陳玉姣，白曉蘇，曾麗紅

補(bǔ)氣生肌方促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面血管新生和創(chuàng)面修復(fù)愈合的作用機(jī)制

陳玉姣a，白曉蘇b，曾麗紅c

目的觀察補(bǔ)氣生肌方對糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面的血管生成和促進(jìn)血管生成的因子表達(dá)的影響。方法選取48只雄性SD大鼠，經(jīng)高脂高糖飼料喂養(yǎng)1周后，按35 mg/kg腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液，糖尿病模型造模成功后制作創(chuàng)面模型，隨機(jī)分為觀察組(24只)和對照組(24只)，其中觀察組局部應(yīng)用補(bǔ)氣生肌中藥涂抹，對照組應(yīng)用凡士林涂抹，均為每日1次。采用免疫熒光法檢測血管生成情況，PCR檢測創(chuàng)面組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)的基因表達(dá)。結(jié)果觀察組第3天、第7天、第14天的創(chuàng)面愈合率高于對照組(P<0.05)。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，第7天觀察組、對照組的創(chuàng)面組織CD-34陽性細(xì)胞數(shù)分別為34.39%±3.46%和12.42%±1.53%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PCR檢測結(jié)果顯示，在第3天、第7天、第14天，觀察組創(chuàng)面組織VEGF-A、bFGF mRNA表達(dá)高于對照組(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)氣生肌方在治療糖尿病難愈性創(chuàng)面時(shí)，可上調(diào)VEGF-A和bFGF基因表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面組織血管生成，有利于難愈性創(chuàng)面的愈合和重建。

補(bǔ)氣生肌方；糖尿??；創(chuàng)面；血管

0 引言

糖尿病性難愈創(chuàng)面是嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥之一，由于創(chuàng)面愈合紊亂，易形成頑固性潰瘍[1-2]。目前，中醫(yī)或者西醫(yī)治療糖尿病性難愈創(chuàng)面均具有一定的局限，如何更有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合是臨床工作中的一大難題。筆者在長期臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，糖尿病創(chuàng)面難愈的原因在于氣虛血瘀，治療上應(yīng)以益氣化瘀、去腐生肌斂瘡為主。經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗(yàn)，筆者總結(jié)出補(bǔ)氣生肌方，并取得了較好的臨床療效。為了進(jìn)一步明確補(bǔ)氣生肌方促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面血管新生和創(chuàng)面修復(fù)愈合的作用機(jī)制，本研究擬觀察其在糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合過程中對血管生成和促進(jìn)血管生成的因子(VEGF、bFGF)表達(dá)的影響，為補(bǔ)氣生肌方在糖尿病性難愈創(chuàng)面的治療奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK粵2014-0011)，二級、清潔，48只，體重(240±20) g。補(bǔ)氣生肌中藥膏及基質(zhì)由本院提供；cDNA Synthesis Kit和SybrGreen PCR Master Mix試劑盒(ABI公司)；鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司)；PCR相關(guān)試劑購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；鼠抗人CD34抗體(Abcam公司)；FITC標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；Vii ATM7型Real time RCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司)；Elx800-UV酶標(biāo)儀(Bio-tek公司)；IX-71熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 動(dòng)物模型的建立 參考文獻(xiàn)方法[3]，大鼠經(jīng)高脂高糖飼料喂養(yǎng)1周后，在空腹3 h狀態(tài)下，稱重。按30 mg/kg腹腔注射1%STZ溶液。3、7 d后測血糖，隨機(jī)血糖持續(xù)高于16.7 mmol/L即認(rèn)定糖尿病大鼠模型成功。造模成功的大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)2周后，于麻醉狀態(tài)下采用8%硫化鈉對大鼠背部脊柱附近腰背部進(jìn)行脫毛，用角膜環(huán)鉆剪去一塊直徑約為8 mm的圓形全層皮膚，制作創(chuàng)面模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只模型大鼠隨機(jī)分為觀察組(24只)和對照組(24只)，其中觀察組局部應(yīng)用補(bǔ)氣生肌中藥涂抹，以局部涂滿為度，1次/d；對照組局部應(yīng)用基質(zhì)膏(凡士林)涂抹，以局部涂滿為度，1次/d。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 動(dòng)物處理及留取標(biāo)本 各組在換藥后第3、7、14天分別處死8只大鼠，以創(chuàng)面為中心，距創(chuàng)面邊緣向外2 mm切取組織。將組織分成兩半，一半放置于液氮中，用于PCR試驗(yàn)；另一半以4%多聚甲醛固定，用于病理標(biāo)本制作。

1.3.2 血糖監(jiān)測 分別于治療前和創(chuàng)面給藥治療后第3、7、14天測定各組大鼠空腹血糖，斷尾取血1 mL，上全自動(dòng)血糖儀檢測。

1.3.3 創(chuàng)面愈合率的測定 分別于創(chuàng)面給藥治療后第3、7、14天對大鼠的創(chuàng)面進(jìn)行拍照，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。

1.3.4 免疫熒光檢測 組織塊標(biāo)本固定于4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋切片，抗原修復(fù)，封閉，滴加鼠抗人CD31抗體(工作濃度1∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗2次，加入FITC標(biāo)記的二抗(工作濃度1∶100)，避光孵育30 min，進(jìn)行DAPI復(fù)染5 min，PBS沖洗多余的DAPI，封片，輕覆上蓋玻片，免疫熒光顯微鏡下觀察并采集圖片，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算陽性染色區(qū)域熒光的強(qiáng)度并量化。

1.3.5 PCR試驗(yàn) 參照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，75 ℃延伸55 s，43個(gè)循環(huán)，75 ℃延伸5 min。目的基因和內(nèi)參的引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GeneBank提供VEGF-A、bFGF和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA序列，由上海華大分子生物技術(shù)研究所合成，見表1。反應(yīng)結(jié)束分析熒光定量數(shù)據(jù)(擴(kuò)增曲線、工作曲線、溶解曲線與相應(yīng)Ct值等)，根據(jù)各組的平均△△Ct值用Light Cycler Software (Version 3.5)計(jì)算出每個(gè)目的基因相對于起始反應(yīng)的拷貝數(shù)。

表1 目的基因的引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 大鼠空腹血糖水平的變化 血糖監(jiān)測結(jié)果顯示，兩組大鼠在治療前和創(chuàng)面給藥治療后第3、7、14天血糖水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠空腹血糖比較(mmol/L)

2.2 大鼠創(chuàng)面愈合率觀察 與對照組相比，觀察組在第3、7、14天的創(chuàng)面愈合率顯著提高(P<0.05)，創(chuàng)面愈合明顯加快(P<0.05)。第14天，隨著肉芽組織的大量形成和逐漸成熟，觀察組創(chuàng)面基本完全愈合，創(chuàng)緣周邊被毛覆蓋，而對照組創(chuàng)面較紅，尚有壞死組織和痂皮。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠潰瘍組織創(chuàng)面愈合情況

表3 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較(%)

注：分組因素主效應(yīng)：F=8.428，P=0.016；時(shí)間因素主效應(yīng)：F=535.463，P<0.001；分組*時(shí)間因素主效應(yīng)：F=14.274，P<0.001

2.3 小鼠創(chuàng)面組織CD-34形成的影響 CD34為黏蛋白樣血管遞質(zhì)素的一種，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、多能造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，可以根據(jù)檢測創(chuàng)面CD34表達(dá)作為新生血管形成的標(biāo)記。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，觀察組和對照組在第7天創(chuàng)面組織CD34陽性細(xì)胞數(shù)分別為34.39%±3.46%和12.42%±1.53%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 兩組大鼠創(chuàng)面組織CD34陽性細(xì)胞比較(第7天，免疫熒光圖，250×)

2.4 大鼠創(chuàng)面組織VEGF-A和bFGF基因表達(dá)情況 PCR檢測結(jié)果顯示，在第3、7、14天，觀察組創(chuàng)面組織VEGF-A和bFGF mRNA表達(dá)均高于對照組(P<0.05)，見表4。

3 討論

糖尿病性難愈創(chuàng)面由于反復(fù)發(fā)作、遷延不愈已成為臨床工作中的一大難題，如何更有效地促進(jìn)創(chuàng)面愈合對于減輕患者痛苦具有重要意義[4-5]。慢性難愈性創(chuàng)面屬祖國醫(yī)學(xué)“潰瘍”的范疇，中醫(yī)重視潰瘍早期祛腐和后期煨膿長肉，對于糖尿病性難愈創(chuàng)面的“新肌”不生或難生等問題的解決具有一定優(yōu)勢[6-7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥對糖尿病性難愈創(chuàng)面具有顯著療效，徐杰男等[8]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎填精方能明顯促進(jìn)大鼠慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)愈合；張旭輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)，回陽生肌膏及其不同拆方均能促進(jìn)慢性皮膚潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合。補(bǔ)氣生肌方是我院根據(jù)中醫(yī)藥“益氣化瘀、去腐生肌、抗菌消炎”的原理自主研發(fā)的純中藥制劑，全方主要由黃芪、白術(shù)、川芎、當(dāng)歸、丹參、姜黃、白蘞、白芨組成，其中，黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)增強(qiáng)免疫、益氣托毒、補(bǔ)血活血、清熱利濕，姜黃、丹參、川芎活血化瘀、涼血消癰、消炎抗菌，白蘞、白芨收斂止血、消腫生肌[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組采用補(bǔ)氣生肌方治療后創(chuàng)面愈合時(shí)間較對照組縮短，提示補(bǔ)氣生肌方能促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面愈合。

糖尿病性難愈創(chuàng)面愈合過程涉及炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成和重構(gòu)等方面，其中肉芽組織形成是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵階段，其通過修復(fù)創(chuàng)面組織的缺損，清除壞死組織，為上皮爬升創(chuàng)造條件[13-15]。肉芽組織形成過程需要新生血管的支持，豐富的新生毛細(xì)血管網(wǎng)能充實(shí)肉芽組織，從而改善創(chuàng)面的微循環(huán)，為其形成提供充分的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，新生血管越多，肉芽組織生長越快，創(chuàng)面愈合時(shí)間縮短[16]。CD34是血管形成的重要標(biāo)志，本研究免疫熒光檢測結(jié)果顯示，觀察組在第7天創(chuàng)面組織CD34陽性細(xì)胞數(shù)高于對照組，提示補(bǔ)氣生肌方較好的臨床療效可能與促進(jìn)創(chuàng)面組織血管生成有關(guān)。

表4 大鼠創(chuàng)面組織VEGF-A和bFGF基因表達(dá)情況

注：與對照組比較，*P<0.05

VEGF和bFGF是創(chuàng)面血管新生的主要調(diào)控因子。VEGF是唯一特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促血管生成因子，其不僅能直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖，還可增加血管的通透性，使血漿蛋白滲出，改變細(xì)胞外基質(zhì)成分，以利于血管形成[17]。bFGF作為一組活性多肽，具有廣泛的生物學(xué)作用，其能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，誘發(fā)血管再生，是強(qiáng)烈的血管生長因子[18]。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)，bFGF能趨化成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞向創(chuàng)面遷移，增強(qiáng)肉芽組織細(xì)胞的有絲分裂、增殖及分化，并促進(jìn)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，從而有利于創(chuàng)面愈合[19-20]。本研究PCR結(jié)果顯示，在第3、7、14天，觀察組創(chuàng)面組織VEGF-A和bFGF mRNA表達(dá)均顯著高于對照組，提示補(bǔ)氣生肌方促進(jìn)創(chuàng)面組織血管生成可能與上調(diào)VEGF-A和bFGF水平有關(guān)。

總之，補(bǔ)氣生肌方在治療糖尿病難愈性創(chuàng)面時(shí)，可增強(qiáng)VEGF-A和bFGF基因表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面組織血管生成，有利于難愈性創(chuàng)面的愈合和重建。

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MechanismofBuqiShengjiformulainimprovingtheangiogenesisandhealingofdiabeticrefractorywounds

CHEN Yu-jiaoa,BAI Xiao-sub,ZENG Li-hongc

(a.the Third Department of Internal Medicine,b.Department of Endocrinology,c.Department of Neurology,Longhua Area People′s Hospital of Shenzhen City,Shenzhen 518000,China)

ObjectiveTo observe the influence of Buqi Shengji formula on angiogenesis of diabetic refractory wounds and vascular endothelial growth factor.MethodsSD male rats (n=48) were given intraperitoneal injection of 1% STZ 35 mg/kg after being fed with high-fat and high-sugar diet,and skin was scratched to establish the diabetic wound model after the diabetic model was established.The model rats were randomly divided into 2 groups.Observation group (n=24) was given Buqi Shengji formula,while control group (n=24) was given vaseline.The microvessel count in granulation tissue was determined by immunofluorescence,and the expression of VEGF and bFGF were determined by PCR.ResultsThe wound healing rate in observation group was higher than that of control group on the 3rd,7th and 14th day (P<0.05).The immunofluorescence results showed that the number of CD-34 positive cells was 34.39%±3.46% in observation group and 12.42%±1.53% in control group respectively,and there was significant difference between the two groups (P<0.05).The expression of VEGF-A and bFGF mRNA in the wound tissue of observation group was higher than that of control group on the 3rd,7th and 14th day (P<0.05).ConclusionBuqi Shengji formula can up-regulate the expression of VEGF-A and bFGF gene in the treatment of diabetic refractory wounds,and promote the angiogenesis of wound tissue which is beneficial to the healing and reconstruction of refractory wounds.

Buqi Shengji formula;Diabetes;Wound;Blood vessels

2016-12-22

深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院a.內(nèi)三科，b.內(nèi)分泌科，c.神經(jīng)內(nèi)科，深圳 518000

10.14053/j.cnki.ppcr.201710006