(yǎng)于含5%胎牛血清以及100 U/ml青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。每傳兩代在培養(yǎng)基中加入終濃度為4 μmol/L的順鉑以維持其耐藥性。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化并計(jì)數(shù)，每孔接種5×104細(xì)胞，溫箱孵育細(xì)胞至70%豐度，分別取成熟miR-217的mimics/ inhibitors和NC(陰性對(duì)照) 各100 pmol與脂質(zhì)體混勻后室溫下放置30 min，同時(shí)將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基漂洗2遍，將混勻后的脂質(zhì)體用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋后小心加入漂洗過(guò)的細(xì)胞，之后將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于溫箱中孵育24 h后換新鮮完全培養(yǎng)基。具體操作按 Lipofectamine2000 說(shuō)明書進(jìn)行。④實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)濃度與質(zhì)量，OD值在1.8～2.2之間方可使用。用TaKaRa PrimeScript miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-217表達(dá)水平。反應(yīng)條件: 95℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 20 s 共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)所得樣本和內(nèi)參 U6 的結(jié)果分析采用 2-ΔΔCT方法。2-ΔΔCT表示各標(biāo)本實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較的相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。⑤Western blot：收集細(xì)胞樣本，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。4 ℃離心機(jī)離心棄去沉淀，收集蛋白后BCA法定量分析蛋白濃度。制備10%SDS-PAGE膠，上樣于泳道后100 V恒壓分離后轉(zhuǎn)PVDF膜，接著在PBS/Tween-20中用5%脫脂牛奶封閉2 h，加鼠抗人EZH2單克隆抗體和鼠抗人β-actin 單克隆抗體4 ℃過(guò)夜。加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體(sc-130656，Santa Cruz) ，室溫孵育1 h 洗膜后顯影。用BandScan圖像分析系統(tǒng)掃描圖像的光密度，以各組目的蛋白條帶光密度值與內(nèi)參蛋白(β-actin) 光密度值計(jì)算相對(duì)比值。⑥MTT實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后用培養(yǎng)基調(diào)整其濃度至5×104/ml。按每孔100 μl細(xì)胞懸液(約每孔5000個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板。將96孔板置于培養(yǎng)箱24 h后，細(xì)胞貼壁，棄去原培養(yǎng)基后加入終濃度為 1、10、 20、50、100 μmol/L的順鉑，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔(即不加細(xì)胞組)、對(duì)照孔(即僅加入最大濃度藥物溶解介質(zhì)的細(xì)胞孔)。 48 h后加 20 μl/孔 MTT(5 mg/ml)，溫箱孵育3 h，終止培養(yǎng)后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO。置于溫箱孵育10 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)。在 490 nm 波長(zhǎng)處讀數(shù)。繪制藥物劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(IC50) ，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。⑦細(xì)胞生長(zhǎng)及存活性檢測(cè)：取轉(zhuǎn)染后Siha/CDDP細(xì)胞，加10 μmol/L順鉑作用5 d。在不同時(shí)間點(diǎn)用胰酶消化細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液與0.5% Trypan Blue溶液以9∶1混合均勻，調(diào)節(jié)其終濃度為0.05%。在3 min內(nèi)用細(xì)胞計(jì)數(shù)器分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞及死細(xì)胞。鏡下觀察，活細(xì)胞呈無(wú)色透明狀，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力：活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，兩組數(shù)據(jù)比較采用 Student＇st檢驗(yàn)，多組間資料比較采用 One-way ANOVA 單因素方差分析(LSD法) 。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-217在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá) 見圖1。在宮頸癌細(xì)胞Siha及宮頸癌耐藥細(xì)胞Siha/CDDP中miR-217均有表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示miR-217在Siha/CDDP細(xì)胞中低表達(dá)，相對(duì)表達(dá)水平較Siha細(xì)胞降低約50%，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

*P<0.05

2 EZH2在宮頸癌耐藥細(xì)胞株Siha/CDDP中的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示：在Siha/CDDP細(xì)胞中EZH2 mRNA表達(dá)水平高于Siha細(xì)胞株(P<0.05)，見圖2A。Western blot蛋白水平檢測(cè)顯示：Siha/CDDP細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)高于Siha細(xì)胞株(P<0.05)，見圖2B。

A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；B：Western blot 檢測(cè)

3 轉(zhuǎn)染miR-217mimic 后Siha/CDDP細(xì)胞中EZH2的表達(dá)情況 見圖3。轉(zhuǎn)染miR-217mimic后Siha/CDDP細(xì)胞中EZH2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降，與Siha相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

A：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；B：Western blot 檢測(cè)

4 轉(zhuǎn)染miR-217mimic后Siha/CDDP細(xì)胞耐藥性變化 miR-217 組IC50為12.98 μmol/L，較對(duì)照組(23.21 μmol/L)顯著下降(P<0.05)，見圖4A。轉(zhuǎn)染miR-217mimic 后的Siha/CDDP細(xì)胞用順鉑作用48 h后存活率較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，見圖4B。

A：MTT 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-217 后Siha/CDDP細(xì)胞的耐藥性;B：順鉑轉(zhuǎn)染miR-217的Siha/CDDP細(xì)胞存活率

討 論

目前已有研究表明miR-217過(guò)表達(dá)可通過(guò)調(diào)控PTEN信號(hào)通路參與肝癌耐藥及其侵襲轉(zhuǎn)移[4]；在肺癌中，miR-217作為抑癌基因參與腫瘤順鉑耐藥[5]；在胃癌中，miR-217通過(guò)調(diào)控EZH2從而抑制腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[6]。但目前關(guān)于miR-217在宮頸癌細(xì)胞中對(duì)順鉑耐藥性的調(diào)控尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-217在宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株Siha/CDDP中的表達(dá)降低，而在耐藥株中過(guò)表達(dá)miR-217可增強(qiáng)其對(duì)順鉑的耐藥性。

EZH2是多硫基因(PcG)家族的重要成員，可通過(guò)過(guò)位點(diǎn)特異性地將組蛋白H3上第27位賴氨酸殘基(H3-K27)甲基化而改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，促進(jìn)腫瘤的增殖、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[7-8]。目前已有大量研究認(rèn)為EZH2在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后等過(guò)程中起重要作用[9]。Cai等[10]發(fā)現(xiàn)EZH2可逆轉(zhuǎn)宮頸癌的腫瘤化療抵抗。本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)EZH2可能是miR-217的潛在靶基因之一，因此我們推測(cè)miR-217在EZH2高表達(dá)的宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞株(Siha/CDDP)中的異常表達(dá)可能與腫瘤耐藥相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在Siha/CDDP細(xì)胞中過(guò)表達(dá) miR-217后，EZH2在mRNA水平及蛋白水平的表達(dá)均明顯下降。這些結(jié)果表明miR-217可能通過(guò)負(fù)調(diào)控EZH2而增強(qiáng)Siha/CDDP細(xì)胞的順鉑敏感性。

綜上所述，miR-217在宮頸癌鉑類耐藥細(xì)胞株Siha/CDDP中低表達(dá)，而在Siha/CDDP中上調(diào)其表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性，這可能為宮頸癌耐藥的臨床前期研究提供新的靶點(diǎn)。此外，miR-217可能通過(guò)作用于EZH2 參與宮頸癌順鉑耐藥的調(diào)控，其具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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(收稿：2017-04-25)

子宮頸腫瘤 順鉑 抗藥性，腫瘤 微RNAs 分子藥理作用機(jī)制

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.010