邊衛(wèi)國，鐘 亮，連 芩，邱裕生，靳忠民

1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院(西安710061)，2.西安交通大學機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室(西安710028)

△通訊作者

大尺寸骨軟骨復合支架修復羊膝關節(jié)骨軟骨缺損的初步研究*

邊衛(wèi)國1，鐘 亮1，連 芩2△，邱裕生1，靳忠民2

1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院(西安710061)，2.西安交通大學機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室(西安710028)

目的：利用山羊膝關節(jié)大面積骨軟骨缺損模型評價大尺寸仿生水凝膠/聚乳酸/β-磷酸三鈣(PEG/PLA/β-TCP)復合支架軟骨再生修復效果和安全性。方法：選取約1歲齡健康雄性關中山羊3只，體重為35～40 kg，采用開放手術方式，將支架植入缺損區(qū)，術后當天及術后6月X線檢查；術后觀察動物功能康復；術后12月處死動物，并進行大體標本評測，組織學檢測，根據(jù)國際軟骨修復協(xié)會(ICRS)大體評估及組織學評分標準進行量化評分。結(jié)果：術后動物無感染和死亡，術后2周術側(cè)肢體自然負重行走，術后12月，術側(cè)肢體行走、奔跑與對側(cè)相似，無明顯跛行。術后6月X線示大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架仍然固定良好，未出現(xiàn)支架破碎崩解等現(xiàn)象。術后12月，術側(cè)膝被動屈、伸運動范圍與對側(cè)肢體相似。大體觀察術側(cè)膝關節(jié)骨軟骨缺損被新生修復組織填充，與周圍正常組織連接，高度基本持平。但修復表面呈纖維化表面和小區(qū)域瘢痕組織及裂痕。ICRS軟骨修復大體評分分別為6、9、8分。組織學染色及Ⅱ型膠原免疫組化示：新生修復組織表面凹凸不平，缺損修復內(nèi)可見纖維軟骨細胞與部分透明軟骨細胞，基質(zhì)染色淡，軟骨層與軟骨下骨交界區(qū)整合連續(xù)性較差，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈弱陽性。V-G染色示TCP骨支架周圍及其內(nèi)部有新生膠原纖維長入。結(jié)論：大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架植入山羊膝關節(jié)缺損處后具有良好的固定性及組織相容性。支架的仿生設計和固定裝置為植入初期提供了良好的力學支持，后期可誘導周圍細胞的遷徙與增殖。術后骨軟骨缺損被新生軟骨樣組織填充，手術膝關節(jié)功能長期良好。

關節(jié)軟骨是一種缺乏血供、神經(jīng)支配、自我增殖更新能力弱的穩(wěn)定組織，一旦由于感染、創(chuàng)傷等因素造成關節(jié)軟骨的破壞，難以通過自身能力進行修復、再生[1]。目前針對關節(jié)骨軟骨損傷的臨床治療方法和研究有很多，微骨折術、鉆孔術、骨軟骨移植等[2-4]。但各治療方式的修復效果無法令人滿意及尚存在著許多不足。本研究采用一種大尺寸仿生水凝膠/聚乳酸/β-磷酸三鈣(PEG/PLA/β-TCP)復合支架，利用該支架一體化的仿生設計，在不添加、負荷任何種子細胞及細胞因子的基礎上，植入動物模型，對山羊膝關節(jié)大面積骨軟骨缺損進行再生修復，初步探討及評估該大尺寸復合支架對關節(jié)骨軟骨缺損的再生修復效果。

材料與方法

1 實驗材料 選取12月齡健康雄性關中山羊3只，體重 35～40 kg，動物實驗經(jīng)西安交通大學第一附屬醫(yī)院實驗動物實驗管理委員會批準，實驗實施遵循《實驗動物保護與應用指南》。大尺寸水凝膠/聚乳酸/β-磷酸三鈣復合支架(大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架，見圖1)由西安交通大學機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室連芩教授提供。PEG軟骨支架厚3.5 mm；β-TCP骨支架為20 mm×15 mm×10 mm；PLA固定樁高22 mm，直徑4 mm。生物陶瓷支架內(nèi)部含有初級管道和次級管道直徑0.5 mm，初級管道供細胞黏附及組織長入；次級管道用于灌注PLA，提高β-TCP支架的力學強度；PEG軟骨支架通過水凝膠管道與β-TCP骨支架結(jié)合。

圖1 大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架實物圖

2 手術操作及術后護理 行右膝前正中切口，內(nèi)側(cè)切開關節(jié)囊，逐層切開，使髕骨向外側(cè)脫位，顯露股骨內(nèi)側(cè)髁，將軟骨截骨導板安置于右膝股骨內(nèi)側(cè)髁，確定支架植入位置(見圖2 A)。用擺鋸沿劃線位置進行切割，制造出與支架大小及外觀一致的大面積骨軟骨缺損，缺損范圍約15 mm×20 mm，深約10 mm。缺損處安放試件(見圖2 B)。利用標配鉆頭通過導板上的兩個定位孔進行打孔(深約10 mm，直徑約4 mm)。去除殘留的軟骨碎片及骨屑，生理鹽水沖洗(見圖2C)。將已消毒的浸泡在PBS中的支架通過壓配方式植入制備的骨軟骨缺損處，確保植入后復合支架高度與周圍正常軟骨表面平齊(如圖2D)。髕骨復位，檢查膝關節(jié)活動及髕骨軌跡有無異常，植入物有無脫落。依次關閉傷口。術后分欄飼養(yǎng)，術后每天給予肌注青霉素1次(5～10萬U/kg)預防術后傷口感染。

A：暴露內(nèi)側(cè)髁按照模具劃定缺損范圍；B：截骨；

3 術后檢測 密切觀察實驗動物的精神、飲食、切口愈合情況及膝關節(jié)活動情況。術后當天及術后6月行患肢膝關節(jié)X線檢查，觀察支架植入固定情況。術后12月處死動物，離斷的雙側(cè)后肢(支架植入側(cè)肢體為實驗組，對側(cè)膝關節(jié)肢體為對照組)。之后打開關節(jié)腔，觀察有無積液，滑膜、半月板及缺損修復區(qū)域的大體情況，根據(jù)ICRS軟骨修復大體評估標準進行評分。以股骨內(nèi)側(cè)髁骨軟骨缺損處為中心，用電鋸采集新生軟骨及軟骨下骨的骨軟骨塊(約2 cm×2 cm×2 cm大小)，放入10%中性福爾馬林中固定，而后分別進行HE染色、甲苯胺藍染色、番紅O染色、免疫組化染色、V-G染色。

結(jié) 果

1 術后一般情況及軟骨修復大體評分 術后2周活動基本接近正常，手術切口愈合良好，術側(cè)膝關節(jié)未見感染。術后12月術側(cè)膝關節(jié)主被動伸直、屈曲運動、活動范圍與對側(cè)膝關節(jié)基本一致；關節(jié)周圍皮膚無紅腫及異常分泌物；打開關節(jié)囊，可見關節(jié)囊無增厚或攣縮、髕骨無脫位、關節(jié)腔內(nèi)無感染及滲出、滑膜無粘連(見圖3)。ICRS軟骨修復大體評分，見表 1。

2 術后X線檢查結(jié)果 術后當天X線片檢查示：植入物固定牢靠，無脫出、變形；動物膝關節(jié)骨性結(jié)構(gòu)對合良好；術后6月X線檢查示：支架在股骨內(nèi)側(cè)髁固定良好，外形存在，無脫出、無崩塌變形；術側(cè)膝關節(jié)間隙存在，骨性結(jié)構(gòu)對合良好，關節(jié)腔內(nèi)無異物、無骨贅形成。見圖 4。

圖3 大體標本觀察

實驗動物大體評估分值總體修復評估山羊A6Ⅲ級：異常山羊B9Ⅱ級：接近正常山羊C8Ⅱ級：接近正常

A：術后當天；B：術后6月

3 術后組織學結(jié)果 術后12月，實驗組標本組織學染色示組織標本著色可，新生軟骨修復組織表面不平整，厚度較周圍正常軟骨薄，部分修復組織可見裂隙、凹陷；修復組織以透明樣軟骨和纖維軟骨混合而成，細胞排列欠規(guī)整。實驗組有新生的軟骨下骨形成，并逐漸向缺損中心相互靠近，有類似于正常軟骨下骨的骨板結(jié)構(gòu)形成。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈弱陽性(見圖5)。V-G染色結(jié)果：骨組織內(nèi)可見部分未被吸收、殘留的TCP陶瓷支架，其內(nèi)及周圍有大量新生膠原纖維的長入(見圖 6)。

A：HE染色40×；B：番紅O染色40×；

A：正常松質(zhì)骨40×；B、C、D： 植入?yún)^(qū)域軟骨下骨100×

討 論

臨床上通常認為軟骨內(nèi)無血液供應，自身愈合能力差，直徑超過4 mm的軟骨缺損不能完全自我修復，損傷后，會導致關節(jié)腫脹和疼痛，影響運動功能，不及時治療，最終發(fā)展為骨性關節(jié)炎[5]。為了更好的驗證仿生軟骨/骨梯度組織工程支架的骨軟骨缺損修復能力，本研究選擇了以山羊為實驗動物，在與人軟骨損傷，退變好發(fā)部位股骨內(nèi)側(cè)髁相似的羊股骨內(nèi)側(cè)髁關節(jié)面，利用擺鋸制造大尺寸的缺損模型，缺損范圍約15 mm×20 mm，深約10 mm，其面積為3 cm2，達到中等面積軟骨缺損。其中包含了軟骨層，軟骨下骨板與軟骨下松質(zhì)骨。鉆孔后，骨髓內(nèi)的軟骨源性和骨源性細胞滲透到損傷區(qū)，所滲出的血凝塊附著到周圍正常關節(jié)軟骨邊緣以及支架內(nèi)，為支架提供自體的干細胞。該復合支架采用仿生設計，包括支架結(jié)構(gòu)和材料性能上的仿生，植入過程未負荷種子細胞。

研究結(jié)果顯示，大尺寸仿生PEG/PLA/β-TCP復合支架的初步修復效果值得肯定：首先，術后12月，山羊術側(cè)肢體的活動、被動屈伸運動與對側(cè)肢體相似，未出現(xiàn)跛行及行走明顯異常。其次，支架植入后，固定良好，植入初期未出現(xiàn)支架脫落、崩解等情況，并能為缺損處組織提供力學支撐。此外，影像學檢查發(fā)現(xiàn)，支架植入后期，骨軟骨缺損缺損處的支架大部分已被吸收降解，并伴隨有新生組織的長入。組織學檢測顯示：術后12月，實驗組標本組織學染色示組織標本著色可，新生軟骨修復組織完全覆蓋缺損區(qū)域，但表面不平整，厚度較周圍正常軟骨薄，部分修復組織可見裂隙、凹陷；修復組織以透明樣軟骨和纖維軟骨混合而成，細胞排列欠規(guī)整。實驗組有新生的軟骨下骨形成，并逐漸向缺損中心相互靠近，有類似于正常軟骨下骨的骨板結(jié)構(gòu)形成。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈弱陽性。骨軟骨界面的仿生結(jié)構(gòu)保證了軟骨支架穩(wěn)定的結(jié)合與深層軟骨細胞的營養(yǎng)供應。β-TCP支架骨支架的彈性模

量與軟骨下骨板類似，為表層軟骨支架內(nèi)部的軟骨細胞生長、分化，新生軟骨組織功能化，提供了有效地應力刺激。隨著陶瓷支架的降解，接近于陶瓷面的細胞在應力刺激下向骨方向轉(zhuǎn)化，最終形成了一層微結(jié)構(gòu)類似于軟骨下骨板的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與新生的軟骨組織緊密結(jié)合，其結(jié)合方式類似于自然骨軟骨。軟骨的抗壓性能與彈性主要由軟骨內(nèi)水分的滲流和軟骨基質(zhì)的形變來承擔，這二者均與軟骨內(nèi)占干重百分之60%～70%的膠原顯微結(jié)構(gòu)密切相關[6]。近似于自然狀態(tài)膠原纖維微結(jié)構(gòu)是新生軟骨實現(xiàn)功能化的表現(xiàn)之一，也是骨軟骨缺損修復，關節(jié)功能正?；谋ＷC。軟骨下骨組織的重建：軟骨下骨的重建與軟骨層的修復共同發(fā)生，組織學染色示新生修復組織具有類似軟骨下骨板結(jié)構(gòu)；V-G染色示陶瓷支架內(nèi)部及周圍有大量膠原的長入，骨小梁作為骨中最重要的結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部就是由大量膠原按照一定方式排列，表面覆蓋大量礦物質(zhì)，所形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

但實驗研究過程中，仍發(fā)現(xiàn)一些問題。首先，PEG吸水膨脹的系數(shù)不可控：實驗開始前，預先將制造好的干燥的大尺寸PEG/PLA/β-TCP復合支架浸泡在PBS液中，使水凝膠進行充分吸水膨脹。但是，由于水凝膠良好的吸水膨脹特性及其膨脹程度的不可預測性，待取用支架時，發(fā)現(xiàn)PEG軟骨支架厚度明顯增加，因而為了使PEG軟骨支架高度與周圍正常軟骨層高度相當，不得不進行修剪，該修剪的結(jié)果可能會影響PEG軟骨支架在初期對關節(jié)軟骨仿生功能的影響。

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*國家自然科學基金資助面上項目(81672187)

優(yōu)秀重點實驗室資助項目(51323007)

骨和骨組織 軟骨 創(chuàng)傷和損傷 組織工程 支架 山羊

R683

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.008

(收稿：2017-03-03)