李凱月，鄭長英，燕霞飛，王俊平

(青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與植物保護學院/山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東 青島 266109)

球孢白僵菌甘露醇1-磷酸脫氫酶cDNA克隆及生物信息學分析

李凱月，鄭長英，燕霞飛，王俊平

(青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與植物保護學院/山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東 青島 266109)

本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)甘露醇1-磷酸脫氫酶(BbMPD)基因的cDNA序列，并對其氨基酸序列進行生物信息學分析，明確其蛋白典型特征。結(jié)果顯示，BbMPD基因cDNA序列長1 176 bp，編碼391個氨基酸，分子量約為42.9 kD，理論等電點為5.09；不具有信號肽，屬于非分泌蛋白；無跨膜結(jié)構(gòu)，是親水性蛋白；亞細胞定位預測顯示BbMPD蛋白主要位于細胞質(zhì)；具有典型的甘露醇1-磷酸脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域；α螺旋和無規(guī)則卷曲是BbMPD蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)。該結(jié)果為進一步研究BbMPD基因及其功能奠定了基礎。

球孢白僵菌；甘露醇1-磷酸脫氫酶；基因克隆；生物信息學分析

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種昆蟲病原真菌，在侵染過程中能夠分泌白僵菌交酯、白僵菌素、毒蛋白酶等物質(zhì)[1]，加速害蟲的死亡過程，除此之外，避免了化學防治過程中帶來的藥物殘留、危害生態(tài)環(huán)境、污染環(huán)境等問題，因此在農(nóng)林害蟲的微生物防治中發(fā)揮著重要作用[2]。分生孢子是昆蟲病原真菌最重要的侵染單位，分生孢子的數(shù)量和質(zhì)量是成功侵染的關(guān)鍵因素。田間的分生孢子只有不受高溫、干旱以及紫外線等逆境環(huán)境的影響，才能夠侵染寄主并萌發(fā)。侵入昆蟲體內(nèi)的病原真菌不僅要抵抗寄主的免疫反應，還需克服寄主體內(nèi)的高滲環(huán)境，才能成功定殖[3]。

多元糖醇在調(diào)節(jié)微生物抗逆性中發(fā)揮著重要作用，其合成途徑受阻會導致真菌對多種逆境環(huán)境的適應力下降[4]。甘露醇是真菌中的一種多元醇，其主要有調(diào)節(jié)滲透壓[5]、清除自由基以及逆境環(huán)境保護等作用[6]。在絲狀真菌中，以磷酸果糖為底物，在磷酸甘露醇脫氫酶的催化下形成磷酸甘露醇，然后去磷酸化形成甘露醇[7]。整個合成過程受甘露醇1-磷酸脫氫酶(MPD)基因的調(diào)控與催化，并且需要NADH輔酶協(xié)助。大部分真菌MPD屬于多元醇特異性的長鏈脫氫還原酶家族(long-chain dehydrogenases and reductases，LDRs)，在蛋白的N端存在一個保守的輔酶結(jié)構(gòu)域和一個與底物識別和催化相關(guān)的結(jié)構(gòu)域[8，9]。

在單胞銹菌(Uromycesfabae)侵染寄主的過程中會分泌大量的甘露醇，可能與抵制寄主的ROS反應有關(guān)[10]。在黑曲霉(Aspergillusniger)中，MPD基因調(diào)控甘露醇的生物合成，使分生孢子具有抵抗高溫、冰凍等不良環(huán)境的能力[11]。在新型隱球菌(Cryptococcuneoformans)中，甘露醇與病原菌的致病力有關(guān)，甘露醇減少后導致病原菌對氧脅迫較為敏感[12]。在球孢白僵菌的分生孢子中，甘露醇是含量較高的一種多元醇，在一些逆境條件下孢子通過此類物質(zhì)來維持細胞膜的完整性以及酶的生物活性。本研究擬通過RT-PCR技術(shù)克隆球孢白僵菌BbMPD基因的cDNA序列，并利用生物信息學方法對其編碼的蛋白質(zhì)進行一系列的理化性質(zhì)及功能預測，包括蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位以及保守功能域等，以期為進一步研究球孢白僵菌BbMPD基因功能奠定基礎，以及為明確該基因在真菌抗逆機制中起到的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

球孢白僵菌Bb33A由本實驗室保存；Trizol、DEPC購自索萊寶生物科技有限公司；RT-PCR試劑盒、pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；大腸桿菌DH5α購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1 RNA提取和RT-PCR擴增 收集球孢白僵菌孢子粉，置于液氮預冷的研缽中研磨成粉末，將粉末移至DEPC處理的EP管中并加入1 mL Trizol。提取步驟按照相關(guān)說明書進行，瓊脂糖電泳檢測提取的RNA并用分光光度計定量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。

根據(jù)球孢白僵菌基因組數(shù)據(jù)庫(http://genome.jgi.doe.gov/Beaba1/Beaba1.home.html)中BbMPD基因序列，設計特異性引物F：5′-ATGGCTCCCAAGGCTGTTCATTT-3′和R：5′-TCACTCGCTGTCGGCCTGAA-3′，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過PCR擴增BbMPD基因片段。50 μL PCR反應體系：10×LA PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL (2.5 mmol/L each)，上、下引物各1.5 μL (10 μmol/L)，LATaq酶0.5 μL (5 U/μL)，cDNA模板1 μL，ddH2O 補齊至50 μL。PCR反應條件為：94℃預變性 5 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。瓊脂糖電泳，回收目標片段，連接pMD18-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，PCR鑒定陽性克隆，提取質(zhì)粒并測序。

1.2.2 BbMPD蛋白的生物信息學分析 利用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對BbMPD蛋白進行氨基酸序列組成、相對分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)進行分析[13]；利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對目標蛋白進行信號肽預測；利用TMHMM Server v. 2.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)對蛋白質(zhì)進行跨膜結(jié)構(gòu)預測；利用PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位預測；利用在線工具Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域[14]；利用ProtScale工具(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的親/疏水性；利用在線工具PSIpred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1BbMPD基因的克隆

以球孢白僵菌cDNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增反應，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，在1 100 bp處有一條亮帶，與預測基因片段大小相符，產(chǎn)物回收純化后連接pMD18-T載體，對陽性克隆測序得知其片段大小為1 176 bp，與已測序菌株BbMPD基因的cDNA序列大小一致，但存在部分堿基的差異。

M：DL2000 DNA Marker；1：BbMPDPCR產(chǎn)物

圖1BbMPD基因PCR擴增

2.2 BbMPD蛋白理化性質(zhì)分析

BbMPD基因cDNA序列編碼391個氨基酸，其蛋白質(zhì)的分子式為C1896H3022N524O593S8，分子量約為42.9 kD，總計由6 043個原子組成；等電點為5.09；不穩(wěn)定系數(shù)為39.79，未超過理論閥值40，故推斷該蛋白質(zhì)穩(wěn)定。其中丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸和異亮氨酸含量較多，而甲硫氨酸與色氨酸含量相對較少。

2.3 BbMPD蛋白的信號肽及跨膜區(qū)域分析

利用SignalP 4.1 Server對BbMPD蛋白進行信號肽預測，由圖2可知，C值最大切割點在第33個氨基酸，分值為0.261；綜合剪切點Y值最高也在第33個氨基酸，分值為0.211；信號肽最大值(S值)在第2個氨基酸位置，分值為0.345，因此推斷BbMPD蛋白無信號肽，屬于非分泌蛋白。利用TMHMM Server v. 2.0工具對BbMPD蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)預測，由圖3可知，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，為非膜蛋白。

圖2 BbMPD蛋白信號肽預測

圖3 BbMPD蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測

2.4 BbMPD蛋白的亞細胞定位預測

利用PSORT Ⅱ在線軟件對BbMPD蛋白進行亞細胞定位預測，可以為進一步預測蛋白質(zhì)功能提供基礎。結(jié)果表明，BbMPD蛋白分布在細胞質(zhì)中的概率為73.9%，線粒體中的概率為13%，細胞核中的概率為4.3%，囊泡分泌系統(tǒng)中的概率為4.3%，液泡中的概率為4.3%。

2.5 BbMPD蛋白保守功能域分析

利用NCBI中的Conserved Domains程序?qū)bMPD蛋白進行功能結(jié)構(gòu)域分析，由圖4可知，BbMPD蛋白第4～387位氨基酸組成了典型的甘露醇1-磷酸脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域，屬于多元醇特異性的長鏈脫氫還原酶(LDRs)家族[15]。

圖4 BbMPD蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.6 BbMPD蛋白氨基酸序列親水性/疏水性分析

用ProtScale工具預測了球孢白僵菌BbMPD蛋白氨基酸序列親水性/疏水性，結(jié)果(圖5)表明，蛋白第233位的天冬氨酸(N)具有最低的分值-3.011，第100位氨基酸異亮氨酸(I)具有最高的分值2.256。根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強和分值越高疏水性越強的規(guī)律可知，233位的天冬氨酸親水性最強，第100位異亮氨酸疏水性最強。由圖5可知，親水性氨基酸均勻分布于整個蛋白，且多于疏水性氨基酸，因此推測BbMPD蛋白為親水蛋白。

2.7 BbMPD蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測

對BbMPD蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，由圖6可知，BbMPD蛋白含有α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其中α螺旋結(jié)構(gòu)含量較多，其次是無規(guī)則卷曲。可見，α螺旋和無規(guī)則卷曲是BbMPD蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)，分布于整個肽鏈。

圖5 BbMPD蛋白氨基酸序列親水性/疏水性預測

圖6 BbMPD蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

3 討論與結(jié)論

球孢白僵菌作為一種廣譜性殺蟲真菌，能夠有效控制害蟲數(shù)量，同時不傷害天敵昆蟲與有益生物，因而得到廣泛應用[16]。分生孢子是昆蟲病原真菌最重要的侵染單位，甘露醇可以作為一種儲能碳源或保護劑降低孢子活性以延長其存活壽命[17]，此外，甘露醇可以提高分生孢子對熱激、氧化等不良環(huán)境的適應能力[18]。甘露醇在真菌中的代謝途徑是一個生物學循環(huán)過程，在輔因子的作用下，經(jīng)過一系列催化作用形成。球孢白僵菌中BbMPD基因的表達受高滲環(huán)境的誘導，并對其具有一定的適應性，該適應性受到Hog1信號途徑的調(diào)節(jié)，在高滲環(huán)境下會積累較高的多元醇來維持細胞內(nèi)的膨壓[19]。

本研究克隆了球孢白僵菌BbMPD基因的cDNA序列并對其進行測序，結(jié)果顯示本研究克隆的BbMPD基因的cDNA序列與已經(jīng)完成測序的球孢白僵菌ARSEF 2860菌株的基因組序列存在著部分堿基的差異[20]，這主要是由于菌株的差異造成的。另外，進一步對BbMPD蛋白進行了生物信息學分析，結(jié)果表明該蛋白沒有信號肽，不屬于分泌蛋白；不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于親水性蛋白；具有典型的甘露醇1-磷酸脫氫酶保守結(jié)構(gòu)域；BbMPD蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)是α螺旋和無規(guī)則卷曲，預測其與蛋白質(zhì)活性有關(guān)。本研究可為下一步BbMPD蛋白的誘導表達及純化，以及試圖通過結(jié)構(gòu)生物學的方法來探究BbMPD蛋白的功能奠定基礎。

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CloningandBioinformaticsAnalysisofMannitol1-PhosphateDehydrogenasecDNAinBeauveriabassiana

Li Kaiyue, Zheng Changying, Yan Xiafei, Wang Junping

(CollegeofAgronomyandPlantProtection,QingdaoAgriculturalUniversity/KeyLabofIntegratedCropDiseaseandPestManagementofShandongProvince,Qingdao266109,China)

The cDNA sequence of mannitol 1-phosphate dehydrogenase (MPD) fromBeauveriabassianawas cloned using RT-PCR. The bioinformatics analysis of amino sequences was performed, and the protein typical characteristics were identified. The results showed that the cDNA sequence ofBbMPDgene was 1 176 bp, which encoded 391 amino acids；its molecular weight was 42.9 kD and the theoretical isoelectric point was 5.09. It was a non-secretory protein without a signal peptide and a hydrophilicity protein without transmembrane domain. The subcellular location results indicated that the BbMPD protein was mainly located in cytoplasm. It possessed the conserved domains of mannitol 1-phosphate dehydrogenase superfamily. The α-helix and random coil were the major secondary structure of BbMPD protein. This method laid the foundation for further studying theBbMPDgene and its function.

Beauveriabassiana; Mannitol 1-phosphate dehydrogenase; Gene cloning; Bioinformatics analysis

S182

A

1001-4942(2017)10-0010-05

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.002

2017-06-13

國家自然科學基金項目(31201577)；青島農(nóng)業(yè)大學高層次人才科研基金項目(630609)；山東省蔬菜創(chuàng)新團隊——病蟲害防治崗位科學家(6682216020)；青島農(nóng)業(yè)大學應用型人才培養(yǎng)特色名校建設工程大學生科技創(chuàng)新項目

李凱月 (1991—)，女，山東東營人，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治。E-mail: 1491730863@qq.com

王俊平(1976—)，女，河北南皮人，博士，副教授，研究方向：害蟲生物防治。E-mail: junpingwang@qau.edu.cn