劉登群， 王鋒超， 王軍平， 史春夢(mèng)， 李 蓉， 冉新澤， 粟永萍

第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038

其他論著

供體骨髓細(xì)胞在放射損傷腸道中的遷移定植和促修復(fù)作用研究

劉登群， 王鋒超， 王軍平， 史春夢(mèng)， 李 蓉， 冉新澤， 粟永萍

第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038

目的研究供體骨髓細(xì)胞(donor bone marrow cells,dBMCs)在全身放射損傷小鼠腸道內(nèi)的遷移定植規(guī)律和對(duì)腸道放射損傷的促修復(fù)作用。方法將60只6～8周齡C57BL/6小鼠進(jìn)行10 Gy全身照射后隨機(jī)分為移植組和對(duì)照組。比較兩組小鼠的存活率，免疫組化分析dBMCs在骨髓和腸道內(nèi)的定植規(guī)律，免疫熒光雙染鑒定早期植入腸道內(nèi)的dBMCs表型。HE染色和Brdu免疫組化分析dBMCs對(duì)放射損傷腸道的促修復(fù)作用。結(jié)果實(shí)驗(yàn)后第14天，移植組小鼠的存活率為95%。dBMCs同時(shí)向受體骨髓和腸道遷移定植。移植早期dBMCs首先定植于腸道固有層底部并向上遷移，最終填充全部固有層。早期植入的骨髓細(xì)胞中含有Sca-1陽性造血干細(xì)胞。dBMCs可緩解放射所致腸黏膜固有層水腫，促進(jìn)腸道干細(xì)胞增殖并增加腸隱窩密度。移植早期dBMCs不形成腸上皮細(xì)胞，穩(wěn)定嵌合后可形成骨髓來源腸上皮細(xì)胞。結(jié)論dBMCs在移植后早期即向腸道遷移定植并促進(jìn)放射所致腸道損傷的修復(fù)重建過程。

放射損傷；腸道；骨髓移植；干細(xì)胞

腸道上皮是機(jī)體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和隔離腸道致病菌的重要屏障，同時(shí)腸上皮是機(jī)體內(nèi)更新最快的組織之一，腸上皮的快速更新有賴于腸道干細(xì)胞及其微環(huán)境細(xì)胞的共同作用[1-2]。腸道是電離輻射敏感臟器之一，大劑量電離輻射暴露可導(dǎo)致腸道干細(xì)胞和固有層微環(huán)境細(xì)胞同時(shí)受到損傷從而破壞腸上皮屏障[3]。目前骨髓移植是救治大劑量放射損傷患者的有效手段。以往國(guó)內(nèi)外都曾報(bào)道過供體骨髓細(xì)胞(donor bone marrow cells,dBMCs)能夠參與腸上皮更新[4-6]，但移植后早期骨髓細(xì)胞在腸道內(nèi)的遷移規(guī)律，特別是早期定植細(xì)胞的特性及其對(duì)腸道放射損傷修復(fù)的影響尚未完全闡明，因此,本文中我們對(duì)移植早期dBMCs在放射損傷腸道內(nèi)的遷移特點(diǎn)和促修復(fù)作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑正常C57BL/6小鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，所用動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，6～8周齡。DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，一次性70 μm孔徑細(xì)胞篩購(gòu)自BD公司。兔和小鼠來源GFP抗體購(gòu)自碧云天公司，大鼠抗CD45、Sca-1和小鼠抗Brdu抗體為Biolegend公司產(chǎn)品，兔抗Ki67抗體購(gòu)自Thermofisher公司，小鼠抗PCK抗體購(gòu)自武漢博士德公司。封閉用正常山羊血清和HRP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉公司，Alex Fluor 488和594熒光二抗購(gòu)自Molecular Probes公司。

1.2dBMCs分離與制備頸椎脫臼法處死EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠并浸入750 g/L酒精浸泡消毒3 min，無菌條件下分離其股骨和脛骨。用眼科剪和眼科鑷剔除肌肉剪開骨髓腔，使用1 ml 一次性注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基于冰浴中反復(fù)沖洗骨髓腔。用1 ml移液器反復(fù)吹打含骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)基以形成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過濾后1 500 r/min離心3 min并去除上清，加入紅細(xì)胞裂解液作用1 min，加入5倍體積培養(yǎng)基終止裂解，離心棄上清后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液體積使骨髓單個(gè)核細(xì)胞濃度達(dá)到5×107ml-1。制備好的單細(xì)胞懸液置于冰浴中備用。

1.3動(dòng)物照射及細(xì)胞移植60只正常C57BL/6小鼠作為骨髓移植受體在實(shí)驗(yàn)前1周開始飲用含320 g/L慶大霉素和280 g/L紅霉素的滅菌水進(jìn)行腸道消毒。實(shí)驗(yàn)時(shí)使用第三軍醫(yī)大學(xué)輻照研究中心60Co放射源對(duì)小鼠進(jìn)行γ射線全身照射，照射過程中使用PTW UNIDOS(德國(guó))監(jiān)測(cè)照射劑量率和照射劑量，總照射劑量為10 Gy。照射后小鼠隨機(jī)分組，30只作為對(duì)照組，30只作為移植組。移植組小鼠經(jīng)尾靜脈移植0.2 ml含EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞懸液，所接受的骨髓單個(gè)核細(xì)胞總量為1×107，對(duì)照組小鼠經(jīng)尾靜脈注射同等體積的空培養(yǎng)基。

1.4動(dòng)物取材及組織染色分別在移植后第1天、第3天、第5天、第7天、第90天取材移植組和對(duì)照組小鼠的股骨和小腸組織標(biāo)本，取材前90 min腹腔注射Brdu，使用40 g/L中性甲醛固定過夜后進(jìn)行常規(guī)病理包埋并切片。4 μm石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后分別進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色切片使用0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行熱修復(fù) 20 min，自然冷卻后使用PBS沖洗5 min，滴加30 g/L過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉30 min，加入兔抗GFP抗體(1∶200稀釋)或小鼠抗Brdu抗體(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜，后續(xù)染色按照試劑盒操作說明進(jìn)行。免疫熒光雙染時(shí)，使用對(duì)應(yīng)的GFP抗體和相應(yīng)一抗共同孵育過夜，充分漂洗后加入相應(yīng)熒光二抗并復(fù)染DAPI封片。使用Olympus BX51或LCS SP5共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集，使用Image J進(jìn)行圖像分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1移植骨髓細(xì)胞可促進(jìn)10Gy全身放射損傷小鼠存活全部小鼠在受到全身照射后均出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、食欲下降及脫毛等急性放射損傷表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)后第3～5天開始出現(xiàn)腹瀉、血便等腸道放射損傷癥狀，體質(zhì)量較照射前明顯下降。對(duì)照組小鼠整體損傷不斷加重，移植組小鼠自第5天起逐漸好轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)后第14天，對(duì)照組小鼠存活率僅為10%，移植組小鼠存活率為95%。

2.2dBMCs在重建造血的同時(shí)即開始參與腸道重建成年小鼠骨髓組織對(duì)γ射線損傷高度敏感，10 Gy照射后第3天可見對(duì)照組小鼠骨髓腔有核細(xì)胞較正常對(duì)照顯著減少，骨髓腔嚴(yán)重空虛(見圖1E～1F)。移植組小鼠骨髓腔內(nèi)可見輸注的EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠dBMCs在實(shí)驗(yàn)后第1～7天內(nèi)數(shù)量逐漸增加(見圖1A～1D)，提示dBMCs促進(jìn)受照小鼠骨髓造血功能重建。成年小鼠腸道同樣是電離輻射的敏感臟器。實(shí)驗(yàn)中GFP陽性dBMCs自移植后第3天即進(jìn)入移植受體小鼠的腸道固有層，并逐漸向上遷移進(jìn)而填充整個(gè)固有層，最終腸黏膜固有層細(xì)胞幾乎全部被GFP陽性dBMCs替換(見圖2)。全身放射損傷后dBMCs同時(shí)參與骨髓造血功能重建和腸道放射損傷修復(fù)，兩者不存在先后順序，而是同步進(jìn)行。

2.3骨髓造血干細(xì)胞可在移植后早期植入腸道固有層移植后第3天腸道固有層內(nèi)存在GFP+/CD45-細(xì)胞(見圖3,GFP與CD45疊加圖中箭頭所指)，提示早期植入細(xì)胞并非全部為成熟血細(xì)胞。進(jìn)一步染色發(fā)現(xiàn)，早期植入細(xì)胞中存在少量GFP+/Sca-1+細(xì)胞(見圖3，GFP與Sca-1疊加圖中箭頭所指)和GFP+/Ki67+增殖性細(xì)胞(見圖3，GFP與Ki67疊加圖中箭頭所指)。由于Sca-1是小鼠造血干細(xì)胞標(biāo)志之一，因此本部分結(jié)果證實(shí),移植后早期骨髓造血干細(xì)胞可定植于腸道固有層，并參與腸道放射損傷修復(fù)。

圖1GFP陽性dBMCs在受體骨髓中的動(dòng)態(tài)分布A～D: 移植后第1天、第3天、第5天、第7天骨髓中GFP陽性細(xì)胞分布；E: 正常小鼠骨髓HE染色；F: 照射后第3天骨髓HE染色

Fig1DynamicdistributionofGFP+dBMCsinrecipientbonemarrowA-D: GFP+cells in bone marrow on the 1st, 3rd, 5th, 7th day after transplantation; E: bone marrow HE image of normal mice; F: bone marrow HE staining on the 3rd day after radiation

圖2GFP陽性dBMCs在受體腸道內(nèi)的遷移及動(dòng)態(tài)分布A～D: 移植后第1天、第3天、第7天、第30天腸道中GFP陽性細(xì)胞分布；E: 正常EGFP小鼠腸道GFP免疫組化染色；F: 正常C57BL/6小鼠腸道GFP免疫組化染色

Fig2MigrationanddynamicdistributionofGFP+dBMCsinsmallintestineofrecipientmiceA-D: GFP+dBMCs in small intestine on the 1st, 3rd, 7th, 30th day after transplantation; E: GFD staining on normal intestine of EGFP mice; F: GFP staining on small intestine of normal C57BL/6 mice

2.4早期植入的dBMCs促進(jìn)腸道放射損傷修復(fù)HE染色顯示，移植組與對(duì)照組小鼠第3天移植組小鼠腸黏膜絨毛隱窩結(jié)構(gòu)單元更加完整，黏膜層更厚，固有層水腫較對(duì)照組輕(見圖4)，進(jìn)一步定量分析結(jié)果證實(shí),實(shí)驗(yàn)后第3天移植組小腸隱窩密度顯著高于對(duì)照組[(18.5±1.3)/mmvs(11.9±2.9)/mm,P=0.0241]。Brdu摻入可用于標(biāo)記處于S期的增殖細(xì)胞，免疫組化染色可見移植組小腸隱窩底部Brdu陽性腸道干細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多(見圖5)。本部分結(jié)果證實(shí)早期植入的dBMCs可顯著促進(jìn)放射損傷腸道的再生修復(fù)過程。

2.5腸道內(nèi)定植的dBMCs可分化形成腸上皮細(xì)胞移植后早期dBMCs主要定植于腸道固有層內(nèi)，未見到其直接形成腸隱窩或腸絨毛內(nèi)的上皮細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)后3個(gè)月可在移植組小鼠腸上皮當(dāng)中檢測(cè)到GFP和廣譜細(xì)胞角蛋白(PCK)雙陽性腸上皮細(xì)胞(見圖6)。

3 討論

腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性是腸道消化吸收功能和黏膜屏障功能的重要組織學(xué)基礎(chǔ)，腸道上皮細(xì)胞3～5 d就會(huì)全部更新1次。正是由于Lgr5+腸道干細(xì)胞和瞬時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞始終處于快速增殖和分裂狀態(tài)，所以腸道對(duì)電離輻射等致傷因素高度敏感。大劑量電離輻射暴露可抑制腸上皮干細(xì)胞增殖并加速成熟腸上皮細(xì)胞凋亡,造成腸黏膜機(jī)械屏障缺失，同時(shí)射線可抑制腸道免疫細(xì)胞功能。上述損傷效應(yīng)可造成大量體液經(jīng)腸道丟失，同時(shí)引起腸道菌群移位，加重放射損傷后內(nèi)源性感染的發(fā)生。因此，腸道結(jié)構(gòu)和功能重建對(duì)于嚴(yán)重放射損傷患者的救治具有重要意義。

圖3 移植后第3天定植于腸道內(nèi)的GFP陽性dBMCs表型分析

圖4實(shí)驗(yàn)后第3天移植組與對(duì)照組小鼠小腸HE染色A～B: 移植組; C～D: 對(duì)照組

Fig4HEstainingimagesofsmallintestinebetweentransplantationgroupandcontrolgrouponthe3rddayafterexperimentA-B: BMT group; C-D: control group

注：C和D分別為A、B紅色區(qū)域的放大圖像，C中藍(lán)色箭頭所示為腸隱窩底部Brdu陽性細(xì)胞。

圖5實(shí)驗(yàn)后第3天移植組與對(duì)照組小腸Brdu免疫組化染色A: 移植組; B: 對(duì)照組

Fig5SmallintestineBrduIHCimagesoftransplantationgroupandcontrolgrouponthe3rddayafterexperimentA: BMT group; B: control group

圖6 dBMCs可分化為腸上皮細(xì)胞 A: GFP, Alex Fluor 488; B: PCK, Alex Fluor 594; C: merge

腸道內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、漿細(xì)胞)主要來源于骨髓細(xì)胞[7-8]，這些間質(zhì)細(xì)胞共同組成了維持腸上皮干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的微環(huán)境。Okamoto等[9]最早報(bào)道了骨髓移植后供體細(xì)胞對(duì)腸上皮的修復(fù)重建作用。以往研究dBMCs在腸上皮穩(wěn)態(tài)維持中的作用時(shí)主要觀察點(diǎn)都在移植穩(wěn)定之后，而移植后早期dBMCs在腸道內(nèi)的遷移特點(diǎn)未見相關(guān)報(bào)道[4,6,9]。明確移植后早期供體細(xì)胞在腸道內(nèi)的遷移和分布特點(diǎn)是深入認(rèn)識(shí)其對(duì)腸道放射損傷修復(fù)作用的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn),對(duì)電離輻射高度敏感的骨髓和腸道中，dBMCs在輸注到受體外周血之后可同時(shí)向骨髓和腸道內(nèi)定植，從而加速造血重建和促進(jìn)腸黏膜屏障修復(fù)。植入的dBMCs有助于腸道屏障功能的快速恢復(fù)，從而減少體液丟失和內(nèi)源性感染的發(fā)生，極大提高了受照小鼠的存活率。

本研究中我們注意到,dBMCs進(jìn)入腸道固有層后首先定植于固有層底部環(huán)繞腸隱窩周圍。dBMCs當(dāng)中所包含的大量成熟細(xì)胞可直接發(fā)揮其分泌作用，這有利于重建正常的腸道干細(xì)胞微環(huán)境，例如dBMCs中的巨噬細(xì)胞可通過分泌Wnt5a、Wnt5b、Wnt6和Wnt9a為L(zhǎng)gr5+腸道干細(xì)胞提供微環(huán)境信號(hào)[10]。以往多個(gè)研究報(bào)道了移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)缺血再灌注和放射所致腸道損傷的再生修復(fù)過程[11-13]。本研究中我們發(fā)現(xiàn),dBMCs中所包含的Sca-1+造血干細(xì)胞和Ki67+的增殖性細(xì)胞在移植后早期可遷移到受照腸道內(nèi)，由于造血干細(xì)胞可分化形成多種腸道內(nèi)多種間質(zhì)細(xì)胞，因此,我們認(rèn)為植入的造血干細(xì)胞有利于促進(jìn)腸道放射損傷修復(fù)，而增殖性dBMCs可能通過快速增加正常間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量促進(jìn)修復(fù)過程。

值得注意的是，雖然我們和其他研究都報(bào)道過dBMCs可通過形成腸上皮細(xì)胞參與腸上皮再生和穩(wěn)態(tài)維持[6,14]，但本研究中我們?cè)谝浦埠笤缙诓⑽从^察到直接定植于腸隱窩或腸絨毛內(nèi)的GFP陽性dBMCs，提示dBMCs在早期主要通過重建腸上皮干細(xì)胞微環(huán)境來發(fā)揮其促修復(fù)作用。

綜上所述，本文的研究結(jié)果豐富了我們對(duì)dBMCs參與放射損傷腸道再生具體過程的認(rèn)識(shí)，為大劑量放射損傷患者的臨床救治進(jìn)一步提供了研究基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Engraftmentofdonorbonemarrowcellsandtheirrolesinregenerationofradiationdamagedintestine

LIU Dengqun, WANG Fengchao, WANG Junping, SHI Chunmeng, LI Rong, RAN Xinze, SU Yongping

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Institute of Combined Injury, College of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

ObjectiveTo explore the engraftment and characteristics of donor bone marrow cells (dBMCs) and their contribution to epithelial regeneration in radiation damaged intestine.MethodsSixty C57BL/6 mice aged 6-8 weeks were exposed to 10 Gy total body irradiation (TBI) and randomly divided into bone marrow transplantation (BMT) group and control group. Survival ratios in two groups were compared. Engraftment of dBMCs in bone marrow and intestine was demonstrated by green fluorescent protein (GFP) immunohistochemistry (IHC). Immunofluorescent costaining of GFP with CD45, Sca-1 and Ki67 was employed to study the phenotypes of engrafted dBMCs in intestine. Their contribution to intestinal regeneration was determined by HE staining and Brdu analysis.ResultsSurvival ratio in BMT group was 95% on the 14th day. dBMCs migrated into bone marrow and intestine simultaneously. In the intestine, dBMCs firstly appeared at the bottom of lamina propria, then migrated upwards, and finally replaced all the intestinal mesenchymal cells. Hematopoietic stem cells (HSCs) appeared in intestine during the early periods. dBMCs alleviated lamina propria edema, promoted proliferation of intestinal stem cells (ISCs), and increased density of intestinal crypts. dBMCs could form epithelial cells in stable chimeric intestine, but not in the early stage.ConclusiondBMCs implant into intestine in the early time after transplantation, and they promote the regeneration process of radiation damaged intestine.

Radiation injury; Intestine; Bone marrow transplantation; Stem cells

R574

A

1006-5709(2017)10-1154-05

2017-02-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(81371688、81673089)；重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2013jcyjA10038)；創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究課題(SKLZZ201019)

劉登群，博士，副教授，研究方向：成體干細(xì)胞與胃腸道創(chuàng)傷修復(fù)。E-mail: dengqunliu@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.10.022