賀 軍，孔德超，張秋生，孔令斌 ,李 麗

1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濟(jì)寧 272016； 2.濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院內(nèi)科； 3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院

阿司匹林與二甲雙胍對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株的聯(lián)合作用探討

賀 軍1，孔德超2，張秋生1，孔令斌1,李 麗3

1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 濟(jì)寧 272016； 2.濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院內(nèi)科； 3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院

目的觀察聯(lián)合阿司匹林(Aspirin,ASA)與二甲雙胍(Metformin,MET)對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株的抑制作用，并探討兩者之間的相互作用方式。方法采用MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測空白對(duì)照組、ASA組、MET組及ASA與MET共同作用組對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果單獨(dú)使用ASA、MET對(duì)結(jié)腸癌SW480抑制率及其凋亡率均高于空白對(duì)照組，且72 h時(shí)抑制率及其凋亡率均高于24 h者；在干預(yù)24 h、72 h時(shí)，ASA與MET共同作用組的抑制率和凋亡率均明顯高于單獨(dú)使用MET組或ASA組，Q值分別為1.19和1.23。結(jié)論ASA和MET單獨(dú)作用均對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞有一定的抑制作用，且隨著時(shí)間延長,抑制作用明顯加強(qiáng)；聯(lián)合使用MET和ASA對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用。

阿司匹林；二甲雙胍；SW480細(xì)胞株；聯(lián)合作用

結(jié)直腸癌是消化道常見腫瘤之一，一旦發(fā)現(xiàn)多屬晚期，缺乏有效的治療手段，目前已成為全球癌癥死亡的第四大病因和我國發(fā)病率居第三位的惡性腫瘤[1]，因此，開展有效的防治至關(guān)重要。阿司匹林(Aspirin, ASA)過去一直被應(yīng)用于解熱鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕及心腦血管疾病的預(yù)防和治療中，但于1988年Kune等[2]報(bào)道，ASA可降低結(jié)直腸癌發(fā)生率，因此，ASA與其他非甾體抗炎藥在腫瘤防治方面的作用引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。二甲雙胍(Metformin, MET)是雙胍類口服降糖藥，因其兼具有效性、安全性和經(jīng)濟(jì)性，從20世紀(jì)50年代研制成功后一直在臨床上得以廣泛使用。但近期的回顧性調(diào)查[3-4]發(fā)現(xiàn)，使用MET的T2MD患者患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)明顯低于使用其他降糖藥的患者，由此，MET作為抗腫瘤藥物的研究也成為研究熱點(diǎn)。但臨床上單獨(dú)使用ASA或MET預(yù)防腫瘤時(shí)多用量較大，不良反應(yīng)也較大，為了減少其不良反應(yīng)，本研究探討了聯(lián)合小劑量ASA和MET的抗結(jié)腸癌作用，為臨床防治結(jié)腸癌提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購自中科院上海細(xì)胞庫，低溫保存，實(shí)驗(yàn)前將結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480用25 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后置于超凈臺(tái)中，倒掉里面的培養(yǎng)基。用5 ml PBS沖洗2次，然后加入3 ml胰蛋白酶，消化5 min后，細(xì)胞成片脫落，用一次性無菌吸管吹打均勻后放入離心管中，再加入3 ml培養(yǎng)基(全培)，終止消化，然后放入水平離心機(jī)中800 r/min離心10 min，取出離心管，小心吸取上清液后丟棄，取胰蛋白酶對(duì)融合度達(dá)90%的細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，待細(xì)胞鋪滿約85%瓶壁后，小心吸取廢液丟棄，重復(fù)以上操作，最后取出離心管后可見底部成塊的細(xì)胞團(tuán)，棄掉上清液，加入3 ml全培后吹勻。將吹打均勻的懸液加入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，再加入適量的全培使總量約5 ml，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，隨機(jī)分為4組，A組(空白對(duì)照組)：對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)(包括相同量的DMSO及蒸餾水);B組(ASA組)：培養(yǎng)基中加入ASA 2 mmol/L;C組(MET組)：培養(yǎng)基中加入MET 5 mmol/L;D組(ASA與MET共同作用組)：培養(yǎng)基中分別加入與B、C組中相同濃度的ASA和MET。培養(yǎng)24 h和72 h后分別檢測4組細(xì)胞的抑制率和細(xì)胞凋亡率。

1.2MTT檢測4組細(xì)胞分別干預(yù)后繼續(xù)放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在24 h、72 h分別取出相應(yīng)96孔板，并在每孔中加入20 μl MTT，即MTT濃度為50 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，此時(shí)將MTT還原為甲臜(倒置顯微鏡下可看到孔內(nèi)的細(xì)胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體)，小心吸去上清，然后每孔加入200 μl二甲基亞砜，放置在搖床上低速震蕩10 min后，待紫紅色結(jié)晶完全溶解后放于酶聯(lián)免疫檢測儀上測其OD值。吸光度值：在酶聯(lián)免疫檢測儀測定樣品在490 nm光吸收值，以未加藥品僅加入溶劑的孔設(shè)置為對(duì)照孔，并按抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組-空孔)/(空白對(duì)照組-空孔)的公式[5],計(jì)算各種藥物及濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率。

1.3細(xì)胞凋亡率的檢測分別取干預(yù)24 h和72 h的4組SW480細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書步驟操作，流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測。激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長FL1(Em=525±20 nm)；FL2(Em=585±21 nm)，每個(gè)樣本采集細(xì)胞數(shù)為10 000個(gè)，用FlowJo軟件分析細(xì)胞不同狀態(tài)(主要是早凋、晚凋與死亡)的比例及數(shù)目。

1.4聯(lián)合作用的判斷標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合作用的判斷采用金正均公式計(jì)算Q值判斷，Q值=Ea+b/[Ea+(1-Ea)×Eb]，其中Ea+b為兩種藥物聯(lián)合后的抑制率，Ea及Eb分別為藥物a和b的抑制率。如Q值>1.15表示藥物具有協(xié)同作用，Q值<0.85表示藥物具有拮抗作用，Q值為0.85～1.15表示藥物具有相加作用。

2 結(jié)果

2.1ASA與MET聯(lián)合作用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的抑制作用及Q值在24 h及72 h，不同組別結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的抑制率及其Q值如表1所示，提示該濃度下的ASA和MET具有協(xié)同作用，且除空白對(duì)照組外，72 h的抑制率明顯大于24 h。ASA和MET共同作用24 hQ值為1.19，72 hQ值為1.23。

表1 不同時(shí)間ASA與MET單獨(dú)及聯(lián)合作用后的抑制率及Q值

注：與ASA+MET組比較，*P<0.05。

2.2ASA與MET聯(lián)合作用對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響根據(jù)使用GraphPad Prism軟件計(jì)算出的ASA及MET的IC50分別稍高于ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L，基于在研究藥物相互作用時(shí)多選擇稍低于IC50的濃度，本研究選用ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L研究其兩者對(duì)細(xì)胞凋亡的聯(lián)合作用。

如圖1所示，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞，左上象限代表裸核細(xì)胞，左下象限代表正常細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為早期凋亡率與晚期凋亡率的總和。ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L單獨(dú)干預(yù)SW480細(xì)胞72 h后的凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，兩藥聯(lián)合后的凋亡率明顯高于單藥組(P<0.05)。提示兩藥可以協(xié)同增加SW480細(xì)胞的凋亡。

圖1 ASA與MET對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響Fig 1 Effects of ASA and MET on apoptosis of colon cancer SW480 cell lines

3 討論

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，有較高的發(fā)病率及死亡率。近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，在我國的發(fā)病率與死亡率呈緩慢上升趨勢[1]，其中，相當(dāng)一部分患者在確診時(shí)已伴有其他臟器的轉(zhuǎn)移[6]，一旦出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中位生存期往往少于2年，總體5年生存期低于10%。而晚期結(jié)腸癌的傳統(tǒng)化療藥物如氟尿嘧啶等細(xì)胞毒性藥物，均具有較大的不良反應(yīng)，給患者帶來較大的痛苦。而且結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及到多因素、多基因、多個(gè)階段漸進(jìn)性積累的復(fù)雜過程。近年來臨床流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，ASA、MET等藥物可以預(yù)防或治療結(jié)腸癌及預(yù)防結(jié)腸腺瘤的發(fā)生；ASA不僅可以減少結(jié)腸癌、肺癌、食管癌、胃癌和卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)，還可以作為結(jié)腸癌和肺癌的化療藥物使用[7]。流行病學(xué)顯示，長期口服非甾體類藥物與對(duì)照組相比，死于結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)要降低40%～50%[8]，基于多項(xiàng)臨床證據(jù)，2016年美國預(yù)防服務(wù)工作組(USPSTF)推薦50～59歲的部分心血管高風(fēng)險(xiǎn)患者可以將ASA作為心血管疾病及結(jié)直腸癌的一級(jí)預(yù)防用藥(B級(jí)推薦)。另外，也有報(bào)道[9]指出，MET可以預(yù)防或治療結(jié)腸癌及預(yù)防結(jié)腸腺瘤的發(fā)生。考慮到ASA、MET單獨(dú)抗腫瘤使用劑量較大，因此帶來較多的不良反應(yīng)，影響了它的使用范圍，故本研究開展了ASA和MET抗腫瘤的聯(lián)合作用，以期探討小劑量ASA聯(lián)合MET在結(jié)腸癌預(yù)防中的防治效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，在2 mmol/L ASA和5 mmol/L MET共同作用時(shí)，兩者對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，并且72 h的抑制率明顯大于24 h。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ASA 2 mmol/L及MET 5 mmol/L單獨(dú)干預(yù)SW480細(xì)胞48 h后的凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組，兩藥聯(lián)合后的凋亡率明顯高于單藥組，目前有關(guān)聯(lián)合使用ASA和MET預(yù)防結(jié)直腸癌的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)。結(jié)果提示，聯(lián)合使用適當(dāng)濃度的ASA和MET有可能較單獨(dú)使用ASA預(yù)防結(jié)直腸的效果更好，且不良反應(yīng)小。

其抑制的機(jī)制目前還不明確，在結(jié)腸癌的發(fā)展過程中，MMP-9蛋白具有重要的作用。MMPs是一類與鋅結(jié)合的具有降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的內(nèi)肽酶家族，在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。MMP-9是其中重要的一員，其分泌明膠酶B，能夠降解基底膜的大部分成分，如明膠、膠原蛋白、纖連蛋白、彈力蛋白等，從而降解、破壞靠近腫瘤表面ECM和基底膜(BM)，使腫瘤沿缺失的BM向周圍組織浸潤，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時(shí)在腫瘤間質(zhì)血管生成中起重要作用。而MMP-9可以受NF-κB通路的調(diào)控。MET主要通過AMPK、NF-κB等通路發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。MET作為AMPK激活劑，可以通過AMPK-mTOR通路、降低胰島素水平、抑制腫瘤干細(xì)胞增殖及NF-κB通路等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[11]。Moiseeva 等[12]在人胚肺成纖維細(xì)胞的模型上研究MET抑制衰老的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，TCF4、NF-κB1(P50)、RelA是MET基因水平調(diào)控最明顯的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并且在進(jìn)一步的研究中證實(shí)，無論AMPK通路是否激活，MET都可以抑制NF-κB的活化。ASA能夠通過直接抑制IκΒα的磷酸化來抑制NF-κB活化[13]。提示無論ASA還是MET抑制腫瘤的機(jī)制可能均通過抑制NF-κB活化起作用。

雖然，聯(lián)合ASA和MET的抗腫瘤機(jī)制尚未完全明確，但綜合以上研究認(rèn)為，兩種藥物可能通過對(duì)NF-κB活化，進(jìn)而影響與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)的MMP-9蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用。應(yīng)進(jìn)一步研究其可能的機(jī)制，為聯(lián)合ASA和MET抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生提供理論支持，最終應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

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SynergisticeffectsofcombinationofAspirinandMetforminoncoloncancerSW480celllines

HE Jun1, KONG Dechao2, ZHANG Qiusheng1, KONG Lingbin1, LI Li3

1.Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Jining Medical University, Jining 272016; 2.Department of Internal Medicine, the Second People’s Hospital of Jining; 3.Jining Medical University, China

ObjectiveTo observe the inhibitory effects of combination of Aspirin (ASA) and Metformin (MET) on the colon cancer SW480 cell lines, and to discuss the interaction between them.MethodsProliferation and apoptosis of colon cancer SW480 cell lines in blank control group, ASA group, MET group and combination of ASA and MET group were detected by MTT method and flow cytometry.ResultsThe inhibition rate and apoptosis rate of colon cancer SW480 cell lines in ASA group or MET group were higher than those in the blank control group, and the inhibition rate and apoptosis rate at 72 hours were higher than those at 24 hours independently. The inhibition rate and apoptosis rate in combination of ASA and MET group were significantly higher than those in MET group or ASA group at 24 hours and 72 hours, respectively. TheQvalues were 1.19 and 1.23, respectively.ConclusionASA and MET have a certain inhibition effect on colon cancer SW480 cell lines, and the inhibition effect is significantly increased over time, and the combination of MET and ASA has a synergistic effect on SW480 cell lines.

Aspirin; Metformin; SW480 cell line; Synergistic effect

R735.3+5

A

1006-5709(2017)10-1162-03

2017-06-10

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新科研課題(JNYXYXSCX201510)

賀軍，副主任醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤防治。E-mail：hejun911@163.com

孔令斌，博士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：結(jié)直腸癌的防治。E-mail：klb3904@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.10.024