劉佳琳，徐蘭蘭，路珍，吉成龍，李斐，王清，趙建民，吳惠豐

（1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過(guò)程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)264003；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

基于核磁共振的褐牙鲆幼魚組織代謝組學(xué)分析

劉佳琳1，2，徐蘭蘭1，2，路珍1，2，吉成龍1，李斐1，王清1，趙建民1，吳惠豐1

（1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所中國(guó)科學(xué)院海岸帶環(huán)境過(guò)程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺(tái)264003；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)是系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要組成部分，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于海洋生物學(xué)中。由于海洋環(huán)境具有高鹽度的特點(diǎn)，海洋生物與其他生物相比，體內(nèi)代謝物濃度差異極大。通常來(lái)說(shuō)，海洋生物為應(yīng)對(duì)高鹽度的海水環(huán)境，其體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物，例如?；撬?、甜菜堿、氮氧三甲胺等的濃度往往是其他代謝物的數(shù)百倍，造成體內(nèi)代謝物所占代謝組權(quán)重的極不均衡。因此，選擇合適的代謝組數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，是準(zhǔn)確分析海洋生物代謝組差異的關(guān)鍵。本研究以褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚為研究對(duì)象，經(jīng)低鹽脅迫48小時(shí)后，利用一維核磁共振氫譜，分析了褐牙鲆幼魚全組織在低鹽脅迫后的代謝組變化，比較了三種不同預(yù)處理方法（單位方差換算、帕萊托換算與對(duì)數(shù)化-中心化處理）對(duì)于低鹽脅迫誘導(dǎo)的代謝響應(yīng)分析的差異。結(jié)果表明，褐牙鲆幼魚體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物-氮氧三甲胺濃度是其他代謝物濃度的200倍以上，而低鹽脅迫可誘導(dǎo)褐牙鲆幼魚體內(nèi)顯著的代謝響應(yīng)。其中，對(duì)數(shù)化-中心化處理的代謝組數(shù)據(jù)，經(jīng)正交偏最小二乘判別分析后，能發(fā)現(xiàn)8個(gè)低鹽脅迫誘導(dǎo)的差異代謝物（不含1個(gè)未知代謝物），與代謝物定量結(jié)果一致，多于其他兩種預(yù)處理方法（單位方差換算、帕萊托換算）的代謝組分析結(jié)果，適合用于褐牙鲆代謝組學(xué)分析。以上研究結(jié)果為褐牙鲆代謝組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確分析提供了方法學(xué)依據(jù)。

褐牙鲆；代謝組學(xué)；核磁共振；數(shù)據(jù)預(yù)處理

褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）廣泛分布于東北亞近海底層水域，因其肉質(zhì)鮮美，被廣泛消費(fèi)，是東北亞重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，在我國(guó)黃、渤海產(chǎn)量較多。褐牙鲆是一種廣鹽性魚類，對(duì)鹽度的變化有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能夠在鹽度較低的沿岸及河口地區(qū)生活（王麗華等，2008）。有研究表明，在鹽度16.0～30.5譯范圍內(nèi)褐牙鲆的仔稚魚生長(zhǎng)率無(wú)顯著差異，較低鹽度的海水中仔稚魚存活率較高（王涵生，1997）。在幼魚階段，褐牙鲆直接移入鹽度8譯的海水中48 h，幼魚存活率為100%，而在鹽度24譯的海水中生長(zhǎng)率和飼料轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高（姜志強(qiáng)等，2002）。目前，對(duì)褐牙鲆的研究主要集中在生理、生化水平以及褐牙鲆對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)及其機(jī)制上，尚缺乏褐牙鲆在代謝水平的海洋生物學(xué)研究。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，是基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)之后的又一高通量組學(xué)技術(shù)。代謝組學(xué)是研究一個(gè)細(xì)胞、組織、器官或個(gè)體中的所有小分子代謝物（分子質(zhì)量通常小于1 000），及其對(duì)病理（疾病等）、生理（環(huán)境因子等）響應(yīng)的一門組學(xué)技術(shù)（Viant et al，2003）。因此，代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)于解釋海洋生物對(duì)環(huán)境因子響應(yīng)及其機(jī)制具有良好的適用性，而且解決了以往海洋生物學(xué)研究中僅依賴單個(gè)或數(shù)個(gè)生物學(xué)指標(biāo)的不足。代謝組學(xué)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支。目前應(yīng)用比較廣泛的代謝組學(xué)的分析技術(shù)包括核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，GC-MS和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，LC-MS）（Lindon et al，1999）。其中，核磁共振分析技術(shù)雖然檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，但具有不損傷檢測(cè)樣品且重復(fù)性良好的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)中（Lindon et al，1999）。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)模式識(shí)別分析的方法主要包括無(wú)監(jiān)督的主成分分析法（PCA）與有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）等。由于代謝組數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的龐大與復(fù)雜性，其預(yù)處理方法的選擇是準(zhǔn)確解釋代謝組數(shù)據(jù)生物學(xué)意義的關(guān)鍵。

由于海洋環(huán)境的高鹽度特點(diǎn)，海洋生物與其他生物相比，體內(nèi)代謝物濃度差異極大。一般說(shuō)來(lái)，海洋生物為應(yīng)對(duì)高鹽度的海水環(huán)境，往往會(huì)在體內(nèi)儲(chǔ)存高濃度的滲透調(diào)節(jié)物，例如牛磺酸、甜菜堿、甘氨酸等有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物（Zhang et al，2011）。這些滲透調(diào)節(jié)物的濃度通常是其他代謝物的數(shù)十倍到數(shù)百倍，造成各種代謝物所占代謝組權(quán)重的極度不均衡。這種代謝物之間的濃度差異，將直接導(dǎo)致海洋生物代謝組數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)與普通生物的巨大區(qū)別（Bundy et al，2004）。因此，選擇合適的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，對(duì)于準(zhǔn)確分析海洋生物代謝組差異極其重要。目前，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理方法主要包括單位方差換算、帕萊托換算與對(duì)數(shù)化-中心化處理等。這幾種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法均可通過(guò)數(shù)據(jù)換算，達(dá)到改變代謝物濃度權(quán)重的目的，但各自算法的換算邏輯與側(cè)重點(diǎn)存在明顯差異（李晶等，2006）。

本文針對(duì)褐牙鲆（P.olivaceus）幼魚的代謝組，利用一維核磁共振氫譜，分析褐牙鲆幼魚全組織在低鹽脅迫48 h后的代謝組響應(yīng)情況，比較三種不同預(yù)處理方法（單位方差換算、帕萊托換算與對(duì)數(shù)化-中心化處理）對(duì)于低鹽脅迫誘導(dǎo)的代謝響應(yīng)分析的差異，從而為褐牙鲆代謝組的數(shù)據(jù)分析提供一種可靠的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，也為在代謝水平闡明褐牙鲆幼魚對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

褐牙鲆幼魚（約0.6 g）購(gòu)于煙臺(tái)天源水產(chǎn)有限公司，實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7 d后進(jìn)行急性低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，包括正常鹽度對(duì)照組（鹽度為31.3譯，12個(gè)體）與50%正常鹽度（鹽度為15.6譯，12個(gè)體）的低鹽脅迫組。其中，低鹽脅迫組褐牙鲆幼魚個(gè)體直接放入鹽度為15.6譯的配制海水中進(jìn)行低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。低鹽脅迫48 h后，采集正常鹽度對(duì)照組與低鹽脅迫組所有褐牙鲆幼魚個(gè)體，于液氮中速凍后，保存于-80益超低溫冰箱備用。

褐牙鲆幼魚馴養(yǎng)與低鹽脅迫實(shí)驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖于曝氣過(guò)濾海水中（25°C），每日光照時(shí)間為12 h，并定時(shí)投喂餌料，2 h后換水，每24 h完全換水一次。

1.2 代謝組提取與核磁共振一維氫譜測(cè)試

將褐牙鲆幼魚樣品從超低溫冰箱中取出，于液氮中研磨成均勻粉末，并準(zhǔn)確稱取約100 mg褐牙鲆幼魚全組織，加入4.85 mL/g的甲醇/水（4/0.85，v/v）溶劑后勻漿（Wu et al，2008）。勻漿液轉(zhuǎn)移至玻璃瓶，先后加入2 mL/g氯仿和2.25 mL/g水，充分渦旋振蕩后于冰上靜置10 min。隨后于4°C，3 000 g將樣品離心10 min，小心取出上層極性相，真空抽干后以備NMR檢測(cè)。

真空抽干的褐牙鲆樣品加入600μL 100 mM的重水磷酸鹽緩沖液（pH=7.0，含0.5 mM三甲基甲硅烷基丙酸鈉（TSP）作為內(nèi)標(biāo)），渦旋振蕩充分溶解，于4°C，3 000 g離心5 min，取550μL上清轉(zhuǎn)移到5 mm核磁檢測(cè)管中，在Bruker AV 500核磁共振波譜儀上進(jìn)行核磁共振檢測(cè)。具體檢測(cè)參數(shù)如下：一維氫譜觀察頻率：500.18 MHz，測(cè)試溫度：298 K，譜寬：6 009.6 Hz，混合時(shí)間：0.1 s，弛豫延遲時(shí)間：0.3 s，在弛豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和方式（NOEPR）壓制水峰，累加次數(shù)：128次，每個(gè)樣本核磁掃描均收集到16 384個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅里葉變換。獲得的1H NMR譜圖載入TopSpin軟件（version 2.1，Bruker BioSpin，Germany），對(duì)所有的1H NMR譜圖進(jìn)行相位校正、基線調(diào)整，并以TSP內(nèi)標(biāo)為化學(xué)位移參考峰（TSP=0.0 ppm）。通過(guò)Chenomx Suite軟件（Evaluation Version，Chenomx Inc.，Canada）進(jìn)行代謝物的鑒定與定量。

1.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理與多元統(tǒng)計(jì)分析

利用基于MATLAB平臺(tái)的ProMetab軟件（V7.0，MathsWorks，USA），將啄0.2～10.0內(nèi)的譜圖以0.005譜寬進(jìn)行分段并積分，去除水峰所在的化學(xué)位移區(qū)域（4.70～5.20）。在使用單位方差換算（Unit Variance scaling，UV）與帕萊托換算（Pareto scaling，Par）方法作為數(shù)據(jù)預(yù)處理方法的數(shù)據(jù)分析中，將所有核磁共振譜圖數(shù)據(jù)歸一化剩余總的譜峰面積。而在使用對(duì)數(shù)化-中心化處理方法作為數(shù)據(jù)預(yù)處理方法（Generalized log transformation-mean centering，Glog-Ctr）的數(shù)據(jù)分析中，在多元統(tǒng)計(jì)分析之前，先將所有歸一化的核磁譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)化轉(zhuǎn)換處理（常變量轉(zhuǎn)換因子姿=2×10-7）（Purohit et al，2004）。隨后將上述兩組代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入MATLAB的PLS_toolbox進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）及SIMCA-P軟件（V11.0，Umetrics，Sweden）進(jìn)行最小二乘法判別分析（Partial Least Square Discriminant Analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Partial Least Square Discriminant Analysis，OPLSDA）。OPLS-DA得分圖和相關(guān)系數(shù)載荷圖分別反映分類情況和NMR波譜變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)。載荷圖右側(cè)色彩柱表示代謝物在組間的差異顯著性。其中，顏色偏向紅色代表顯著，偏向藍(lán)色代表不顯著（Feng et al，2013）。具體判斷低鹽脅迫組代謝物是否顯著變化是根據(jù)皮爾森積差相關(guān)系數(shù)顯著性差異檢測(cè)來(lái)確定。對(duì)于本研究中每組12個(gè)生物樣本而言，在p值小于0.05時(shí)，相關(guān)系數(shù)大于0.532即表明代謝物具有顯著變化。

1.4 代謝物濃度統(tǒng)計(jì)分析

采用微軟辦公軟件Microsoft Office Standard 2010中Excel軟件對(duì)代謝物濃度進(jìn)行單尾t檢驗(yàn)，p值小于0.05視為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 褐牙鲆幼魚組織中代謝組分析

圖1A是正常鹽度對(duì)照組褐牙鲆幼魚組織提取物的一維核磁共振氫譜的原始譜圖，而圖1B是經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)化處理后對(duì)應(yīng)的一維核磁共振氫譜，可以看到其中的低濃度代謝物如異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、ATP等的“譜峰”強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，其在代謝組中的權(quán)重得到提高。由圖1A與1B中氫譜所示，在正常鹽度（31.3譯）對(duì)照組褐牙鲆幼魚組織提取物中，共鑒定出29個(gè)代謝物以及另外2個(gè)未知代謝物，主要包括氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、谷氨酸等）、有機(jī)酸（乳酸、乙酸與琥珀酸）、能量代謝產(chǎn)物（磷酸肌酸、葡萄糖、AMP與ATP）及滲透調(diào)節(jié)物（?；撬崤c氮氧三甲胺）等。其中滲透調(diào)節(jié)物氮氧三甲胺是核磁共振氫譜中最主要代謝物。由此可見，褐牙鲆主要利用滲透調(diào)節(jié)物中氮氧三甲胺調(diào)節(jié)機(jī)體與環(huán)境的滲透平衡。這與海洋雙殼貝類主要利用甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的機(jī)制存在顯著差異（Wu et al，2011；Ji et al，2013）。

圖1 正常鹽度（31.1）對(duì)照組褐牙鲆幼魚組織提取物原始（A）與對(duì)數(shù)化處理（B）的一維核磁共振譜圖

2.2 低鹽脅迫后褐牙鲆幼魚組織中代謝響應(yīng)

褐牙鲆是一種廣鹽生存的魚類。在鹽度16.0～30.5譯范圍內(nèi)，褐牙鲆的仔稚魚生長(zhǎng)并無(wú)顯著差異，這表明此鹽度范圍適宜褐牙鲆存活、生長(zhǎng)（王涵生，1997）。在本研究中，選擇了正常海水鹽度的50%，即鹽度15.6譯作為褐牙鲆幼魚的暴露鹽度。因暴露鹽度略低于16.0譯，可能對(duì)褐牙鲆幼魚造成一定程度的低鹽脅迫，正好用于褐牙鲆幼魚對(duì)低鹽脅迫的代謝響應(yīng)研究。在鹽度15.6譯暴露48 h后，對(duì)正常鹽度組與低鹽暴露組褐牙鲆幼魚中代謝物進(jìn)行了絕對(duì)定量分析及單尾t檢驗(yàn)。表1顯示了低鹽暴露后，褐牙鲆幼魚組織中響應(yīng)的具有顯著性差異的代謝物（p<0.05），包括顯著上調(diào)的乳酸、精氨酸、谷氨酸、二甲胺、甘氨酸與ATP，以及顯著下調(diào)的?；撬崤c磷酸膽堿。其中，甘氨酸顯著性差異為0.065，接近0.05，視為具有顯著性差異。

表1 褐牙鲆幼魚代謝物濃度及不同方法數(shù)據(jù)預(yù)處理與OPLS-DA分析后差異代謝物的顯著性參數(shù)

2.3 不同代謝組數(shù)據(jù)預(yù)處理方法結(jié)果比較

如圖2所示，利用無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法PCA對(duì)常規(guī)歸一化以及對(duì)數(shù)化處理的核磁共振數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了分析，并對(duì)主成分得分分別進(jìn)行了單尾t檢驗(yàn)。結(jié)果表明，對(duì)于常規(guī)歸一化核磁共振代謝組數(shù)據(jù)，在主成分2軸上，正常鹽度組與低鹽脅迫組的褐牙鲆樣本存在顯著差異（p<0.01）。而對(duì)于對(duì)數(shù)化處理的核磁共振代謝組數(shù)據(jù)，則在主成分1軸上，兩個(gè)褐牙鲆樣本組存在顯著差異（p<0.05）。這表明低鹽脅迫確實(shí)導(dǎo)致了褐牙鲆幼魚體內(nèi)代謝組響應(yīng)。

圖2 常規(guī)歸一化（A）與對(duì)數(shù)化（B）處理的核磁共振數(shù)據(jù)主成分得分圖

由于無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法在進(jìn)行樣本分析中并不區(qū)分樣本類別，算法相對(duì)簡(jiǎn)單，僅通過(guò)數(shù)據(jù)降維，將數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)中的相似性與差異投影至二維或者三維空間，便于肉眼觀察樣本分類情況，因此往往具有一定的局限性，而挖掘的差異代謝物有可能存在假陽(yáng)性。因此有必要利用有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。其中，OPLSDA法是利用數(shù)學(xué)上的正交理論，將原始變量X信息中同應(yīng)變量Y不相關(guān)的部分取出，從而獲得更理想的分類效果的一種有監(jiān)督多元統(tǒng)計(jì)分析方法。在生物化學(xué)中，代謝組中的低濃度代謝物并非意味著其生理功能微弱。反之，高濃度代謝物也并非意味著其擁有最重要的生理功能。因此有必要通過(guò)代謝組數(shù)據(jù)的預(yù)處理，提高低濃度代謝物的權(quán)重，從而更好地進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及生物學(xué)解釋。由于海洋生物樣本代謝物濃度差異尤其顯著，因此必須選擇合適的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法對(duì)海洋生物樣本的代謝物濃度權(quán)重進(jìn)行平衡，以達(dá)到最好的分類效果。本研究選擇了以下3種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，包括單位方差換算（UV）、帕萊托換算（Par）與對(duì)數(shù)化-中心化處理（Glog-Ctr）三種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法。這3種方法均可在一定程度上減少代謝物濃度差異導(dǎo)致的權(quán)重差異，但由于算法的不同，對(duì)于不同類型的生物樣本預(yù)處理效果也存在差異。以下對(duì)這3種預(yù)處理方法換算后的OPLS-DA分析結(jié)果逐一討論，以確定最合適的褐牙鲆代謝組數(shù)據(jù)預(yù)處理方法。

2.3.1 單位方差換算法（UV scaling，UV）

單位方差換算法（UV scaling）與帕萊托換算法（Pareto scaling）是屬于一類把代謝組數(shù)據(jù)中每個(gè)變量乘以不同的縮放因子的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，主要目的是通過(guò)對(duì)每個(gè)變量按不同比例進(jìn)行縮放來(lái)調(diào)整不同濃度代謝物之間的差異，從而調(diào)整各代謝物濃度所占整個(gè)代謝組的權(quán)重。其中，UV法是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理中使用較多的一種方法，其算法是將所有代謝組變量的標(biāo)準(zhǔn)差定為1（Smilde et al，2005）。

如圖3A所示，利用UV法預(yù)處理褐牙鲆代謝組數(shù)據(jù)后，OPLS-DA結(jié)果顯示，正常鹽度對(duì)照組與低鹽脅迫組的褐牙鲆幼魚樣本獲得了可靠的分類。從載荷圖（圖3B）上可以觀察到共有6個(gè)顯著性差異代謝物（含1個(gè)未知代謝物），包括谷氨酸、二甲胺、磷酸膽堿、?；撬崤cATP，與通過(guò)絕對(duì)定量方法發(fā)現(xiàn)的8個(gè)顯著性差異代謝物相比，遺漏了3個(gè)代謝物，包括乳酸、精氨酸與甘氨酸（差異代謝物匯總至表1）。這表明UV法預(yù)處理的褐牙鲆幼魚組織代謝組數(shù)據(jù)經(jīng)OPLS-DA分析后，并未能挖掘所有低鹽脅迫誘導(dǎo)的差異代謝物，存在較明顯的缺陷，表明UV法并非十分適用于褐牙鲆幼魚代謝組數(shù)據(jù)的預(yù)處理。

2.3.2 帕萊托換算法（Pareto scaling，Par）

帕萊托換算法（Par）是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理中另一種使用較多的方法，在算法上與UV法的最大區(qū)別是它將所有的代謝組變量的標(biāo)準(zhǔn)差方根設(shè)為1。因此，Par法實(shí)際上是在UV法的基礎(chǔ)上，允許原始數(shù)據(jù)存在數(shù)量級(jí)上的差異。

圖3 三種方法數(shù)據(jù)預(yù)處理后褐牙鲆樣本代謝組OPLS-DA的得分圖（A、C、E）與載荷圖（B、D、F）

如圖3C所示，利用Par法預(yù)處理的褐牙鲆代謝組數(shù)據(jù)經(jīng)OPLS-DA分析后，正常鹽度對(duì)照組與低鹽脅迫組的褐牙鲆幼魚樣本同樣獲得了可靠的分類，并且解釋度（R2X=35.2%）與可靠度（Q2=0.538）較UV法均有提升。從載荷圖（圖3D）上可以觀察到共有7個(gè)顯著性差異代謝物（含1個(gè)未知代謝物），包括谷氨酸、二甲胺、磷酸膽堿、?；撬帷TP與甘氨酸，與通過(guò)絕對(duì)定量方法發(fā)現(xiàn)的8個(gè)顯著性差異代謝物相比，遺漏了2個(gè)代謝物，包括乳酸與精氨酸（差異代謝物匯總至表1）。這表明Par法預(yù)處理的褐牙鲆幼魚組織代謝組數(shù)據(jù)經(jīng)OPLSDA分析后，較UV法能分析出更多的差異代謝物，但仍并未能挖掘所有低鹽脅迫誘導(dǎo)的差異代謝物。

2.3.3 對(duì)數(shù)化-中心化法（Generalized log trans-formed-mean centering，Glog-Ctr）

對(duì)數(shù)化-中心化數(shù)據(jù)預(yù)處理方法（Glog-Ctr）較UV與Par法，在算法上存在顯著差異。Glog-Ctr法是基于所有代謝組數(shù)據(jù)變量為多元正態(tài)變量的假設(shè)，而引入一個(gè)常變量姿實(shí)現(xiàn)所有代謝組數(shù)據(jù)的變量穩(wěn)定，從而消除異方差的影響。然后進(jìn)行對(duì)數(shù)化處理，可以將極高與極低濃度的代謝物數(shù)量級(jí)平衡至同一數(shù)量級(jí)，但依然承認(rèn)各代謝物存在濃度上的差異（Purohit et al，2004）。

如圖3E所示，利用Glog-Ctr法預(yù)處理代謝組數(shù)據(jù)，并經(jīng)過(guò)OPLS-DA分析后，正常鹽度對(duì)照組與低鹽脅迫組的褐牙鲆幼魚樣本也獲得了可靠的分類，解釋度（R2X=41.6%）優(yōu)于UV法與Par法預(yù)處理的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，而模型可靠度（Q2=0.516）則介于UV法與Par法之間。從載荷圖（圖3F）上可以觀察到共有9個(gè)顯著性差異代謝物（含1個(gè)未知代謝物），包括谷氨酸、二甲胺、磷酸膽堿、?；撬?、ATP、甘氨酸、乳酸與精氨酸，與通過(guò)絕對(duì)定量方法發(fā)現(xiàn)的8個(gè)顯著性差異代謝物完全一致（差異代謝物匯總至表1）。這表明Glog-Ctr法預(yù)處理的褐牙鲆幼魚組織代謝組數(shù)據(jù)經(jīng)OPLS-DA分析后，較UV法與Par相比能挖掘所有低鹽脅迫誘導(dǎo)的差異代謝物。

3 討論

由于海洋環(huán)境的高鹽度特點(diǎn)，海洋生物為應(yīng)對(duì)海水的高鹽度，必須在體內(nèi)儲(chǔ)存高濃度的滲透調(diào)節(jié)物，例如?；撬?、甜菜堿、甘氨酸、氮氧三甲胺等有機(jī)小分子滲透調(diào)節(jié)物。這些滲透調(diào)節(jié)物的濃度往往是其他代謝物的數(shù)十倍到數(shù)百倍，甚至在極端情況下達(dá)到上千倍的差異，造成代謝物所占代謝組權(quán)重的極度不均衡。Zhang等（2011）利用代謝組學(xué)技術(shù)表征了海洋雙殼貝類菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）的代謝組，結(jié)果表明菲律賓蛤仔主要利用滲透調(diào)節(jié)物甜菜堿進(jìn)行體內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)，其甜菜堿濃度達(dá)到了其他代謝物濃度的200倍以上。而在另一種海洋雙殼貝類紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）代謝組中也發(fā)現(xiàn)了滲透調(diào)節(jié)物甜菜堿是濃度最高的代謝物（Ji et al，2013）。而針對(duì)海洋魚類生物的代謝組學(xué)研究相對(duì)較少。Katsiadaki等表征了三刺棘魚（Gasterosteus aculeatus）的代謝組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三刺棘魚主要利用牛磺酸作為滲透調(diào)節(jié)物參與機(jī)體的滲透調(diào)節(jié)過(guò)程（Katsiadaki et al，2010）。在本研究中，褐牙鲆幼魚體內(nèi)最主要的代謝物為氮氧三甲胺，其濃度是其他代謝物200倍以上。作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物，氮氧三甲胺廣泛分布于海洋生物體內(nèi)，對(duì)維持海洋生物細(xì)胞與海水環(huán)境之間的滲透平衡起到十分重要的生理作用（Katsiadaki et al，2010）。因此，基于核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)研究證明，氮氧三甲胺是褐牙鲆幼魚應(yīng)對(duì)海洋環(huán)境高鹽度的主要滲透調(diào)節(jié)物。以上結(jié)果表明，不同物種的海洋生物采用不同的策略以適應(yīng)海洋環(huán)境的高鹽度。

在本研究中，首先利用Chenomx軟件對(duì)低鹽脅迫后的褐牙鲆幼魚代謝組進(jìn)行了絕對(duì)定量分析及其單尾t檢驗(yàn)。如表1所示，低鹽脅迫誘導(dǎo)的代謝組響應(yīng)包括顯著上調(diào)的乳酸、精氨酸、谷氨酸、二甲胺、甘氨酸與ATP，以及顯著下調(diào)的牛磺酸與磷酸膽堿。?；撬崾呛Ｑ笊矬w內(nèi)常見的小分子滲透調(diào)節(jié)物，在褐牙鲆幼魚體內(nèi)也以較高濃度存在。作為滲透調(diào)節(jié)物，?；撬嶙钪饕纳砉δ苁钦{(diào)節(jié)褐牙鲆與海水的滲透平衡。顯然，在低鹽脅迫下，褐牙鲆幼魚通過(guò)減少體內(nèi)?；撬釢舛葢?yīng)對(duì)海水的鹽度下降。而另一滲透調(diào)節(jié)物二甲胺的濃度顯著上升，這是褐牙鲆幼魚機(jī)體利用二甲胺補(bǔ)充?；撬嵯抡{(diào)所啟動(dòng)的一種代謝補(bǔ)償機(jī)制。同時(shí)，低鹽脅迫的褐牙鲆幼魚體內(nèi)ATP濃度顯著上升，而磷酸膽堿濃度顯著下降，這表明褐牙鲆在低鹽脅迫下，通過(guò)儲(chǔ)存能量代謝物，以適應(yīng)鹽度下降，維持機(jī)體正常功能。同時(shí)，顯著上升的乳酸濃度表明低鹽脅迫下的褐牙鲆幼魚通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)的無(wú)氧代謝，為正常生命活動(dòng)提供必需的能量。而氨基酸（精氨酸、谷氨酸與甘氨酸）濃度的顯著上升，表明低鹽脅迫可能影響了褐牙鲆幼魚的蛋白質(zhì)合成。

由于生物樣本代謝組的復(fù)雜性，通過(guò)定量每個(gè)代謝物的濃度進(jìn)行代謝響應(yīng)分析往往耗時(shí)巨大。因此，必須通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析的手段（如正交偏最小二乘法判別分析法，OPLS-DA），對(duì)海量代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維及模式識(shí)別分析，從而挖掘出差異代謝物。其中，最關(guān)鍵的步驟為代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的預(yù)處理。在本工作中，主要采用了3種常見的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，包括單位方差換算（UV）、帕萊托換算（Par）與對(duì)數(shù)化-中心化處理（Glog-Ctr）3種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，對(duì)褐牙鲆幼魚代謝組NMR數(shù)據(jù)預(yù)處理后進(jìn)行OPLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，褐牙鲆幼魚NMR代謝組數(shù)據(jù)經(jīng)UV法與Par法數(shù)據(jù)預(yù)處理后，OPLS-DA分析結(jié)果與代謝物絕對(duì)定量結(jié)果相比，均造成了差異代謝物缺失，分別缺失3個(gè)與2個(gè)差異代謝物，占比33%與22%。而經(jīng)Glog-Ctr法預(yù)處理的褐牙鲆幼魚代謝組數(shù)據(jù)，OPLS-DA分析結(jié)果與代謝物絕對(duì)定量結(jié)果完全吻合。顯而易見，Glog-Ctr數(shù)據(jù)預(yù)處理方法最適合用于褐牙鲆幼魚代謝組數(shù)據(jù)預(yù)處理。而造成這3種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法差異的根本原因應(yīng)與這3種方法的算法邏輯有關(guān)。對(duì)于UV法與Par法這兩種數(shù)據(jù)預(yù)處理方法而言，均通過(guò)把代謝組數(shù)據(jù)中每個(gè)變量乘以不同的縮放因子，調(diào)整不同濃度代謝物之間的差異，從而調(diào)整各代謝物濃度所占整個(gè)代謝組的權(quán)重。其中UV法縮放因子為代謝組變量標(biāo)準(zhǔn)差的倒數(shù)，而Par法則以代謝組變量的標(biāo)準(zhǔn)差方根的倒數(shù)作為縮放因子。盡管這兩種方法均考慮了代謝物濃度的差異，但顯然忽略了褐牙鲆幼魚作為海洋生物的特殊性，即褐牙鲆幼魚代謝物濃度的差異并非保持在同一數(shù)量級(jí)。其中，最大濃度的滲透調(diào)節(jié)物氮氧三甲胺的濃度是其他大部分代謝物的2個(gè)數(shù)量級(jí)以上，因此UV法與Par法對(duì)于褐牙鲆幼魚代謝組每個(gè)變量權(quán)重的調(diào)節(jié)作用有限，無(wú)意中突出了高濃度代謝物的生物學(xué)作用，造成了OPLS-DA分析結(jié)果中部分差異代謝物的缺失。

Glog-Ctr法的算法是在引入常變量姿，實(shí)現(xiàn)了所有代謝組數(shù)據(jù)的變量穩(wěn)定及異方差消除后，對(duì)代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)化處理，從而將極高與極低濃度的代謝物數(shù)量級(jí)平衡至同一數(shù)量級(jí)。顯然，在Glog-Ctr法的算法邏輯中，并不忽略低濃度代謝物的生物學(xué)作用。由于褐牙鲆幼魚樣本的代謝物濃度差異要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他生物樣本，達(dá)到了數(shù)百倍差異，因此從算法上講，Glog-Ctr法較UV法與Par法對(duì)于褐牙鲆幼魚樣本的代謝組數(shù)據(jù)分析可能具有更佳的適用性。Viant等采用Glog-Ctr法對(duì)鮑魚（Haliotis rufescens）的NMR代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，分析了健康與饑餓狀態(tài)的鮑魚代謝組差異。結(jié)果表明Glog-Ctr法預(yù)處理的代謝組數(shù)據(jù)能呈現(xiàn)良好的代謝組差異。另外，Ji等利用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)表征了有害菌脅迫后紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）代謝組響應(yīng)，同樣證明Glog-Ctr預(yù)處理方法適用于海洋雙殼貝類。以上研究表明，Glog-Ctr數(shù)據(jù)預(yù)處理方法適用于代謝物濃度差異極大的海洋生物樣本的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析。

4 結(jié)論

本研究以褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚為對(duì)象，經(jīng)低鹽脅迫48 h后，利用一維核磁共振氫譜，鑒定出了褐牙鲆幼魚組織中的29個(gè)代謝物，其中褐牙鲆幼魚體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物-氮氧三甲胺濃度是其他代謝物濃度的200倍以上，并挖掘了低鹽脅迫誘導(dǎo)的8個(gè)差異代謝物。同時(shí)，分析了褐牙鲆幼魚全組織在低鹽脅迫后的代謝組，比較了3種不同預(yù)處理方法（單位方差換算、帕萊托換算與對(duì)數(shù)化-中心化處理）對(duì)于低鹽脅迫誘導(dǎo)的代謝響應(yīng)分析的差異。結(jié)果表明，對(duì)數(shù)化-中心化方法預(yù)處理的核磁共振代謝組數(shù)據(jù)，經(jīng)OPLS-DA分析，能呈現(xiàn)8個(gè)低鹽脅迫誘導(dǎo)的差異代謝物，與代謝物絕對(duì)定量結(jié)果一致，優(yōu)于其他兩種預(yù)處理方法（單位方差換算、帕萊托換算），適用于褐牙鲆代謝組學(xué)分析。以上研究結(jié)果為褐牙鲆代謝組數(shù)據(jù)的精確分析提供了方法學(xué)依據(jù)。

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NMR-based metabolomic analysis on the extracts of whole tissue from flounder Paralichthys olivaceus

LIU Jia-lin1,2,XU Lan-lan1,2,LU Zhen1,2,JI Cheng-long1,LI Fei1,WANG Qing1,ZHAO Jian-min1,WU Hui-feng1

（1.Key Laboratory of Coastal Zone Environmental Processes and Ecological Remediation,Yantai Instituteof Coastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Yantai 264003,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

As an-omic technique in system biology,nuclear magnetic resonance(NMR)-based metabolomics has been widely used in marine biology in recent years.Due to the high salinity of marine environment,there exists substantial differences of metabolite abundances in marine organisms compared with other organisms.To deal with the high salinity of seawater,marine organisms use very high concentrations of osmolytes,such as taurine,betaine and trimethylamine N-oxide,to balance the osmolarity.Generally,the concentrations of osmolytes are hundreds of times higher than other metabolites,leading to extreme imbalance of weights of metabolites.Therefore,a suitable data preprocessing was the key procedure to accurately analyze the metabolomic data from marine organisms.In this work,the juvenile flounder Paralichthys olivaceus was exposed to a reduced salinity（50%normal salinity,15.6 psu).After exposure for 48 h,the one dimensional1H NMRspectroscopy was used to analyze the metabolomes of flounder samples.To investigate the influences of data preprocessing,the metabolomic data of founder samples were subjected to three different data preprocessing methods(unit variance scaling,Pareto scaling and generalized log transformation-mean centering)before pattern recognition analysis.Results indicated that the concentration of osmolyte,trimethylamine N-oxide,was approximately 200 times higher than other metabolites in flounder samples.The reduced salinity induced significant metabolic responses in juvenile flounder.After orthogonal partial least squares-discriminant analysis(OPLS-DA),generalized log transformation-mean centering was found to be the best data preprocessing method,presenting 8 significantly altered metabolites induced by reduced salinity,which was consistent with the quantitative analysis of metabolites.Overall,this study provided a suitable data preprocessing method to analyze the metabolomic data of flounder P.olivaceu.

Paralichthys olivaceus;metabolomics;NMR;data preprocessing

P735

A

1001原6932（圓園17）05原園538原09

10.11840/j.issn.1001-6392.2017.05.009

2016-07-21；

2016-11-04

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（973計(jì)劃），（2015CB453303）；山東省自然科學(xué)杰出青年基金（JQ201310）

劉佳琳（1980-），博士研究生，主要從事海洋生態(tài)毒理學(xué)研究。電子郵箱：jlliu@yic.ac.cn。

吳惠豐，研究員。電子郵箱：hfwu@yic.ac.cn。

（本文編輯：袁澤軼）