孫曉力，翟宏軍△，張心武，馬小斌，馬雙余

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科(西安710004)，2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科(西安710004)

△通訊作者

芹菜素誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

孫曉力1，翟宏軍1△，張心武1，馬小斌2，馬雙余1

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科(西安710004)，2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科(西安710004)

目的：探討芹菜素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡作用及相關(guān)機(jī)制。方法：常規(guī)培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞分為芹菜素40、80、160 μmol/L組和空白對(duì)照組，分別用芹菜素40、80、160 μmol/L和生理鹽水進(jìn)行處理。處理24、48 h后，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理48 h后凋亡和細(xì)胞周期情況，Western blot方法檢測(cè)處理48 h后，Pro-Caspase-3、Caspase-3和Caspase-6蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：MTT和流式結(jié)果顯示，芹菜素80、160 μmol/L 處理組在24、48 h均可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)，且160 μmol/L 處理組比80 μmol/L處理組的抑制作用更強(qiáng)。40 μmol/L處理組在24 h顯示對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定作用，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot結(jié)果顯示，芹菜素40、80、160 μmol/L組和空白對(duì)照組處理細(xì)胞48 h后，Caspase-3和Caspase-6蛋白表達(dá)水平隨著芹菜素濃度的增高而依次上調(diào)，同時(shí)Pro-Caspase-3蛋白表達(dá)逐次降低。結(jié)論：芹菜素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖有抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與Caspase-3、6信號(hào)通路的激活有關(guān)。

芹菜素廣泛存在于水果和蔬菜中，并且具有抗炎、抗腫瘤以及自由基清除等作用[1-3]。研究結(jié)果顯示，芹菜素可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期停滯和凋亡作用來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[3-4]。本研究利用人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞探討芹菜素的體外抗腫瘤作用及其作用機(jī)制。

材料與方法

1 材料與試劑 人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株(美國(guó)細(xì)胞庫(kù)，ATCC)；胎牛血清(FBS；Gibco，美國(guó))；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))；青霉素、鏈霉素(Solarbio，中國(guó))；MTT(Sigma，美國(guó))；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce，美國(guó))；Bio-Rad protein assay和預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Bio-Rad，美國(guó))；Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)凋亡試劑盒(Beckman Coulter，美國(guó))；碘化丙啶(PI；Sigma，美國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①實(shí)驗(yàn)分組：將人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)將細(xì)胞分為芹菜素40、80、160 μmol/L組和空白對(duì)照組，按照分組條件分別用芹菜素40、80、160 μmol/L和生理鹽水處理。②MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，按照分組條件分別加入芹菜素40、80、160 μmol/L和生理鹽水，其中每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h后，各組細(xì)胞分別加入5 mg/ml MTT 20 μl/孔，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h吸去上清液，每孔加150 μl 二甲基亞砜，搖床震蕩溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度(A)值，檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況并繪圖。③流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞，以2×105個(gè)/ml密度接種于6孔板中，孵育過(guò)夜后，按照分組條件處理細(xì)胞，48 h后每組收集1×105個(gè)細(xì)胞，PBS清洗后離心沉淀，70%乙醇溶液重懸并固定過(guò)夜，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗1次后離心收集，加入500 μl含50 μg/ ml PI、100 μg/ml RNase A、0.2% Triton X-100 的預(yù)冷PBS，避光放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；同樣方法收集洗滌細(xì)胞，加入10 μl AnnexinV- FITC，冰上避光孵育15 min，離心去除上清，并用預(yù)冷緩沖液重懸，加入10 μl PI，混勻后樣本置于冰上避光15 min，PBS清洗，1 ml PBS重懸后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。④Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)：根據(jù)分組條件，收集處理完成的MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞裂解液冰上裂解。BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度定量，按Bio-Rad說(shuō)明書以總蛋白量20 μg/孔進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后，凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入Pro-Caspase-3、β-actin、Caspase-3和Caspase-6小鼠單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG-HRP，電化學(xué)發(fā)光顯影，Alpha凝膠成像系統(tǒng)拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ANOVA重復(fù)測(cè)量方差分析法對(duì)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間細(xì)胞生長(zhǎng)水平差異比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度芹菜素處理24、48 h對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 見圖1。芹菜素80、160 μmol/L 處理組在24、48 h均可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)，且160 μmol/L 處理組比80 μmol/L處理組的抑制作用更強(qiáng)。40 μmol/L處理組在24 h顯示對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定作用，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。芹菜素相同作用濃度下，處理時(shí)間越長(zhǎng)則細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)。

與空白對(duì)照組相比，**P<0.01，*** P< 0.001

2 不同濃度芹菜素處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 見圖2。不同濃度芹菜素處理細(xì)胞48 h后能夠促細(xì)胞凋亡。和生理鹽水處理組相比，80、160 μmol/L芹菜素處理48 h后可顯著促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，且凋亡率160 μmol/L處理組比80 μmol/L處理組更高。40 μmol/L處理組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有一定的促凋亡作用，但與生理鹽水組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。芹菜素對(duì)細(xì)胞凋亡的作用依賴于藥物濃度。

A：對(duì)照組；B:芹菜素40 μmol/L處理組；

3 不同濃度芹菜素處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響 見圖3。對(duì)照組細(xì)胞大部分位于G0/G1期，80、160 μmol/L組在處理48 h后，細(xì)胞更多停留在G2/M期，40 μmol/L處理組雖然細(xì)胞進(jìn)入G2/M期有一定促進(jìn)作用，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

4 不同濃度芹菜素處理對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Pro-Caspase-3、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達(dá)的影響見圖4。隨著芹菜素濃度的增高，Caspase-3和Caspase-6蛋白表達(dá)水平依次上調(diào)，同時(shí)Pro-Caspase-3蛋白表達(dá)逐次降低。說(shuō)明芹菜素可通過(guò)上調(diào)Caspase-3和 Caspase-6的表達(dá)水平，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。

A：對(duì)照組；B:芹菜素40 μmol/L處理組；

圖4 芹菜素處理MDA-MB-231細(xì)胞48 h后對(duì)Pro-Caspase-3、Caspase-3、Caspase-6蛋白表達(dá)的影響

討 論

芹菜素(apigenin，C15H10O5)又被稱為4，5，7-三羥基黃酮，是一種可從傘形科植物旱芹中分離提取的天然黃酮類化合物[5]，同時(shí)也廣泛存在于水果、蔬菜、豆類以及植物源性的飲品中，因此被認(rèn)為是黃酮的主要來(lái)源之一。本研究主要利用芹菜素對(duì)人乳腺細(xì)胞株MDA-MB-231進(jìn)行干預(yù)，初步探討芹菜素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，芹菜素對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和細(xì)胞周期的作用，并能明顯促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡，且作用依賴于時(shí)效和量效性。在此實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步檢測(cè)了Caspase通路相關(guān)蛋白Pro-Caspase-3、Caspase-3和Caspase-6的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，芹菜素可顯著上調(diào)Caspase-3和Caspase-6蛋白表達(dá)水平，同時(shí)下調(diào)Pro-Caspase-3蛋白表達(dá)水平，該作用具有一定量效性。這說(shuō)明芹菜素可能通過(guò)Caspase途徑上調(diào)Caspase-3和 Caspase-6的表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞發(fā)生程序性死亡的一系列有序的過(guò)程，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有兩種核心途徑可誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生，外在的死亡受體途徑以及內(nèi)在的線粒體途徑[6]。其中，內(nèi)在途徑與線粒體膜電位變化(ΔΨm)和線粒體通透性轉(zhuǎn)變有關(guān)[7]。當(dāng)細(xì)胞收到來(lái)自細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的信號(hào)刺激時(shí)，線粒體外膜的滲透性發(fā)生改變，細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)中，而釋放的細(xì)胞色素C則可形成凋亡小體(一種由細(xì)胞色素C和凋亡蛋白酶激活因子1組成的蛋白復(fù)合物)激活Caspase通路，最終導(dǎo)致Caspase-9和隨后的Caspase-3的活化，細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡。Caspase蛋白家族是一類存在于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，目前已發(fā)現(xiàn)14個(gè)成員，可分為三類：凋亡效應(yīng)分子、凋亡啟動(dòng)分子以及促炎分子類。無(wú)論外在的死亡受體途徑還是內(nèi)在的線粒體途徑，均需經(jīng)過(guò)Caspase蛋白的活化和處理。其中，Caspase-3和Caspase -6屬于凋亡效應(yīng)分子，位于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，可直接使細(xì)胞發(fā)生凋亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)芹菜素處理后的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞Caspase-3蛋白水平的顯著上調(diào)，酶原形式的Pro-Caspase-3表達(dá)下降，因此可推斷芹菜素能誘發(fā)Caspase-3的活化。在Caspase-3蛋白活化的同時(shí)，凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-6在芹菜素處理后也出現(xiàn)表達(dá)的上調(diào)。該結(jié)果提示芹菜素可直接或者間接誘發(fā)Caspase信號(hào)通路中效應(yīng)蛋白Caspase-3和Caspase -6，對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡的作用。

綜上，芹菜素能抑制人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制可能與芹菜素引起Caspase信號(hào)通路中Caspase-3、6蛋白表達(dá)增加有關(guān)。其具體的分子機(jī)制還需要未來(lái)做出更深入的臨床前藥理學(xué)研究，但是本研究仍為芹菜素應(yīng)用于臨床抗乳腺癌治療提供了應(yīng)用前的理論依據(jù)。

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StudyonapigenininducedapoptosisofhumanbreastcancercelllineMDA-MB-231

Sun Xiaoli，Zhai Hongjun，Zhang Xinwu，et al.

Department of General Surgery， The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004 )

Objective: To study the apigenin induced apoptosis of human breast cancer cell line MDA-MB-231 and its mechanism. Methods: Conventional culture human breast cancer cell line MDA-MB-231. The cells in logarithmic phase were divided into 40，80，160 μmol/L apigenin group and control group，and treated with 40，80，160 μmol/L apigenin and saline respectively. After 24 and 48 h treatment，cell proliferation was measured using the MTT assay to detect every group. Flow cytometry was used to detect the rate of apoptotic and cell cycle for MDA-MB-231 cells after treated with 40，80，160 μmol/L apigenin and saline for 48 h. The protein expression of Pro-Caspase-3，Caspase-3 and Caspase-6 were detected by Western blot in every group after 48 h treatment. Results: MTT and flow cytometry assay showed that both 80，160 μmol/L apigenin treated group significantly inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cells after 24，48 h，and the inhibition of 160 μmol/L treated group was stronger than 80 μM treated group. 50 μmol/L apigenin treated group had an inhibitive effect compared with the control group，but there was no significant difference. Western blot revealed that the expressions of Caspase-3 and Caspase-6 were up-regulated with the increased of apigenin concentration，as well as the expression of Pro-Caspase-3 was decreased. Conclusion: Apigenin exhibits an inhibitory effect of the proliferation and promote apoptosis of MDA-MB-231 cells.The mechanism may be associated with the activation of Caspase-3，6 signaling pathway.

Breast neoplasms Cell proliferation Apoptosis @Apigenin

*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015JM8430)

乳腺腫瘤 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 @芹菜素

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.005

(收稿：2017-03-22)