姜向陽，李興珍，劉文康，吳志新，李帥帥，張恩科，趙清俠

陜西省人民醫(yī)院(西安710068)

△通訊作者

高通量測序平臺(tái)對(duì)卵巢癌基因突變的檢測及意義*

姜向陽，李興珍，劉文康，吳志新，李帥帥，張恩科，趙清俠△

陜西省人民醫(yī)院(西安710068)

目的：利用高通量測序平臺(tái)研究卵巢癌基因突變的分布和特點(diǎn)，尋找相應(yīng)的突變靶點(diǎn)，并對(duì)突變位點(diǎn)的類型和頻度進(jìn)行分析。方法：取自臨床上卵巢癌的組織石蠟標(biāo)本16例，運(yùn)用高通量基因測序Ion torrent PGM平臺(tái)，對(duì)50個(gè)基因2835個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測。結(jié)果：50個(gè)基因中突變集中在EGFR、KDR 、KIT、KRAS、NOTCH1、SMAD4、TP53等7個(gè)基因21個(gè)位點(diǎn)上。其中TP53突變比例高達(dá)75%，且突變點(diǎn)是4號(hào)外顯子c.215C>G的比例最高。結(jié)論：卵巢癌患者可以根據(jù)基因突變靶點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)治療，TP53的高突變比例提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，結(jié)合臨床可為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測提供依據(jù)。

近30年來卵巢癌病因?qū)W的認(rèn)知，復(fù)雜的異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境的特異性等生物學(xué)特性研究不斷深化[1]，手術(shù)及化療方案都有了很多的改進(jìn)[2]，但是患者的生存率沒有太大的變化。靶向治療能影響腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)、血管或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)在卵巢癌中過度表達(dá)，并與順鉑耐藥性的增加有關(guān)，貝伐單抗能靶向作用于 VEGF-A 的活性形式，從而抑制血管生成和腫瘤的生長，抑制轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，患者的無進(jìn)展生存期增加[3]。從基因的表達(dá)到DNA測序，從焦磷酸測序，Sanger測序到高通量測序(High-throughput sequencing)又名下一代測序(Next generation sequencing，NGS)，技術(shù)平臺(tái)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。本研究運(yùn)用NGS平臺(tái)，檢測卵巢癌患者的基因突變圖譜，尤其是TP53的突變分析，結(jié)合病理及臨床分型，藥物療效等方面，探討TP53的突變情況及與卵巢癌，尤其是上皮性卵巢癌的相關(guān)性。

對(duì)象和方法

1 研究對(duì)象 腫瘤標(biāo)本全部來源于我院2014年5月至2016年6月收治的16例上皮性卵巢癌患者，年齡38～81歲，平均(60.31±5.53)歲。病理分型：低分化腺癌13 例，高分化腺癌2 例，顆粒細(xì)胞瘤1例；上皮性卵巢癌14例，顆粒細(xì)胞瘤1例，胃轉(zhuǎn)移卵巢癌1例。臨床分期：ⅡC 2 例，ⅢC 13例，Ⅳ期1例。淋巴轉(zhuǎn)移3例，復(fù)發(fā)7例，腹腔轉(zhuǎn)移1例，肝轉(zhuǎn)移1例，肺轉(zhuǎn)移1例，未復(fù)發(fā)2例，因肺部感染死亡1例。

2 研究方法 ①DNA準(zhǔn)備：為保證FFPE切片組織中含有足夠比例的腫瘤細(xì)胞，需請(qǐng)病理科事先對(duì)該切面的腫瘤組織進(jìn)行HE染色，確保所切層面中腫瘤組織占70%以上、且壞死組織比例少于10%。采用切片厚度5～10 μm，數(shù)量6～8張。②DNA提取：采用QIA amp DNA Mini Kit (Qiagen)試劑盒對(duì)組織進(jìn)行DNA提取。③質(zhì)控：DNA定量(Qubit2.0)Agilent2100質(zhì)控，提取片段長度在170 bp左右，組織樣本DNA的Qubit定量濃度>50 ng/μl。④Ion文庫構(gòu)建：采用AmpliSeqTMLibrary Kit2.0(Life Technologies 生產(chǎn) )標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案建庫。⑤測序：高通量測序樣品上機(jī)深度測序(測序儀：Ion Torrent PGMTM)；測序結(jié)果質(zhì)控(長度分布，QC均一性，測序堿基質(zhì)量，Amplicons覆蓋度等)。比對(duì)率>95%、reads長度主要分布在100 bp左右、GC含量均一、Q>20、覆蓋度：組織>1000×。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用北京圣谷同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司自主研發(fā)的SV-DNA filter進(jìn)行背景突變過濾，保證突變檢出的敏感度、準(zhǔn)確性及腫瘤相關(guān)性；對(duì)最終的突變點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算統(tǒng)計(jì)比較分析。

結(jié) 果

1 基因突變譜檢測 高通量測序平臺(tái)檢測國內(nèi)外研究熱點(diǎn)的50個(gè)基因，覆蓋2835個(gè)位點(diǎn)，共檢測了16例卵巢癌患者的基因突變譜。檢測的50個(gè)基因中，發(fā)生突變的基因有7個(gè)，見表1。

表1 發(fā)生突變的基因分布比例

2 TP53突變分布 見表2。TP53突變頻率較高，在檢測的16例卵巢癌患者中有12例發(fā)生了TP53基因突變，其中3例在2個(gè)外顯子上發(fā)生了突變，突變數(shù)量為15個(gè)。突變的外顯子涉及5個(gè)，分別是Exon4、5、6、7、8，突變類型為錯(cuò)義突變和刪除(缺失)突變。

表2 TP53突變分布[突變(%)]

3 TP53突變位點(diǎn)分布 TP53的錯(cuò)義突變位點(diǎn)多集中在4號(hào)外顯子第215號(hào)核苷酸，C突變?yōu)镚，與之對(duì)應(yīng)的72號(hào)氨基酸由脯氨酸突變?yōu)樘於彼?c.215C>G，p.72P[Pro]=>R[Arg])。

討 論

本次研究檢測50個(gè)腫瘤相關(guān)基因的2835個(gè)位點(diǎn)，卵巢癌的突變集中在EGFR、KDR 、KIT、KRAS、NOTCH1、SMAD4、TP53等7個(gè)基因，針對(duì)靶點(diǎn)的藥物治療，成為精準(zhǔn)個(gè)體化治療的一部分，并取得了可靠的患者反饋。1例EGFR基因21號(hào)外顯子c.2573T>Gp.858L突變給予酪氨酸激酶抑制劑，KDR基因7號(hào)外顯子c.889G>Ap.297 突變應(yīng)用抗VEGF類藥物療效顯著，毒副作用較少，患者主觀感受較好。

P53蛋白約為53千道爾頓(53kD)，是由TP53基因編碼的，定位于人17號(hào)染色體短臂的pl3.1上，它對(duì)于抑制癌癥的發(fā)生發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用。在超過半數(shù)的人類腫瘤中，P53都表現(xiàn)為突變或者基因的缺失[4]。突變的P53不僅喪失了并抑制野生型P53抑制腫瘤的功能，它同時(shí)表現(xiàn)為獲得性的新功能。這種獲得性功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用[5]。TP53基因的突變形式各異，位點(diǎn)分布也不相同。本研究中TP53基因突變率高達(dá)75%，16例患者有1例是初診，于2016年5月行卵巢減滅術(shù)；15例患者均在2011-2015年做過卵巢腫瘤減滅術(shù)，術(shù)后復(fù)發(fā)7例，6例發(fā)生轉(zhuǎn)移；2例未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者為2015年初診發(fā)現(xiàn)腫瘤，且TP53基因均有突變。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率81.25%，13例轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的患者中11例發(fā)生了TP53基因的突變，突變率為84.62%。卵巢顆粒細(xì)胞瘤是卵巢性索間質(zhì)腫瘤中常見的腫瘤，屬于低度惡性，復(fù)發(fā)幾率較低，本研究中有1例，TP53基因4號(hào)外顯子上發(fā)生了c.215C>Gp.72和 c.314delGp.105fs錯(cuò)義和缺失突變，該患者減瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，以上結(jié)果顯示TP53基因與卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，在消化系統(tǒng)腫瘤中的TP53突變頻率較高，多在5、6、7、8外顯子的不同位點(diǎn)上[6]。本研究顯示TP53突變高發(fā)在4號(hào)外顯子的215核苷酸序列上，是不是提示卵巢癌的突變有差異性，我們將進(jìn)一步關(guān)注。

卵巢癌手術(shù)減瘤后，開展聯(lián)合治療，依據(jù)高通量基因檢測突變信息，篩選靶向藥物，制定個(gè)體化的用藥方案[7]，做到“精準(zhǔn)治療”，提高患者的治療依從性，減少化療藥物毒副作用，提高5年生存率。同時(shí)結(jié)合腫瘤標(biāo)志物，還未發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者，進(jìn)行預(yù)測、早期發(fā)現(xiàn)、早期干預(yù)；結(jié)合NGS平臺(tái)提供的基因測序大數(shù)據(jù)分析，綜合臨床資料的研究，更好的為患者服務(wù)。

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Geneticmutationanalysisofhumanovariancancerusingnext-generationsequencingplatform

Jiang Xiangyang，Li Xingzhen，Liu Wenkang，et al.

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Objective：Using NGS sequencing platform，study the distribution and characteristics of ovarian cancer gene mutations and look for targets of medicines; by analysis the mutation sites，types and frequency ，combined with the tumor markers，predict the recurrence or metastasis，then screening，early intervention on a regular basis.Methods：16 cases from ovarian tissue paraffin specimens by clinically confirmed，using the high-throughput sequencing Ion torrent PGM platform，test the 2835 gene loci of 50 genes and the data analysis. Results：50 genes mutations were in the concentrated in EGFR，KDR，KIT，KRAS，NOTCH1 and SMAD4，TP53 seven 21 gene loci. TP53 mutations among the proportion were as high as 75%，and mutation of 4 exon c.215C>G has the highest percentage. Conclusion：The patients with ovarian cancer can be according to the target gene mutations in accurate treatment，TP53 high mutation rate suggests it plays an important role in the occurrence of tumor development，combined with clinical study can provide the basis for recurrent branch predictions.

Ovarian neoplasms Gene conversion High-throughput nucleotide sequencing Genes，p53

*西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目[SF1510(3)]

卵巢腫瘤 基因轉(zhuǎn)變 高通量核苷酸測序 基因，p53

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.009

(收稿：2017-02-13)