陳孝鵬，沈 煒，王亞軍

浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310032

固定化細(xì)胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯工藝研究

陳孝鵬，沈 煒，王亞軍

浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310032

采用硅藻土作載體，聚乙烯亞胺和戊二醛作交聯(lián)劑來固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr共表達(dá)菌株，以此來催化 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成 6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2]，考察了硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化細(xì)胞的催化性能，進(jìn)一步優(yōu)化了固定化細(xì)胞催化合成(3R,5R)-2工藝。結(jié)果表明：在固定化細(xì)胞用量100 g/L、葡萄糖與底物質(zhì)量濃度比為1:1、轉(zhuǎn)化溫度30℃、pH 7.0、流速12 mL/min、100 g/L的(5R)-1轉(zhuǎn)化完全的條件下，填充床式反應(yīng)器可以連續(xù)反應(yīng)五個(gè)批次，轉(zhuǎn)化570 g/L的(5R)-1，較攪拌式反應(yīng)器提高了107.3%，較游離細(xì)胞間歇催化操作提高了185%。

6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯 羰基還原酶 固定化

阿托伐他汀鈣是一種對(duì)膽固醇合成中關(guān)鍵性限速酶 HMG-CoA還原酶具有強(qiáng)烈的競爭性抑制作用的藥物，能有效地降低膽固醇的含量，降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2]是阿托伐他汀鈣合成的重要手性砌塊[2]。相較于化學(xué)合成法的苛刻反應(yīng)條件，生物法合成手性藥物具有明顯的優(yōu)勢，其立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、對(duì)生產(chǎn)設(shè)備的要求低，大大降低了生產(chǎn)成本[3,4]。

羰基還原酶是一類能夠不對(duì)稱催化前手性酮還原為光學(xué)醇的酶[5]。肖黎等[6]構(gòu)建了羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶雙酶共表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，開發(fā)了雙酶共表達(dá)菌株全細(xì)胞催化 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成(3R,5R)-2的工藝(圖 1)，游離E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr全細(xì)胞最高可以催化200 g/L (5R)-1完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物差向異構(gòu)體過量(d.e.p)值大于99.5%。但游離細(xì)胞催化工藝的酶和輔酶只能使用一次，存在轉(zhuǎn)化液容易乳化、下游分離難度大等缺陷[7,8]。

圖1 共表達(dá)菌株催化合成(3R,5R)-2Fig.1 Schematic illustration of (5R)-1 bioreduction to (3R,5R)-2 synthesis catalyzed by E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr

針對(duì)游離細(xì)胞催化工藝的缺陷，本研究選擇硅藻土作為載體，采用交聯(lián)劑聚乙烯亞胺和戊二醛固定E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞，考察了固定化細(xì)胞的催化性能，進(jìn)一步優(yōu)化了固定化細(xì)胞催化合成(3R,5R)-2工藝。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所構(gòu)建[6]、保藏；(5R)-1（質(zhì)量含量約68%）由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng)；(3R,5R)-2購自Toronto Research Chemicals Inc.（多倫多，加拿大）；卡那霉素購自TaKaRa公司；50%聚乙烯亞胺購自上海晶純生化科技股份有限公司；25%戊二醛購自天津阿法埃莎化學(xué)有限公司；硅藻土購自溫州化學(xué)材料廠；其它試劑均為市售分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)：從斜面培養(yǎng)基中挑取一接種環(huán)的菌落接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，搖瓶置于旋轉(zhuǎn)式搖床在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)8～10 h。

罐上發(fā)酵培養(yǎng)：種子37 ℃下培養(yǎng)8～10 h后，按3.0% (v/v)的接種量接種于裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，37 ℃、500 r/min、通氣量4 L/min、溶氧40%的條件下培養(yǎng)2 h左右，加入終濃度為15 g/L乳糖，28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。將發(fā)酵液在8 000 r/min下離心10 min，棄上清液，菌體用生理鹽水洗滌兩次后-20 ℃保藏。

1.2.2 硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化細(xì)胞制備

稱取約10 g濕菌體（細(xì)胞干重2.0 g），重新懸浮于100 mL、pH7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中；加入0. 6 g硅藻土，攪拌0.5 h后加入4 mL 10%聚乙烯亞胺溶液（預(yù)先用稀鹽酸調(diào)至pH7.0），交聯(lián)1 h；再加入1 mL的50%戊二醛溶液，交聯(lián)1 h后抽濾，用緩沖液洗滌三次后4 ℃保藏。

1.2.3 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯轉(zhuǎn)化

取10 g硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，加入到100 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液中，葡萄糖與底物以質(zhì)量比1:1添加，加入5 g (5R)-1，在30 ℃的水浴中反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束，取樣用無水乙醇稀釋，高效液相色譜檢測產(chǎn)物。

1.2.4 填充床連續(xù)轉(zhuǎn)化

稱取40 g硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr，填充至填充床反應(yīng)器中。反應(yīng)器底端有泡沫濾芯，防止固定化細(xì)胞在底部泄露（圖 2）。填充柱內(nèi)部封閉，400 mL反應(yīng)液（由360 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液構(gòu)成，含有40 g葡萄糖和40 g (5R)-1）通過蠕動(dòng)泵從上端泵入，流經(jīng)固定化細(xì)胞反應(yīng)后，從底部流出，回到儲(chǔ)藏反應(yīng)液的燒杯中，通過燒杯中攪拌子的攪動(dòng)使反應(yīng)液混合均勻，然后再通過蠕動(dòng)泵泵回到反應(yīng)器。填充柱外部有一層夾套，通入30 ℃溫水保持反應(yīng)器溫度在30 ℃左右。

圖2 固定化細(xì)胞填充床反應(yīng)器Fig.2 Packed bed bioreactor with the immobilized E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr 1-immobilized cells, 2-pump1, 3-mixture, 4-water, 5-pump2

1.3 分析方法

(5R)-1、(3R,5R)-2采用島津HPLC LC-20AD高效液相色譜儀檢測。色譜柱為J&K CHEMICA?C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相由體積比1:3 (v/v)的乙腈水溶液組成，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長設(shè)置為210 nm，柱溫40 ℃。產(chǎn)物(3R,5R)-2的d.e.p值按式（1）計(jì)算。

式中，c(3R,5R)-2表示產(chǎn)物(3R,5R)-2的濃度，mol/L；c(3S,5R)-2表示差向異構(gòu)體(3S,5R)-2的濃度，mol/L。

定義30 ℃、pH 7.0條件下每分鐘催化生成1 μmol (3R,5R)-2所需要的酶量為1 U，則固定化細(xì)胞剩余酶活r為反應(yīng)結(jié)束后固定化細(xì)胞酶活（A，U/g）與初始固定化細(xì)胞酶活（A0，U/g）的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)體系pH對(duì)反應(yīng)的影響

反應(yīng)pH對(duì)硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響示于圖3。當(dāng)pH為6.5～7.5時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上；在pH7.0下反應(yīng)3 h后，固定化細(xì)胞剩余酶活最高，酶活損失不大。其它pH條件下固定化細(xì)胞的剩余酶活較低，過酸過堿條件都不利于酶發(fā)揮催化活性。在考察pH范圍內(nèi)其d.e.p都在99.5%以上，表明pH值不改變固定化細(xì)胞羰基還原酶的立體選擇性。因此，確定pH7.0為固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)pH。

圖3 體系pH值對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of solution pH on (5R)-1 asymmetric reduction

圖4 溫度對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of temperature on (5R)-1 asymmetric reduction

2.2 反應(yīng)體系溫度對(duì)反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度對(duì)硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響示于圖4。在25～28 ℃和35 ℃下反應(yīng)3 h，(5R)-1不能完全轉(zhuǎn)化；30～32 ℃下反應(yīng)3 h (5R)-1能完全轉(zhuǎn)化完。較低溫度下，固定化細(xì)胞的反應(yīng)速度較慢；當(dāng)溫度高于30℃時(shí)固定化細(xì)胞酶活損失較大。在考察溫度范圍內(nèi)產(chǎn)物d.e.p都在99.5%以上，表明溫度不影響羰基還原酶的立體選擇性。因此，確定30 ℃為固定化細(xì)胞的反應(yīng)溫度。

2.3 反應(yīng)體系葡萄糖濃度對(duì)反應(yīng)的影響

葡萄糖與底物的質(zhì)量比對(duì)硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響示于圖 5。當(dāng)葡萄糖濃度與底物質(zhì)量比≤1:2 (w/w)時(shí)，(5R)-1轉(zhuǎn)化率較低，葡萄糖的氧化成為了限速步驟。當(dāng)葡萄糖與底物質(zhì)量比≥1:1時(shí)，(5R)-1能夠完全反應(yīng)，高濃度的葡萄糖對(duì)固定化細(xì)胞活性沒有明顯抑制作用，(3R,5R)-2的d.e.p值保持在99.5%以上。從經(jīng)濟(jì)的角度來考慮，確定1:1為硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞的最適葡萄糖與底物質(zhì)量比。

圖5 葡萄糖濃度對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on (5R)-1 asymmetric reduction

圖6 底物濃度對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction

2.4 反應(yīng)體系底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響

底物濃度對(duì)硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響示于圖6。當(dāng)(5R)-1濃度為25～50 g/L時(shí)，反應(yīng)3 h后(5R)-1能完全轉(zhuǎn)化。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?5 g/L后，反應(yīng)3 h (3R,5R)-2累積濃度接近，但固定化細(xì)胞的剩余酶活隨著(5R)-1濃度的增大而快速下降。這是因?yàn)榈孜锘螂s質(zhì)對(duì)固定化細(xì)胞造成一定的破壞，導(dǎo)致酶蛋白的流失。因此，確定50 g/L為固定化細(xì)胞的最適底物濃度。

2.5 反應(yīng)體系固定化細(xì)胞濃度對(duì)反應(yīng)的影響

固定化細(xì)胞濃度對(duì)硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響示于圖7。隨著固定化細(xì)胞濃度的增加，相同時(shí)間內(nèi)(5R)-1轉(zhuǎn)化率相應(yīng)的提高。此外，細(xì)胞濃度的增加可以減緩高濃度底物對(duì)固定化細(xì)胞的破壞，減緩酶活損失。但過高的細(xì)胞濃度會(huì)增加操作難度和提高細(xì)胞培養(yǎng)成本，100 g/L的細(xì)胞濃度后，細(xì)胞用量的增加，(5R)-1轉(zhuǎn)化率增加不明顯，但成本大大增加。綜合考慮，確定100 g/L為硅藻土固定化細(xì)胞的最適細(xì)胞濃度。

圖7 固定化細(xì)胞濃度對(duì)不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of immobilized cell loading size on(5R)-1 asymmetric reduction

2.6 固定化細(xì)胞使用批次研究

固定化細(xì)胞的反應(yīng)批次是評(píng)價(jià)其性能的一個(gè)重要指標(biāo)。考察了最優(yōu)條件下固定化細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器中的反應(yīng)批次，轉(zhuǎn)化體系組成為90 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液（100 mM），5 g (5R)-1，5 g葡萄糖，10 g固定化細(xì)胞，反應(yīng)完全后抽濾回收固定化細(xì)胞并用緩沖液沖洗兩次，用于下一批次的反應(yīng)，結(jié)果示于圖8。結(jié)果表明，固定化細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器中可以反應(yīng)五個(gè)批次，50 g/L的(5R)-1能夠完全轉(zhuǎn)化，但第6個(gè)批次難以轉(zhuǎn)化完全，在加入少量NADPH后反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。從反應(yīng)進(jìn)程曲線中可以看出每一批反應(yīng)完后固定化細(xì)胞酶活下降很快，反應(yīng)時(shí)間大大延長。經(jīng)驗(yàn)證，底物中的雜質(zhì)對(duì)細(xì)胞具有較大的破壞作用，雜質(zhì)的存在使得細(xì)胞裂解，導(dǎo)致蛋白的流失，影響了反應(yīng)批次。

圖8 攪拌釜中(3R,5R)-2分批補(bǔ)料轉(zhuǎn)化Fig.8 Fed-batch conversion of (3R,5R)-2 by immobilized cells in the stirred tank bioreactor

圖9 填充床反應(yīng)器中流速對(duì)反應(yīng)的影響Fig.9 Effect of flow rate on (5R)-1 asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

2.7 填充床反應(yīng)器中物料流速對(duì)反應(yīng)的影響

填充床反應(yīng)器中物料流速對(duì)產(chǎn)物濃度的影響示于圖9。當(dāng)流速為6～12 mL/min時(shí)，初始反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率都隨著物料的流速增大而增加。當(dāng)流速繼續(xù)增大至18 mL/min后，反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出隨物料流速下降的趨勢，這與高流速下底物(5R)-1的停留時(shí)間下降有關(guān)[9]。因此，確定12 mL/min為填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞的最適物料流速。

2.8 填充床反應(yīng)器中底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響

填充床反應(yīng)器中底物濃度對(duì)反應(yīng)的影響示于圖10。由于(5R)-1溶解度不高，固定化細(xì)胞初始反應(yīng)速率相差不大，隨著(5R)-1的消耗，反應(yīng)速率降低，直到反應(yīng)結(jié)束。但當(dāng)(5R)-1濃度過高，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物濃度的升高抑制了反應(yīng)正向進(jìn)行，出現(xiàn)產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，(5R)-1濃度超過100 g/L后產(chǎn)物抑制現(xiàn)象較明顯。因此，確定100 g/L為填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞的最適底物濃度。

圖10 底物濃度對(duì)填充床反應(yīng)器中不對(duì)稱還原反應(yīng)的影響Fig.10 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

2.9 填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞使用批次研究

填充床反應(yīng)器不僅可以進(jìn)行底物循環(huán)連續(xù)式反應(yīng)，又可以及時(shí)的將產(chǎn)物分離出去，避免的產(chǎn)物的積累對(duì)細(xì)胞的影響。另外，填充床使得固定化細(xì)胞與反應(yīng)液分離開來，避免了攪拌對(duì)固定化細(xì)胞的破壞作用，大大增加了固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性，降低了生產(chǎn)成本[10]?？疾炝嗽谧钸m條件下，固定化細(xì)胞在填充床反應(yīng)器中的反應(yīng)批次。轉(zhuǎn)化體系組成為：360 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液（100 mM），加入40 g (5R)-1和40 g葡萄糖，反應(yīng)器中填充40 g固定化細(xì)胞，通過蠕動(dòng)泵將反應(yīng)液以12 mL/min的流速泵入到反應(yīng)器中，在30 ℃下反應(yīng)，定時(shí)取樣檢測是否轉(zhuǎn)化完全，反應(yīng)完全后用100 mL緩沖液沖洗兩次，用于下一批次的反應(yīng)。

填充床反應(yīng)器中硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞使用批次示于圖11。第1個(gè)批次100 g/L的(5R)-1在4.5 h左右能轉(zhuǎn)化完全，反應(yīng)速度較攪拌式反應(yīng)器更快，且在轉(zhuǎn)化五個(gè)批次后第六個(gè)批次還能轉(zhuǎn)化70%，最終轉(zhuǎn)化 570 g/L的(5R)-1，較攪拌式反應(yīng)器提高了107.3%。

圖11 填充床反應(yīng)器中不同使用批次的細(xì)胞活性Fig.11 Continuous conversion of (5R)-1 to (3R,5R)-2 by immobilized cells in the packed bed bioreactor

3 結(jié) 論

研究了硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器和填充床反應(yīng)器中的催化性能，建立了(3R,5R)-2催化合成工藝。填充床反應(yīng)器的生產(chǎn)率最高，其最佳催化工藝為：反應(yīng)溫度30 ℃，反應(yīng)pH7.0，葡萄糖與底物的質(zhì)量比為1:1，(5R)-1濃度100 g/L，固定化細(xì)胞濃度100 g/L，流速12 mL/min。在最優(yōu)條件下，570 g/L的(5R)-1在72 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化，較游離細(xì)胞催化工藝[6]提高了 185%。構(gòu)建的固定床生物反應(yīng)器連續(xù)生物催化合成(3R,5R)-2技術(shù)，為(3R,5R)-2規(guī)?；a(chǎn)提供新的選擇。

[1]Keun-Sik H, Sung L J. Statins in acute ischemic stroke: A systematic review [J]. J Stroke, 2015, 17(3):282-301.

[2]Wolberg M, Filho M V, Bode S, et al. Chemoenzymatic synthesis of the chiral side-chain of statins: application of an alcohol dehydrogenase catalysed ketone reduction on a large scale [J]. Bioprocess and Biosystems Eng, 2008, 31(3):183-191.

[3]Xu Q, Tao W Y, Huang H, et al. Highly efficient synthesis of ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by a novel carbonyl reductase fromYarrowia lipolytica, and using mannitol or sorbitol as cosubstrate [J]. Biochem Eng J, 2016, 106:61-67.

[4]He X J, Chen S Y, Wu J P, et al. Highly efficient enzymatic synthesis oftert-butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoate with a mutant alcohol dehydrogenase ofLactobacillus kefir[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(21):8963-8975.

[5]Deng J, Yao Z, Chen K, et al. Towards the computational design and engineering of enzyme enantioselectivity: A case study by a carbonyl reductase fromGluconobacter oxydans[J]. J Biotechnol, 2016, 217(20):31-40.

[6]肖 黎, 王亞軍, 曹 政, et al. 生物催化法合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯 [J]. 生物加工過程, 2013, 11(1):29-34.Xiao L, Wang Y J, Cao Z, et al. Development of biocatalytic process fort-butyl 6-cyano-(3R,5R) –dihydroxylhexanoate [J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2013, 11(1):29-34.

[7]Carlsson N, Gustafsson H, Th?rn C, et al. Enzymes immobilized in mesoporous silica: a physical-chemical perspective [J]. Adv Colloid Interface Sci, 2014, 205(12):339.

[8]Aissaoui N, Landoulsi J, Bergaoui L, et al. Catalytic activity and thermostability of enzymes immobilized on silanized surface: Influence of the crosslinking agent [J]. Enzyme Microb Technol, 2013, 52(6-7):336.

[9]Albertini A V P, Reis A L S, Teles F R R, et al. The new flow system approach in packed bed reactor applicable for immobilized enzyme[J]. J Mol Catal B: Enzym, 2012, 79:1-7.

[10]Jiang Y, Sun W, Wang Y, et al. Protein-based inverse opals: A novel support for enzyme immobilization [J]. Enzyme Microb Technol,2016, 96:42.

Biocatalytic Process oft-Butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxylhexanoate by Immobilized Cells

Chen Xiaopeng, Shen Wei, Wang Yajun
Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

Chiral diolt-butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxyhexanoate synthetic process was established by using the celite-polyethyleneimine (PEI)-glutaraldehyde (GA) immobilizedE.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells in present work. The optimized batch bioconversion conditions for the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crwere as follows: 30℃, pH 7.0, 100 g/L immobilized cell loading size, 50 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate, mass ratio of glucose tot-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate at 1:1 (w/w). Results demonstrated that the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells can be reused for five intermittent batches. Further,its catalytic conditions were studied in the stirred tank bioreactor and packed bed reactor. Under the optimized biocatalytic conditions, 570 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate was completely converted by the celite-PEI-GA immobilized cells in 72 h in the packed-bed bioreactor, which was improved 185% and 107.3% in comparison with those of the free cells and the celite-PEI-GA immobilized cells in the stirred tank bioreactor, respectively.

t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate; carbonyl reductase; immobilization

Q814.2; 0643.3

A

1001—7631 ( 2017 ) 03—0236—07

10.11730/j.issn.1001-7631.2017.03.0236.07

2017-04-19;

2017-05-17。

陳孝鵬（1992—），男，碩士研究生；王亞軍（1975—），男，教授，通訊聯(lián)系人。E-mail:wangyj@zjut.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金（21476209）。