蘇永永，吳鵬昌，謝江濤，向 毅，王世鋒，武興興，劉振鋒△，姜海濤

1.陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科(咸陽(yáng)712000)，2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710061)

△通訊作者

去鐵胺在小鼠局灶性腦缺血損傷中的保護(hù)作用*

蘇永永1，吳鵬昌1，謝江濤1，向 毅1，王世鋒1，武興興1，劉振鋒1△，姜海濤2

1.陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科(咸陽(yáng)712000)，2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710061)

目的：探討去鐵胺在小鼠局灶性腦缺血損傷中的保護(hù)作用。方法：健康雄性C57BL/6J小鼠30只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、去鐵胺處理組，每組小鼠10只；假手術(shù)組只做頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分離，不進(jìn)行線栓插入。模型組及去鐵胺處理組行小鼠局灶性腦缺血損傷，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 h，去鐵胺組小鼠腹腔注射0.9%生理鹽水溶解的去鐵胺(50 mg/kg)，假手術(shù)組及模型組同樣時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等體積生理鹽水。小鼠局灶性腦缺血損傷24 h后進(jìn)行mNSS行為學(xué)評(píng)分，之后處死小鼠，干濕重法檢測(cè)腦組織含水量、TTC染色檢測(cè)小鼠腦梗死體積百分比，腦組織切片行Neun免疫熒光染色。結(jié)果：去鐵胺處理組小鼠mNSS評(píng)分(9.25±1.52)較模型組小鼠評(píng)分(13.50±1.50)明顯低(P<0.05)，去鐵胺處理組小鼠腦含水量(80.15±0.72)%較模型組小鼠腦含水量(84.25±0.56)%低(P<0.05)，去鐵胺預(yù)處理后可明顯減輕小鼠局灶性腦缺血梗死體積(P<0.05)。觀察神經(jīng)元Neun免疫熒光染色可見(jiàn)，模型組神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少(90.0±11.0)，而去鐵胺處理組則神經(jīng)元減少較模型組(180.0±15.0)多(P<0.05)。結(jié)論：在小鼠局灶性腦缺血損傷中，去鐵胺預(yù)處理后可減輕小鼠神經(jīng)行為損傷評(píng)分、減輕腦水腫及腦梗死體積，抑制腦組織神經(jīng)元細(xì)胞死亡，提示去鐵胺在局灶性缺血性腦損傷中具有一定的保護(hù)作用。

隨著人們生活水平提高及老齡化的到來(lái)，缺血性腦損傷的發(fā)病率逐年提高，已經(jīng)成為臨床上的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一，該疾病有著高致死率及致殘率，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，有關(guān)缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制及腦保護(hù)性藥物的研究一直是醫(yī)學(xué)研究熱點(diǎn)[1-2]。鐵離子參與腦內(nèi)發(fā)育、代謝和功能等重要活動(dòng)，然而研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)鐵離子的過(guò)量累積(鐵過(guò)載)可能具有一定的神經(jīng)毒性并參與了諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展。一種鐵離子的螯合劑—去鐵胺 (Deferoxam ine，DFO)，被證實(shí)能夠拮抗這種鐵離子超載所引起的神經(jīng)損傷，該保護(hù)作用在創(chuàng)傷性顱腦損傷、出血性腦卒中、阿爾茲海默癥、帕金森病等疾病的研究中初步得到證實(shí)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探索在小鼠局灶性腦缺血損傷中早期給予去鐵胺后是否同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用。

材料與方法

1 儀器與試劑 德國(guó)LEICA手術(shù)顯微鏡；全自動(dòng)脫水機(jī)(BLEICA ASP300型，德國(guó));德國(guó)LEICA公司石蠟包埋機(jī)；德國(guó)LECIA公司石蠟切片機(jī)；日本Olympus 公司BX41熒光顯微鏡；美國(guó)Media Cybernetics公司Image Pro Plus 6.0 ( IPP 6.0)彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件；一抗：山羊抗小鼠NeuN抗體(Gene Tex公司)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性C57BL/6J小鼠30只，購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重20～25 g，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、模型組、DFO處理組，每組10只小鼠。DFO購(gòu)自瑞士諾華制藥有限公司，DFO溶于0.9%生理鹽水中，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前1 h，DFO處理組小鼠腹腔注射DFO(50 mg/kg)，假手術(shù)組及模型組小鼠于同樣時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

3 小鼠局灶性腦缺血模型的制備 應(yīng)用改良Longa線栓法制作小鼠局灶性腦缺血損傷模型(MCAO)[5]。以1%戊巴比妥鈉，45 mg/kg，腹腔注射法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)施麻醉，麻醉成功后將小鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)，剪去小鼠頸部毛發(fā)，常規(guī)碘伏消毒，經(jīng)頸部正中切口暴露下頜腺體，牽開(kāi)腺體，逐層分離，暴露小鼠右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈。穿細(xì)線結(jié)扎頸外動(dòng)脈及頸總動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端處穿細(xì)線打一活結(jié)備用，斜45°在頸總動(dòng)脈上剪一小口，線栓通過(guò)剪開(kāi)的小口進(jìn)入頸總動(dòng)脈，穿入頸內(nèi)動(dòng)脈直達(dá)中動(dòng)脈起始端(以頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分叉處計(jì)算，進(jìn)線深度約1.1 cm，插入線栓遇輕微阻力感即停止進(jìn)線)，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈處預(yù)先備好的細(xì)線，固定線栓，間斷縫合后手術(shù)完成，將術(shù)后的小鼠放入37 ℃恒溫箱單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)飲食，術(shù)后2 h后根據(jù)Longa評(píng)分法[6]，評(píng)分達(dá)到1～3分者，表示模型成功，假手術(shù)組小鼠手術(shù)同上，但不插入線栓。

4 行為學(xué)評(píng)分 應(yīng)用改良版神經(jīng)損傷嚴(yán)重性(mNSS)評(píng)分法對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分[7]，mNSS評(píng)分從運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、平衡和反射四個(gè)方面進(jìn)行神經(jīng)損傷評(píng)分，共計(jì)18分，0分正常，分值越高損傷越嚴(yán)重，所有小鼠在手術(shù)后24 h進(jìn)行評(píng)分并記錄。

5 腦組織含水量計(jì)算 采用干濕重法計(jì)算腦組織含水量，腦缺血損傷后24 h，斷頭法處死小鼠，快速取出腦組織，在電子天平秤上稱(chēng)重，然后將小鼠腦組織放入溫度為80 ℃的恒溫烤箱中烘烤，待腦組織重量恒定后秤取重量，腦含水量計(jì)算：(濕重-干重)/濕重×100%。

6 腦組織梗死體積百分比計(jì)算 小鼠缺血性腦損傷24 h后，斷頭法取腦，將腦組織置于小鼠腦磨具中，以2 mm為厚度行腦組織切片，切片侵泡于PBS配置好的濃度為2% ，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液，染色約30 min后取出。觀察梗死情況，用Image Pro Plus6.0軟件計(jì)算梗死體積百分比。

7 神經(jīng)元Neun免疫熒光染色 于腦缺血損傷24 h取梗死灶周?chē)X組織進(jìn)行石蠟切片，脫蠟，梯度酒精脫水，檸檬酸高壓高熱法抗原修復(fù)，0.01 mol/L PBS漂洗3×5 min，加封閉血清，再用0.01 mol/L PBS 漂洗1次，加一抗(Neun1∶100稀釋)，孵育 1 h，室溫過(guò)夜。0.01 mol/L PBS 漂洗3次，加熒光二抗，37 ℃，孵育1 h。0.01 mol/L PBS 漂洗3×5 min，甘油封片。顯微熒光鏡觀察，由未參與實(shí)驗(yàn)者在20×放大倍數(shù)下隨機(jī)拍照選取Neun陽(yáng)性染色細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)6次取均值。

結(jié) 果

1 神經(jīng)損傷行為學(xué)評(píng)分及腦組織含水量檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均進(jìn)行mNSS神經(jīng)損傷評(píng)分，假手術(shù)組神經(jīng)損傷評(píng)分為0分，DFO組缺血24 h后神經(jīng)損傷評(píng)分(9.25±1.52)，較模型組缺血損傷 24 h評(píng)分(13.50±1.50)低 (P<0.05)。小鼠腦缺血損傷24 h后腦組織含水量檢測(cè)結(jié)果顯示，DFO處理組小鼠腦組織含水量明顯較模型組低 (P<0.05)。

表1 各組小鼠mNSS行為學(xué)評(píng)分、腦含水量檢測(cè)比較

2 腦梗死體積百分比 見(jiàn)圖1、2。小鼠腦缺血損傷24 h后腦組織TTC染色，其中白色為缺血梗死腦組織，紅色為正常腦組織。圖中可見(jiàn)假手術(shù)組無(wú)梗死腦組織，DFO組及模型組均可見(jiàn)梗死腦組織，其中DFO組小鼠腦梗死體積百分比較模型組低 (P<0.05)。

白色：梗死腦組織，紅色：正常腦組織

DFO組與模型組比較，*P<0.05

3 神經(jīng)元Neun染色 見(jiàn)圖3。腦缺血損傷24 h后取腦缺血損傷病灶周?chē)X組織切片進(jìn)行神經(jīng)元免疫熒光染色，可見(jiàn)假手術(shù)組Neun陽(yáng)性染色分布均勻，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高(230.0±20.0)；模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(90.0±11.0)，而DFO處理組Neun陽(yáng)性數(shù)明顯較模型組多(180.0±15.0)，DFO組較模型組存活神經(jīng)細(xì)胞明顯增加(P<0.05)。

討 論

大量研究結(jié)果認(rèn)為，鐵過(guò)載后可以通過(guò)Fenton反應(yīng)增加自由基形成，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)造成神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[8]。DFO是一種鐵離子螯合劑，臨床上主要用于治療慢性鐵負(fù)荷過(guò)量等疾病，DFO可以通過(guò)和游離鐵離子發(fā)生螯合反應(yīng)以減輕鐵離子在組織中的過(guò)載，基于DFO的這一作用，人們推測(cè)DFO可以通過(guò)對(duì)抗鐵過(guò)載從而抑制鐵過(guò)載引起的脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激損傷等一系列病理生理過(guò)程，進(jìn)而發(fā)揮一定的臨床治療效果。張均禮等[3]在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷研究中證實(shí)了去鐵胺的治療效果，發(fā)現(xiàn)早期給予 DFO 治療，能顯著減輕大鼠腦缺損體積和致傷灶周?chē)窠?jīng)元損傷并改善大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，同樣在腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等疾病中DFO的腦保護(hù)作用同樣得到了證實(shí)。創(chuàng)傷性顱腦損傷、腦出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血等疾病有著共同的病理生理機(jī)制，我們猜測(cè)是否在缺血性腦損傷中DFO同樣發(fā)揮著腦保護(hù)作用？首先本實(shí)驗(yàn)通過(guò)行為學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損傷中，DFO處理組小鼠神經(jīng)行為學(xué)損傷明顯較假手術(shù)組損傷輕。其次，我們應(yīng)用干濕重法及腦梗死體積百分比比較發(fā)現(xiàn)，DFO處理組小鼠腦含水量、梗死體積百分比等明顯較假手術(shù)組低。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在缺血性腦損傷中DFO同樣可以減輕損傷后小鼠腦組織的梗死體積，減輕腦水腫。Neun染色作為一種神經(jīng)元細(xì)胞核的特異性標(biāo)記物染色，可以觀察腦組織神經(jīng)元損傷情況，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠腦缺損傷后腦組織切片Neun熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均較假手術(shù)組少，然而去鐵胺處理組小鼠腦組織切片Neun熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組多，說(shuō)明去鐵胺處理后對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用DFO治療后可以明顯減輕缺血性腦損傷小鼠的神經(jīng)行為學(xué)損傷、減輕腦組織水腫及梗死體積，抑制神經(jīng)元細(xì)胞壞死等，從而在缺血性腦損傷中發(fā)揮積極作用。

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*陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目(2014E16)

缺氧缺血，腦/藥物療法 去鐵胺/治療應(yīng)用 鐵過(guò)載

R651.19

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.007

(收稿：2017-01-12)