羅花南，馬思敬，易春曦，高 瀅，侯 瑾，閆 靜，任曉勇Δ

1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院(西安710004)，2.西安市中心醫(yī)院(西安710004)

miR-9過表達對鼻咽癌細胞遷移和侵襲的影響*

羅花南1，馬思敬1，易春曦2，高 瀅1，侯 瑾1，閆 靜1，任曉勇1Δ

1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院(西安710004)，2.西安市中心醫(yī)院(西安710004)

目的：探討miR-9對鼻咽癌細胞遷移和侵襲能力的影響。方法：慢病毒懸液感染鼻咽癌C666-1細胞，流式細胞儀分選并鑒定，獲得表達miR-9的C666-1細胞及對照細胞，應用體外劃痕實驗、Transwell侵襲實驗分析miR-9對鼻咽癌C666-1細胞體外遷移、侵襲能力的影響。結果：制作劃痕12 h后，穿越劃痕的C666-1/miR-9細胞數(47.167±2.552)顯著少于C666-1/PLVTHM細胞(95.917±3.118)(t=41.912，P<0.01)；接種12 h 后，穿透基質膠的C666-1/miR-9細胞數(32.667±3.257)顯著少于C666-1/PLVTHM細胞(81.833±4.366)(t=31.270，P<0.01)。結論：miR-9過表達能抑制鼻咽癌細胞的體外遷移和侵襲能力，在鼻咽癌中發(fā)揮抑癌作用。

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)作為常見的頭頸部惡性腫瘤之一，發(fā)病隱匿，且極易發(fā)生頸部淋巴結轉移和遠處轉移。而一旦轉移患者的中位生存時間則大大縮短，常不超過1年[1]。因此，探討鼻咽癌惡性進展的分子機制，對指導鼻咽癌患者的診療有較大臨床意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類大小為22nt左右的單鏈非編碼核糖核酸，與其靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)互補結合后可調控靶基因的轉錄或翻譯。目前，已有多位學者研究不同miRNA分子在鼻咽癌發(fā)病中的作用及分子機制：鼻咽癌中miR-185低表達，致WNT2B過表達，從而促進鼻咽癌的侵襲和轉移[2]；miR-101通過下調ITGA3的表達抑制鼻咽癌的侵襲和血管新生[3]。miR-9作為一種常見的microRNA分子，其在腫瘤的作用仍不明確。本研究前期發(fā)現miR-9的表達與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，但miR-9在鼻咽癌中的具體作用仍不清楚。因此，本研究通過慢病毒感染篩選表達miR-9的鼻咽癌細胞，明確miR-9過表達對鼻咽癌細胞惡性潛能的影響。

材料與方法

1 細胞與試劑 C666-1為常見的人鼻咽癌細胞株，由我科實驗室保存。RPMI1640、胎牛血清購自美國Hyclone公司。miRNA 提取試劑盒購自美國Ambion公司，miRNA逆轉錄試劑盒、內參U6和miR-9的特異性探針試劑盒均購自美國ABI公司。基質膠及Transwell小室購自美國BD公司。含有PLVTHM/miR-9載體及對照PLVTHM載體的慢病毒懸液為本實驗室保存，用于后續(xù)的穩(wěn)定株篩選。

2 穩(wěn)定過表達miR-9的細胞株篩選 用含10%新生牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)C666-1細胞。將C666-1細胞接種至6孔培養(yǎng)板(2×105/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度達40%左右，每孔中加入1 ml PLVTHM/miR-9和PLVTHM慢病毒懸液，感染12 h后更換培養(yǎng)基，48～72 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(GFP)并拍照，計算感染效率。采用流式細胞儀分選獲得GFP+細胞，并繼續(xù)擴大培養(yǎng)，使用熒光定量PCR法檢測miR-9的表達，以鑒定是否篩選成功。

3 體外劃痕實驗 待接種到6孔板中的細胞融合至90%以上時，用槍頭在培養(yǎng)板中垂直劃線(勿傾斜，每孔至少5條線，且相互平行)。吸干培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基后，放入37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。按0、6、12 h取樣，計數并拍照。

4 Transwell侵襲實驗 在Transwell小室的上室(24孔板)內加入200 μl預溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置10 min，使基質膠再水化。胰蛋白酶消化細胞制成單細胞懸液，PBS洗滌后計數，調整細胞濃度為2.0×104/ml。取細胞懸液200 μl加至Transwell小室的上室，下室內加入500 μl含FBS的完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12 h后取出小室，去除基底膜正面的細胞，并用亞甲藍對穿透基質膠的細胞進行染色，PBS沖洗、風干后顯微鏡下計數。

5 統(tǒng)計學方法 所有數據均采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，用獨立樣本的t檢驗比較兩樣本均數的差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 篩選穩(wěn)定過表達miR-9的C666-1細胞 將低溫保存的兩種慢病毒顆粒(慢病毒PLVTHM/miR-9其滴度為3.2×105TU/ml，對照慢病毒PLVTHM其滴度為4.9×105TU/ml)分別感染C666-1細胞，72 h后熒光顯微鏡下觀察均發(fā)出GFP，遂用流式細胞儀分選獲得C666-1/PLVTHM細胞(圖1A)和C666-1/miR-9細胞(圖1B)，兩者GFP表達率均達99%以上。接著，應用熒光定量PCR法檢測兩組細胞其miR-9的表達水平，經2-ΔΔCt法計算后發(fā)現C666-1/miR-9中miR-9的表達水平比對照組細胞C666-1/PLVTHM高3236倍(圖1C)，說明穩(wěn)定過表達miR-9的C666-1/miR-9細胞篩選成功。

2 miR-9過表達對C666-1細胞體外遷移能力的影響 制作劃痕12 h后，穿越劃痕的C666-1/miR-9細胞數(47.167±2.552)顯著少于對照細胞C666-1/PLVTHM(95.917±3.118)(圖2)(t=41.912，P<0.01)，說明miR-9過表達可削弱鼻咽癌細胞體外遷移能力。

圖1 穩(wěn)定過表達miR-9的C666-1細胞及其對照細胞的篩選(×200)

圖2 miR-9過表達對C666-1細胞體外遷移能力的影響(劃痕實驗)(×200)

3 miR-9過表達對C666-1細胞體外侵襲能力的影響 接種12 h后，穿透基質膠的C666-1/miR-9細胞數(32.667±3.257)顯著少于對照細胞C666-1/PLVTHM(81.833±4.366)(圖3)(t=31.270，P<0.01)，說明miR-9過表達可削弱鼻咽癌細胞的體外侵襲能力。

圖3 miR-9過表達對C666-1細胞體外侵襲能力的影響(Transwell侵襲實驗)(×200)

討 論

在腫瘤中研究miR-9作用的報道并不多見，所以關于miR-9的作用目前還存在較大爭議：Sun等[4]認為miR-9可通過抑制KLF17的表達增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力；Ma等[5]認為miR-9促進乳腺癌細胞遷移和侵襲的作用與通過β-catenin信號轉導通路的活化，促進VEGF的表達和腫瘤血管的形成有關；Zheng等[6]認為miR-9可通過抑制cyclin D1和 Ets1的表達抑制胃癌細胞的增殖，而He等[7]認為miR-9通過靶向調控SDF-1/CXCR4抑制卵巢癌細胞的增殖。但是腺癌與鱗狀細胞癌病理類型不同，故miR-9在上述腫瘤類型中的研究結果可能并不適用于鼻咽癌。本研究中通過細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗研究發(fā)現C666-1/miR-9細胞越過劃痕區(qū)、穿過Matrigel基質膠的細胞數目較對照組C666-1/PLVTHM細胞顯著減少，說明miR-9過表達可削弱鼻咽癌細胞的惡性潛能。

本研究還發(fā)現，過表達miR-9的C666-1細胞其細胞形態(tài)發(fā)生改變，由長梭形變成圓鈍形，提示C666-1細胞可能發(fā)生了上皮-間質轉化(EMT)。這與Ma等[5]的研究結果不同：在永生化的乳腺上皮細胞HMLE中過表達miR-9后可引起E-cadherin表達下調70%，間質標記Vimentin上調5倍，導致細胞的遷移和侵襲能力增強，相反在SUM149乳腺癌細胞中，miR-9過表達可下調E-cadherin的表達至50%，但不可誘導Vimentin和其他間質標記的表達，也不能誘導細胞纖維狀形態(tài)的變化，說明miR-9對于本身不具有轉移能力的正常乳腺上皮細胞，能賦予其從無到有的轉移能力，而對已具有轉移能力的乳腺癌細胞則無效，其具體機制還有待進一步探討。本研究與Ma等[5]的研究結果不同可能是因為miR-9在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用，但miR-9與EMT均密切相關則是兩者的共同點，因此miR-9與EMT之間的相關性及其在鼻咽癌中的作用機制有待進一步明確。

[1] 王鋒剛，王天昶，吳 磊，等.淋巴結轉移對鼻咽癌預后的研究[J].陜西醫(yī)學雜志，2016，45(4)：474-477.

[2] Liu C，Li G，Ren S，etal.miR-185-3p regulates the invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma by targeting WNT2B in vitro[J].Oncol Lett，2017，13(4):2631-2636.

[3] Tang XR，Wen X，He QM，etal.MicroRNA-101 inhibits invasion and angiogenesis through targeting ITGA3 and its systemic delivery inhibits lung metastasis in nasopharyngeal carcinoma[J].Cell Death Dis，2017，8(1):e2566.

[4] Sun Z，Han Q，Zhou N，etal. MicroRNA-9 enhances migration and invasion through KLF17 in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Oncol，2013，7(5):884-894.

[5] Ma L，Young J，Prabhala H，etal. miR-9，a MYC/MYCN-activated microRNA，regulates E-cadherin and cancer metastasis[J]. Nat Cell Biol，2010，12(3):247-256.

[6] Zheng L，Qi T，Yang D，etal. microRNA-9 suppresses the proliferation，invasion and metastasis of gastric cancer cells through targeting cyclin D1 and Ets1[J].PLoS One.2013，8(1):e55719.

[7] He L，Zhang L，Wang M，etal. miR-9 functions as a tumor inhibitor of cell proliferation in epithelial ovarian cancer through targeting the SDF-1/CXCR4 pathway[J].Exp Ther Med，2017，13(4):1203-1208.

TheeffectsofmiR-9onmigrationandinvasionofnasopharyngealcarcinoma

Luo Huanan，Ma Sijing，Yi Chunxi，et al.

The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710004)

Objective: To investigate the effects of miR-9 on migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells.Methods: After lentiviral infection in nasopharyngeal carcinoma C666-1 cell suspension，flow cytometry sorting and identification for obtaining stable overexpression of miR-9 cell lines，C666-1/miR-9 and control cells C666-1/PLVTHM were evaluated to analyze the effects of miR-9 on cell migration and invasion，using wound healing assay and transwell invasion in vitro.Results: After being made a scratch for 12h，the number of C666-1/miR-9 cells passing through the scratch(47.167±2.552) was significantly lower than that of C666-1/PLVTHM cells (95.917±3.118) (t=41.912，P<0.01); meanwhile，after being coated in the transwell champer，the number of C666-1/miR-9 cells penetrating through the Matrigel (32.667±3.257) was significantly less than that of C666-1/ PLVTHM cells (81.833±4.366) (t=31.270，P<0.01). Conclusion: Overexpression of miR-9 can inhibit the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro，indicating that miR-9 plays an important role in the inhibition of nasopharyngeal carcinoma cells.

Nasopharyngeal neoplasms Cell migration inhibition Neoplasm invasiveness @miR-9

*高等學校博士學科點專項基金資助項目(2012020110087)

陜西省社會發(fā)展科技攻關項目(2015SF044)

Δ通訊作者

鼻咽腫瘤 細胞遷移抑制 腫瘤侵潤 @miR-9

R739.63

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.004

(收稿：2017-04-04)