遲 慧，宋 巖，那 迪，白偉良

miR-152在聲門上型喉癌中的表達(dá)及臨床病理關(guān)系

遲 慧1，宋 巖1，那 迪2，白偉良1

目的探討并分析miR-152在聲門上型喉癌組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究miR-152用于治療靶向藥物、評估預(yù)后提供參考依據(jù)。方法采用Real-time PCR法檢測83例患有聲門上型喉癌患者癌組織中miR-152的表達(dá)，并將miR-152的表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析。最后，通過MTT方法對比轉(zhuǎn)染了miR-152模擬物組和陰性對照組的Hep-2細(xì)胞系受抑制情況。結(jié)果miR-152在聲門上型喉癌組織中顯著低表達(dá)(t=12.65，P<0.001)，并且其低表達(dá)與聲門上型喉癌的T分期(χ2=26.88，P<0.001)和N分期(Z=-3.56，P<0.001)相關(guān)。miR-152可抑制Hep-2細(xì)胞增殖。結(jié)論miR-152可能作為聲門上型喉癌預(yù)后的新靶點(diǎn)。

聲門上型喉癌；MiR-152；Hep-2細(xì)胞系；臨床相關(guān)性

0 引言

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)是全球第6大常見癌癥。每年有160萬新發(fā)病例，33.3萬死于鱗狀細(xì)胞癌，其中有一半發(fā)生在口腔(口腔鱗狀細(xì)胞癌)[1]。每年全世界有500 000名患者被診斷為頭頸鱗狀細(xì)胞癌。在發(fā)達(dá)國家中有95%的喉癌為鱗狀細(xì)胞癌，占惡性腫瘤的5%，嚴(yán)重威脅著人類的健康。喉癌的發(fā)生和發(fā)展涉及許多基因和信號通路。喉癌的發(fā)病機(jī)制始終沒有被闡釋清楚。

miRNAs是大小約為19～23 nt的非編碼RNA，在進(jìn)化過程中高度保守，能夠與靶基因結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平。其被RNA多聚酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為pri-miRNA，再被RNA酶ⅢDrosha加工為70～100個(gè)核苷酸的pre-miRNA[2]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA的調(diào)控失調(diào)與多種疾病相關(guān)。目前，研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)展中起重要的作用。然而，miRNA在喉癌中的調(diào)控機(jī)制仍然是未知的。

最近的研究顯示，一些miRNA與喉癌相關(guān)。Su等[3]發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中miR-152的恢復(fù)顯著抑制了增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移和侵襲[4]。Huang等[5]認(rèn)為，miR-152可能抑制肝癌的增殖。Zhu等[6]認(rèn)為，miR-152可以抑制PCa細(xì)胞的遷移和侵襲。Zheng等[7]發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)侵襲實(shí)驗(yàn)中，miR-15b和miR-152可以顯著降低9L細(xì)胞的侵襲能力。Woo等[8]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-128 和miR-152在卵巢癌中下調(diào)了CSF-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和黏附性降低。

本研究探討并分析miR-152在聲門上型喉癌組織中的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有83例樣本均來自我院2008年5月至2013年8月確診為聲門上型喉癌的患者。所有患者均未發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，術(shù)前沒有接受過放療和化療，接受喉全切除術(shù)。對照組黏膜樣本取自同一患者腫瘤組織邊緣2 cm處。術(shù)后新鮮標(biāo)本立刻進(jìn)行液氮冷凍，于-80 ℃保存。相關(guān)資料(年齡、性別、腫瘤T分期、N分期、患者腫瘤不同分級)均來自我院患者資料信息庫。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和miRNA mimics轉(zhuǎn)染 人喉癌細(xì)胞系Hep-2購自武漢大學(xué)保藏中心細(xì)胞庫。采用RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco)，添加10%血清(Hyclone)，100 U/mL青鏈雙抗(Life Technologies)，5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。在Opti MEM (Invitrogen)培養(yǎng)基中使用lipo2000介導(dǎo)Hep-2細(xì)胞進(jìn)行miR-152 mimic和miRNA mimics 陰性對照(Invitrogen，CA，USA)的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 Real-time PCR 采用Rotor-gene 6000系統(tǒng)(QIAGEN，Valencia，CA)，Universal qPCR通用試劑盒。25 μL PCR體系中包含2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，12.5 μL SYBR Green supermix，8.5 μL 無酶水，1 μL正向引物和1 μL反向引物。本反應(yīng)在36孔板上進(jìn)行，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共計(jì)45個(gè)循環(huán)。使用U6RNA作為內(nèi)參去標(biāo)準(zhǔn)化miR-152的表達(dá)。閾值周期數(shù)據(jù)采用默認(rèn)。對比癌組織和癌旁組織中miRNA的表達(dá)水平，并采用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行計(jì)算[9]。miR-152的相對表達(dá)率已經(jīng)根據(jù)內(nèi)參基因進(jìn)行了歸一化處理，并于癌旁組織做對比。引物序列見表1。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 采用MTT法檢測細(xì)胞增殖的活力。轉(zhuǎn)染24 h后，將轉(zhuǎn)有miR-152 mimics的Hep-2細(xì)胞和轉(zhuǎn)有NC的Hep-2細(xì)胞鋪96孔板，分別孵育24、48、96 h。之后，加入20 μL MTT (5 mg/mL) 37 ℃孵育4 h，室溫下加入150 μL DMSO以溶解結(jié)晶。使用MK3型酶標(biāo)儀(Thermo，Waltham，MA，USA)測490 nm下的吸光度值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并與生長抑制率做對比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用公式2-ΔΔCt計(jì)算癌和癌旁組織中的相對表達(dá)量(ΔCt=CtmiR-152-CtU6；ΔΔCt=ΔCtcancer-ΔCtcontrol)。生長抑制率采用如下公式計(jì)算：(AC-AT)/AC×100% (AC=對照組吸收值，AT=實(shí)驗(yàn)組吸收值)[10]。

2 結(jié)果

2.1 喉癌中miR-152的表達(dá) 對比分析83例進(jìn)行喉全切除術(shù)患者的成對樣本中miR-152的表達(dá)。對比分析癌組織和黏膜組織的ΔCt值。癌組織中ΔCt值為1.92±1.25，對照組為-0.19±1.62。其中74例(89%)與對照組相比為miR-152低表達(dá)(t=12.65，P<0.001)。見圖1。

2.2 miR-152的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 采用非參數(shù)測定法分析miR-152和臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(包括性別、年齡、T分期、N分期和細(xì)胞分化程度)。miR-152的水平在性別、年齡和腫瘤位置之間沒有顯著差異。miR-152低表達(dá)趨向于促進(jìn)了聲門上型喉癌的T分期和N分期(χ2=26.88，P<0.001；Z=-3.56，P<0.001)。具體見表2。

表1 用于RT-PCR擴(kuò)增的miR-152的引物序列

圖1 聲門上型喉癌患者miR-152表達(dá)情況

表2 miR-152的表達(dá)量與聲門上型喉癌患者臨床病理因素的關(guān)系

2.3 miR-152對Hep-2細(xì)胞增殖的影響 為了評價(jià)轉(zhuǎn)染miR-152前后Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞活性，我們對比了轉(zhuǎn)染miR-152模擬物的Hep-2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染miR-152陰性對照模擬物Hep-2細(xì)胞的生長情況。24、48、96 h后，轉(zhuǎn)染模擬物組的抑制率為25%、27%、42.7%，轉(zhuǎn)染陰性對照組的抑制率為8.3%、6.0%、7.3%。如圖2所示，轉(zhuǎn)染模擬物組的抑制率顯著提高。

圖2 MTT檢測轉(zhuǎn)染miR-152后Hep-2細(xì)胞生長抑制率

3 討論

MicroRNA是一群小的高度保守非編碼單鏈RNA家族，通過轉(zhuǎn)錄抑制或結(jié)合到轉(zhuǎn)錄體的3′-UTR區(qū)靶點(diǎn)，降解mRNA，發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miRNA在病理生理過程中具有關(guān)鍵的作用，調(diào)控許多生理進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和致瘤性轉(zhuǎn)化[11]。成熟miR-152序列為54︱5′-UCAGUGCAUGACAGAACUUGGG-3′︱75，許多腫瘤和正常組織都表達(dá)miR-152，但其在發(fā)生、發(fā)展和腫瘤形成等不同時(shí)期呈現(xiàn)差異表達(dá)。miR-152在消化道系統(tǒng)[12-13]和生殖系統(tǒng)腫瘤[14]細(xì)胞和組織中表達(dá)下降，并對腫瘤細(xì)胞生長、增殖、血管新生等發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，起抑癌基因作用，并在一定程度上與疾病的分期、預(yù)后相關(guān)。Azizi等[15]通過對比1型糖尿病患者和年齡相對應(yīng)的正常人發(fā)現(xiàn)，有12個(gè)上調(diào)的miRNA，其中包括miR-152。

miR-152在許多組織中表達(dá)降低，提示其可以作為腫瘤抑制miRNA。Huang等[16]研究顯示，與附近的非癌性肝組織相比，miR-152在HBV相關(guān)的HCC組織中的表達(dá)下降。有報(bào)道，在胃腸道癌中，miR-148a和miR-152在癌組織和癌細(xì)胞系表達(dá)下調(diào)，且miR-152的低表達(dá)與增加的腫瘤大小和T分期的進(jìn)展相關(guān)[17-18]。本研究中，miR-152低表達(dá)與聲門上喉癌的T分期和N分期相關(guān)，提示miR-152可能成為潛在的生物標(biāo)記物。

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-152模擬物轉(zhuǎn)染后的Hep-2細(xì)胞增殖呈時(shí)間依賴性降低，提示 miR-152能夠抑制Hep-2細(xì)胞增長。在83例患者中，74例患者腫瘤組織中miR-152表達(dá)降低。在聲門上型喉癌中miR-152 表達(dá)顯著降低 (t=12.65，P<0.001)。

聲門上型喉癌中miR-152表達(dá)結(jié)果顯示，miR-152低表達(dá)與較差的T分期和N分期有顯著的關(guān)聯(lián)。T3、T4期聲門上型喉癌組織中miR-152表達(dá)較T2期明顯降低(χ2=26.88，P<0.001)。本研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-152的低表達(dá)與N分期相關(guān)(Z=-3.56，P<0.001)。本研究沒有包括T1期的聲門上型喉癌，所有T1期的聲門上型喉癌均采用激光治療。

本文中，83例患者均被診斷為聲門上型喉癌。根據(jù)病變的部位，喉癌分為聲門上、聲門、聲門下3種類型。因?yàn)樵诼曢T區(qū)域缺少淋巴，喉癌不傾向于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。為了使結(jié)果客觀準(zhǔn)確，我們選擇的所有病例均經(jīng)病理確診為聲門上型喉癌。

在聲門上型喉癌中miR-152的表達(dá)與細(xì)胞分化沒有顯著關(guān)系。通過樣本偏差來解釋所得到的結(jié)果，有60例被診斷為高度分化(60/83)，低分化的病例所占比例很小。因此，結(jié)果或許有偏差，期望以后通過擴(kuò)大樣本量來解決此問題。

本文按照N分期將所有病例分為2組。組1包括所有處于N0期的病例；組2包括所有N1、N2、N3、N4期的病例。考慮到樣本量較小，我們沒有將N1～N4繼續(xù)細(xì)分。盡管所有病例僅被分成2組，依然可以顯示miR-152和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。

T分期和N分期較差是生存率的獨(dú)立預(yù)后因素，表明miR-152表達(dá)在診斷方面可能作為生物學(xué)標(biāo)志物；在治療方面，可能會(huì)成為一種藥物用于靶向治療；在預(yù)后評估方面，可能為臨床評價(jià)及判斷預(yù)后提供參考依據(jù)。

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ExpressionofmiR-152anditsclinicalpathologicalsignificanceinsupragalotticlaryngealcarcinoma

CHI Hui1,SONG Yan1,NA Di2,BAI Wei-liang1

(1.Department of Otorhinolaryngology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.the First Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

ObjectiveTo discuss and analyze the expression of miR-152 in tissues of patients with supragalottic laryngeal carcinoma,and provide reference data for further study of the function of miR-152 in tumor target medicine and prediction of the prognosis of supragalottic laryngeal carcinoma.MethodsThe expression of miR-152 was detected in tissues of 83 patients with supragalottic laryngeal carcinoma by Real-time PCR,and the relationship between the expression of miR-152 and clinicopathological parameters was analyzed.The inhibition of the Hep-2 cells which was transfected with miR-152 mimics and transfected with mimics negative control by MTT was compared.ResultsmiR-152 was significantly low-expressed in supragalottic laryngeal carcinoma (t=12.65,P<0.001).Moreover,low-expression of miR-152 was correlated with stage pT (χ2=26.88,P<0.001) and stage pN (Z=-3.56,P<0.001) in supragalottic laryngeal carcinoma.MiR-152 could inhibit the cell proliferation in Hep-2 cells.ConclusionMiR-152 may act as a new tumor target to predict the prognosis of supragalottic laryngeal carcinoma.

Supragalottic laryngeal carcinoma;miR-152;Hep-2 cell line;Clinical relevance

2017-01-28

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽 110004;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2015586)；沈陽市科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目資助(F13-220-9-21)；遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金(2013001010)；遼寧省自然科學(xué)基金(20170541043)

10.14053/j.cnki.ppcr.201710008