李建英，王娟紅，魚 軍，牛 健，李秀萍，張 毓，陳 巍

西安市中心醫(yī)院(西安 710003)

△通訊作者

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、RET/PTC在橋本甲狀腺炎合并甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其意義*

李建英，王娟紅△，魚 軍，牛 健，李秀萍，張 毓，陳 巍

西安市中心醫(yī)院(西安 710003)

目的：探討核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與RET/PTC在橋本甲狀腺炎(HT)合并甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者中的表達(dá)、兩者的相關(guān)性及其可能的致癌機(jī)制。方法：對(duì)20例HT，20例PTC、15例HT合并PTC患者手術(shù)切除的甲狀腺組織及18例甲狀腺腺瘤患者腺瘤旁正常甲狀腺組織(NTT)用免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測(cè)RET/PTC癌基因和NF-κB p65蛋白表達(dá)情況，并研究?jī)烧弑磉_(dá)的相關(guān)性；用免疫熒光雙標(biāo)記法和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)并觀察NF-κB與RET/PTC的共表達(dá)情況。結(jié)果：IHC結(jié)果顯示HT、HT合并PTC、PTC中RET/PTC陽性率分別為30%(6/20)、60%(9/15)和65%(13/20)，NF-κB p65 陽性率分別為90%(18/20，9例核轉(zhuǎn)位)、93.3%(14/15，13例出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位)和95%(19/20，16例出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位)，18例NTT中RET/PTC癌基因蛋白表達(dá)均為陰性，NF-κB 陽性率為27.8%(5/18，無1例出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位)。RET/PTC和NF-κB p65在HT、HT合并PTC和PTC中的表達(dá)均顯著高于NTT組(均P<0.05)，而且NF-κB p65的表達(dá)及活化和RET/PTC蛋白的表達(dá)密切相關(guān)(P<0.01)。免疫熒光雙標(biāo)記和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示NF-κB與RET/PTC共表達(dá)于HT及PTC病變甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)。結(jié)論：HT及PTC患者甲狀腺組織中RET/PTC與NF-κB均顯著高于NTT，兩者表達(dá)與活化相關(guān)且共表達(dá)于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)，提示核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65可能通過RET/PTC活化在橋本甲狀腺炎濾泡上皮癌變中發(fā)揮重要的作用。

橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)是世界范圍內(nèi)最常見的器官特異性自身免疫性疾病之一[1]，大量的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)HT與甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)關(guān)系密切[2]。HT中甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞可發(fā)生癌變[3]。RET/PTC癌基因重排通常被認(rèn)為是PTC發(fā)生的特征性基因[4]，但是在HT非癌性甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中該基因的檢出率也非常高，甚至達(dá)到90%以上[5]，說明RET癌基因重排是HT癌變的分子學(xué)基礎(chǔ)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(NF-κB)可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖基因及抗凋亡基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)RET/PTC癌基因產(chǎn)物可以誘導(dǎo)NF-κB的活化[7-8]，推測(cè)NF-κB p65活化及過表達(dá)在甲狀腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中起著很重要的作用[9]。然而，HT患者易患PTC的機(jī)理至今仍不十分明了，本研究旨在通過檢測(cè)HT及PTC中RET/PTC癌基因蛋白表達(dá)及其與NF-κB表達(dá)活化的關(guān)系及共表達(dá)情況，進(jìn)一步探討NF-κB p65在HT癌變中的作用及機(jī)制。

材料與方法

1 標(biāo)本來源 20例HT，15例HT合并PTC，20例PTC石蠟組織標(biāo)本均來自西安市中心醫(yī)院病理科2010-2014年存檔蠟塊。其中，女49例，男6例，年齡24～74歲，平均年齡43.3歲。同期18例甲狀腺腺瘤旁正常甲狀腺石蠟組織標(biāo)本作為對(duì)照組(NTT)，其中，女17例，男1例，年齡25～67歲，平均年齡46.5歲。

2 主要試劑 鼠抗人RET/PTC癌基因單抗、鼠抗人NF-κB p65單抗及兔抗人NF-κB p65多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，Texas Red標(biāo)記的羊抗兔二抗及FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購(gòu)自丹麥DAKO公司，SP試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

3 實(shí)驗(yàn)方法 ①免疫組化檢測(cè)RET/PTC和NF-κB蛋白表達(dá)：免疫組化染色采用常規(guī)鏈霉菌素親生物素-過氧化酶連接法(SP法)。RET/PTC單抗1∶100稀釋，NF-κB p65單抗1∶400稀釋，RET/PTC以胞漿呈棕黃色為陽性，NF-κB以胞漿/核呈棕黃色為陽性。陰性對(duì)照為用PBS代替一抗或用含有小鼠單抗IgG1的神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP，Dako)稀釋至與一抗相同IgG1濃度代替單抗。②NF-κB和RET/PTC抗原免疫熒光雙標(biāo)記及激光共聚焦顯微鏡觀察：免疫組化采用SP法，滴加適當(dāng)稀釋的第一抗體混合液(NF-κB p65兔多抗1∶50，RET/PTC鼠單抗1∶50)，4℃過夜。37℃復(fù)溫1 h，PBS洗滌，5 min × 3次，滴加適當(dāng)稀釋的第二抗體混合液(Texas Red標(biāo)記的羊抗兔1∶50；FITC標(biāo)記的羊抗鼠1∶50)，37℃孵育40 min，PBS洗滌，DAPI襯染細(xì)胞核，PBS充分洗滌，無熒光緩沖甘油封片，用Olympus FV1000的激光共聚焦顯微鏡觀察并照相，用于FITC的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，用于Texas-Red的激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm，用于DAPI的激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm。兩種免疫組化分別設(shè)相應(yīng)的陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 11.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組年齡差異采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，性別差異及每?jī)山M間實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性率差異采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，用卡方檢驗(yàn)研究甲狀腺組織中NF-κB與 RET/PTC表達(dá)及活化的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RET/PTC免疫組化結(jié)果 RET/PTC陽性信號(hào)主要存在于HT及PTC病變組織甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)(見圖1)。HT、HT合并PTC、PTC疾病性甲狀腺組織中RET/PTC陽性率分別為30%(6/20)、60%(9/15)和65%(13/20)，18例正常甲狀腺組織RET/PTC癌基因蛋白表達(dá)均為陰性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，RET/PTC在HT、HT合并PTC和PTC中的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組正常甲狀腺組織(均P<0.05)(見表1)，但是，RET/PTC在HT合并PTC和PTC組中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在HT中的表達(dá)與所有PTC病例(包括HT合并PTC組)中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 HT患者(A)及PTC患者(B)RET/PTC抗體免疫組化染色結(jié)果(SP法×40)

2 NF-κB p65免疫組織化學(xué)結(jié)果 NF-κB陽性信號(hào)主要位于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞胞漿和(或)胞核。HT標(biāo)本中，NF-κB p65陽性信號(hào)位于淋巴濾泡間甲狀腺上皮細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)，少數(shù)表達(dá)于浸潤(rùn)在甲狀腺組織中的淋巴細(xì)胞(見圖2A)。PTC標(biāo)本中，陽性信號(hào)表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)(見圖2B)。在對(duì)照組正常甲狀腺組織中陽性信號(hào)均表達(dá)于甲狀腺上皮細(xì)胞胞漿，但是大多數(shù)正常甲狀腺組織(13/18)上皮表達(dá)陰性。HT、HT合并PTC、PTC和正常甲狀腺組織中NF-κB p65 免疫組化陽性率分別為90%(18/20，9例核轉(zhuǎn)位)、93.3%(14/15，13例出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位)、95%(19/20，16例出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位)和27.8%(5/18，無1例出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位)，它們與RET/PTC蛋白共同表達(dá)率分別為30%(6/20)、60%(9/15)、65%(13/20)和0(RET陽性病例全部出現(xiàn)NF-κB 核轉(zhuǎn)位)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NF-κB p65在HT、HT合并PTC和PTC中的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，而且NF-κB p65的表達(dá)和RET/PTC蛋白的表達(dá)密切相關(guān)(見表1，Pearson χ2檢驗(yàn)，P<0.01)。與正常甲狀腺組織中NF-κB蛋白表達(dá)相比較，發(fā)現(xiàn)在疾病性甲狀腺組織中NF-κB表達(dá)升高并且在HT、HT合并PTC及PTC病人甲狀腺組織中表達(dá)RET蛋白的病例均出現(xiàn)了明確的NF-κB核轉(zhuǎn)位，即NF-κB活化狀態(tài)。

圖2 HT患者(A)及PTC患者(B) NF-κB p65抗體免疫組化染色結(jié)果(SP法×40)

組 別RET抗原NF?κBRET/NF?κBHT6/20(30)?18/20(90)?6/20(30)HT合并PTC9/15(60)?14/15(93．3)?9/15(60)PTC13/20(65)?19/20(95)?13/20(65)NTT0/18((0)5/18(27．8)0/18((0)

注：與NTT組比較，*P<0.05

3 免疫熒光雙標(biāo)記及激光共聚焦顯微鏡結(jié)果 在HT和PTC組織標(biāo)本中，均見紅色的NF-κB陽性信號(hào)位于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)(圖3A)，陽性上皮細(xì)胞同時(shí)表達(dá)RET/PTC蛋白綠色著色(圖3B)，激光共聚焦圖象迭合后發(fā)現(xiàn)絕大部分細(xì)胞共定位于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)(圖3C，黃白色)。

A：NF-κB的表達(dá)(紅色熒光)(Texas Red，×600)；B：RET/PTC抗原的表達(dá)(綠色熒光)(FITC，×600)；C：激光共聚焦結(jié)果，顯示NF-κB和RET/PTC抗原共表達(dá)于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞胞漿和/或胞核(黃白色，藍(lán)色為DAPI襯染細(xì)胞核)(激光共聚焦，×600)

圖3 RET/PTC抗原和NF-κB的免疫熒光雙標(biāo)記及激光共聚焦結(jié)果

討 論

在本研究中，我們通過免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)記激光共聚焦兩種方法在人體甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)HT及PTC中RET/PTC和NF-κB高表達(dá)，共表達(dá)、共定位。利用免疫組化方法，我們發(fā)現(xiàn)HT及PTC患者甲狀腺組織中RET/PTC癌基因表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，并發(fā)現(xiàn)NF-κB p65在HT、HT合并PTC和PTC中的表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，而且NF-κB p65的表達(dá)和RET/PTC蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，進(jìn)一步通過免疫熒光雙標(biāo)記法和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)觀察發(fā)現(xiàn)NF-κB與RET/PTC抗原共表達(dá)于HT及PTC甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)。因此，我們認(rèn)為核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65可能通過RET/PTC活化在橋本甲狀腺炎癌變中發(fā)揮重要的作用。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是Rel蛋白家族成員，是廣泛存在于真核細(xì)胞漿中的核轉(zhuǎn)錄因子，在各種細(xì)胞因子相互影響和相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，起著中心調(diào)控作用[6]。靜息時(shí)NF-κB通常以同源或異源二聚體p65和p50的形式與抑制蛋白IκB結(jié)合成無活性的復(fù)合物滯留于胞漿中。多種因素可激活NF-κB，如細(xì)胞因子、絲裂原、環(huán)境變化、病毒或細(xì)菌產(chǎn)物等。當(dāng)細(xì)胞受到活化刺激后，NF-κB與其抑制蛋白IκB解離，然后自胞漿進(jìn)入胞核與其靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的κB位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)。NF-κB一方面可調(diào)控與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)的許多炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)[9]，在炎癥反應(yīng)的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著中心調(diào)控的作用；另一方面它還可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖基因及抗凋亡基因的表達(dá)，從而在腫瘤的發(fā)生中具有重要作用[7-8]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65 過表達(dá)在甲狀腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程中起著很重要的作用[9]。

RET/PTC癌基因被認(rèn)為是PTC發(fā)生的特征性基因[4]，但是近年來在HT非癌性甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中該基因的檢出率也非常高，甚至達(dá)到90%以上[8]，提示共同的分子機(jī)制可能存在于PTC發(fā)展的早期階段。細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明RET/PTC癌基因產(chǎn)物可以誘導(dǎo)NF-κB的活化[8-9]?；罨腘F-κB一方面能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)正常上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，另一方面，它可以促進(jìn)許多致炎細(xì)胞因子如單核細(xì)胞趨化蛋白MCP1、白介素-6(IL-6)等的轉(zhuǎn)錄，引起腫瘤發(fā)生部位炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞免疫失衡，介導(dǎo)炎癥相關(guān)性腫瘤的形成。在HT中，是否RET/PTC的出現(xiàn)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的早期因素，這一基因的蛋白表達(dá)是否通過誘導(dǎo)NF-κB的活化進(jìn)一步誘導(dǎo)甲狀腺上皮細(xì)胞癌變，導(dǎo)致PTC的發(fā)生？目前，國(guó)內(nèi)外這方面的研究及對(duì)這一致癌途徑的推測(cè)都是基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或者細(xì)胞培養(yǎng)水平所得，人體內(nèi)NF-κB活化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系還很不清楚。本研究中我們通過免疫組化技術(shù) 發(fā)現(xiàn)RET/PTC癌基因蛋白表達(dá)主要存在于甲狀腺乳頭狀癌組織中，也存在于非癌性HT病人的甲狀腺組織中，而正常組織中RET/PTC癌基因代表表達(dá)全部陰性。這一結(jié)果說明PTC病人中大部分發(fā)生RET/PTC重排，正常甲狀腺組織無此癌基因重排，而HT病人中也存在相當(dāng)多的RET/PTC重排病患。出現(xiàn)RET/PTC癌基因重排是HT與PTC共同早期病變，這一結(jié)果為RET/PTC癌基因產(chǎn)物可能誘導(dǎo)NF-κB活化，導(dǎo)致HT癌變?yōu)镻TC提供了理論基礎(chǔ)。通過統(tǒng)計(jì)分析，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NF-κB p65表達(dá)和RET/PTC蛋白的表達(dá)密切相關(guān)，RET/PTC抗原陽性的病例均出現(xiàn)了NF-κB核轉(zhuǎn)位，即NF-κB活化狀態(tài)，這一結(jié)果支持RET/PTC具有對(duì)NF-κB的活化作用。應(yīng)用免疫熒光劑激光共聚焦檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB與RET/PTC抗原共表達(dá)于HT及PTC甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞內(nèi)，這一結(jié)果進(jìn)一步提示RET/PTC能夠活化NF-κB，從而在橋本甲狀腺炎癌變中發(fā)揮重要的作用。我們的研究結(jié)果不但有助于更進(jìn)一步地研究PTC的發(fā)病機(jī)制，而且對(duì)臨床上治療及預(yù)防PTC提供了新的思路。

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*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372857)

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2008K09-09)

西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目[SF09027(9)]

甲狀腺炎 甲狀腺腫瘤 NF-κB 基因表達(dá)調(diào)控，腫瘤 @RET/PTC

R736.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.002

(收稿：2017-02-24)