張曉霈，劉曉明，徐今寧，王愛萍，姜愛雯（1.河北北方學院藥學系，河北張家口075000；.河北北方學院附屬第一醫(yī)院藥劑科，河北張家口075000）

·臨床藥學與研究·

HPLC-熒光法測定人血漿中伊立替康及其活性代謝產(chǎn)物的濃度Δ

張曉霈1＊，劉曉明2#，徐今寧2，王愛萍2，姜愛雯2（1.河北北方學院藥學系，河北張家口075000；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院藥劑科，河北張家口075000）

目的：建立同時測定人血漿中伊立替康（CPT-11）及其活性代謝產(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）濃度的方法。方法：血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白及鹽酸酸化后，以喜樹堿為內(nèi)標，采用高效液相色譜-熒光法測定。色譜柱為Waters Luna C18，流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈（70∶30，V/V，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0），流速為1 mL/min，激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為480 nm（CPT-11）、535 nm（SN-38），柱溫為25，進樣量為20 μL。結(jié)果：CPT-11和SN-38血藥濃度分別在200～1 000、5～45 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r分別為0.999 4、0.999 2，n＝5），定量下限分別為200、5 ng/mL；日內(nèi)、日間RSD為1.68%～5.57%；CPT-11和SN-38的相對回收率分別為90.12%～106.93%（RSD＜8%，n＝5）、92.07%～102.56%（RSD＜6%，n＝5），提取回收率分別為72.23%～86.56%（RSD＜6%，n＝5）、71.98%～83.44%（RSD＜7%，n＝5）。采用該方法測得5例結(jié)腸癌患者體內(nèi)CPT-11和SN-38的血藥濃度分別為431.13～617.19、13.97～31.89 ng/mL（靜脈滴注結(jié)束后1 h），398.14～584.43、11.61～29.94 ng/mL（靜脈滴注結(jié)束后2 h）。結(jié)論：該方法樣品處理簡單、快速，且靈敏度高、重復性好，適用于臨床常規(guī)監(jiān)測CPT-11及其代謝物SN-38的血藥濃度及藥動學研究。

高效液相色譜-熒光法；伊立替康；7-乙基-10-羥基喜樹堿；血藥濃度

伊立替康（Irinotecan，CPT-11）屬于水溶性半合成喜樹堿類衍生物，是DNA拓撲異構(gòu)酶抑制劑，作用于細胞周期S期，阻止拓撲異構(gòu)酶對DNA斷鏈的修復，從而抑制細胞分裂[1]。CPT-11作為前體藥物進入人體后，一部分經(jīng)過羧酸酯酶（Carboxylesterase，CES）轉(zhuǎn)化為活性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿（7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，SN-38），其活性比CPT-11強100～1 000倍，細胞毒性約為CPT-11的200～2 000倍[2]。

CPT-11現(xiàn)已廣泛應用于結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌和宮頸癌等實體瘤的臨床治療，在腫瘤化療領(lǐng)域具有廣泛的應用前景[3]。但隨著臨床研究的不斷深入，CPT-11給患者帶來的骨髓抑制、嚴重腹瀉等毒副反應也成為限制其臨床應用的重要因素[4]。相關(guān)研究表明，CPT-11及SN-38的血藥濃度與臨床療效、化療所致嚴重不良反應密切相關(guān)[5]。因此，建議對使用CPT-11的患者進行血藥濃度監(jiān)測。目前，測定CPT-11血藥濃度的方法主要包括高效液相色譜（HPLC）法和液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法[6-10]。本研究在已有文獻的基礎上，建立了同時測定人血漿中CPT-11及其活性代謝產(chǎn)物SN-38的HPLC-熒光法，并將該方法應用于臨床，為進一步探討CPT-11血藥濃度與其所致不良反應的相關(guān)性提供參考。

1 材料

1.1 儀器

100型HPLC儀，包括手動進樣器、G1312A型二元泵、G1316A型柱溫箱、G1321A型熒光檢測器、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；H1650-W型臺式低溫高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；MX-S型渦旋混合器（美國Scilogex公司）；BSZ10型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；PHS-3C型酸度計（上海雷磁公司）。

1.2 藥品與試劑

伊立替康對照品（批號：141228，純度：≥99%）、SN-38對照品（批號：150102，純度：98.86%）均購自北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；喜樹堿對照品（內(nèi)標，北京恒元啟天化工研究院，批號：14090401，純度：98.82%）；注射用鹽酸伊立替康[江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H20040711，批號：16221AF，規(guī)格：100 mg（按C33H38N4O6·HCl計）]；乙腈為色譜純，磷酸二氫鈉、二甲基亞砜、鹽酸、磷酸等均為分析純，水為純凈水。

1.3 空白血漿

健康人空白血漿由河北北方學院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）血庫提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Luna C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈（70∶30，V/V，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0）；流速：1 mL/min；熒光激發(fā)波長：380 nm；發(fā)射波長：480 nm（CPT-11）、535 nm（SN-38）；柱溫：25；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

精密稱取CPT-11、SN-38對照品各適量，用二甲基亞砜溶解并分別定容至10 mL棕色量瓶中，配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的標準貯備液。量取上述標準貯備液適量，用0.01 mol/L鹽酸-乙腈混合溶液（2∶3，V/V）作為稀釋劑，分別配制成CPT-11質(zhì)量濃度為4、6、10、12、14、18、20 μg/mL，SN-38質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9 μg/mL的標準工作液。精密稱取內(nèi)標對照品適量，用二甲基亞砜溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為2 μg/mL的內(nèi)標溶液。以上所有溶液均置于－20冰箱中避光保存，備用。

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取空白血漿適量，置于1.5 mL EP管中，加入內(nèi)標溶液20 μL，渦旋混勻30 s；再加入乙腈200 μL，渦旋混勻1 min；以離心半徑9 cm、轉(zhuǎn)速13 000 r/min離心3 min。精密吸取上清液200 μL，加入1.0 mol/L鹽酸50 μL酸化，渦旋混勻30 s，精密吸取20 μL，進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取不同來源的空白血漿、空白血漿+CPT-11+SN-38、患者用藥后的血漿樣品各適量，按“2.3”項下方法處理（空白血漿樣品不加內(nèi)標）后，于“2.1”項色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果表明，CPT-11、內(nèi)標、SN-38的色譜峰峰形對稱，保留時間分別為3.6、4.7、7.1 min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾待測物的測定，表明該方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.4.2 標準曲線的繪制與定量下限的考察 精密量取空白血漿適量，置于1.5 mL EP管中，加入不同質(zhì)量濃度的CPT-11和SN-38標準工作液各10 μL，混合搖勻，分別配制成CPT-11質(zhì)量濃度為200、300、500、600、700、900、1 000 ng/mL，SN-38質(zhì)量濃度為5、10、20、25、30、40、45 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣測定，記錄色譜圖。以待測物質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、待測物與內(nèi)標的峰面積比值（y）為縱坐標，采用加權(quán)最小二乘法（加權(quán)系數(shù)w＝1/x2）進行線性回歸，得CPT-11的回歸方程為：y＝0.003x+0.186（r＝0.999 4，n＝5），SN-38的回歸方程為：y＝0.026x+1.122（r＝0.999 2，n＝5）。結(jié)果表明，CPT-11、SN-38血藥濃度分別在200～1 000、5～45 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

配制CPT-11、SN-38質(zhì)量濃度分別為200、5 ng/mL的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，平行測定5次，連續(xù)測定5 d。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間RSD均小于15%；實測質(zhì)量濃度在理論質(zhì)量濃度的80%～120%內(nèi)，表明CPT-11、SN-38的定量下限分別為200、5 ng/mL。

2.4.3 精密度試驗 取空白血漿、相應質(zhì)量濃度的CPT-11和SN-38標準工作液各適量，分別配制成CPT-11低、中、高質(zhì)量濃度（300、500、800 ng/mL）和SN-38低、中、高質(zhì)量濃度（10、20、35 ng/mL）的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。各樣品平行測定5次，連續(xù)測定5 d，考察方法的精密度[精密度以RSD（RSD＝實測質(zhì)量濃度標準偏差/實測質(zhì)量濃度平均值×100%）表示]。結(jié)果顯示，CPT-11的日內(nèi)RSD為1.68%～3.22%，日間RSD為3.12%～5.57%；SN-38的日內(nèi)RSD為2.06%～3.48%，日間RSD為1.98%～4.51%，表明精密度良好，詳見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision tests（±s，n＝5）

表1 精密度試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1Results of precision tests（±s，n＝5）

待測物CPT-11 SN-38理論質(zhì)量濃度，ng/mL 300 500 800 10 20 35日內(nèi)實測質(zhì)量程度，ng/mL 291.87±7.16 516.12±16.62 820.97±13.79 9.92±0.34 19.11±0.53 34.09±0.87 RSD，%2.45 3.22 1.68 3.48 2.78 2.06日間實測質(zhì)量濃度，ng/mL 288.25±13.78 510.58±28.43 816.46±25.47 9.86±0.44 19.37±0.38 34.24±0.79 RSD，%4.78 5.57 3.12 4.51 1.98 2.31

2.4.4 回收率試驗 取空白血漿、相應質(zhì)量濃度的CPT-11和SN-38標準工作液各適量，分別配制成CPT-11低、中、高質(zhì)量濃度（300、500、800 ng/mL）和SN-38低、中、高質(zhì)量濃度（10、20、35 ng/mL）的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。每個樣品平行測定5次，根據(jù)當日標準曲線計算實測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的比值，考察相對回收率；以經(jīng)提取所得血漿樣品的色譜峰面積與未經(jīng)提取血漿樣品的色譜峰面積進行比較，考察提取回收率。結(jié)果顯示，CPT-11的相對回收率為90.12%～106.93%（RSD＜8%，n＝5），提取回收率為72.23%～86.56%（RSD＜6%，n＝5）；SN-38的相對回收率為92.07%～102.56%（RSD＜6%，n＝5），提取回收率為71.98%～83.44%（RSD＜7%，n＝5），詳見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 2Results of recovery tests（±s，n＝5）

表2 回收率試驗結(jié)果（±s，n＝5）Tab 2Results of recovery tests（±s，n＝5）

待測物CPT-11 SN-38理論質(zhì)量濃度，ng/mL 300 500 800 10 20 35相對回收率計算值，%96.08±6.81 102.16±6.67 102.05±3.53 98.60±4.32 96.85±5.05 97.82±3.81 RSD，%7.09 6.52 3.46 4.38 5.22 3.89提取回收率計算值，%79.83±4.09 83.15±4.48 82.22±2.45 74.54±4.20 78.07±5.13 79.79±4.75 RSD，%4.12 5.39 2.98 5.64 6.58 5.97

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 分別配制CPT-11低、中、高質(zhì)量濃度（300、500、800 ng/mL）和SN-38低、中、高質(zhì)量濃度（10、20、35 ng/mL）的質(zhì)控樣品各5份，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，考察各樣品在光照室溫條件下放置8 h、經(jīng)歷3次凍融（－20～室溫）、－80保存1個月、手動進樣器中存放6 h的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各樣品在上述條件下穩(wěn)定性良好，RSD＜10%（n＝5）。

2.5 臨床應用

采用上述HPLC-熒光法測定5例結(jié)腸癌患者血漿中CPT-11和SN-38的濃度。其中，男性2例，女性3例；年齡45～53歲；3例患者聯(lián)用5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）、亞葉酸鈣（Leucovorin，LV）等藥物，2例患者為單藥治療。

所有患者均于90 min內(nèi)靜脈滴注注射用鹽酸伊立替康，分別于靜脈滴注結(jié)束后1、2 h抽取其外周血各2 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，以離心半徑9 cm、轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min，取上層血漿按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。結(jié)果顯示，靜脈滴注結(jié)束后1 h，5例患者體內(nèi)CPT-11、SN-38的血藥濃度分別為431.13～617.19 ng/mL、13.97～31.89 ng/mL；靜脈滴注結(jié)束后2 h，其體內(nèi)CPT-11、SN-38的血藥濃度分別為398.14～584.43 ng/mL、11.61～29.94 ng/mL，詳見表3。

表3 血藥濃度測定結(jié)果Tab 3Determination results of plasma concentration

3 討論

3.1 方法學評價

目前，臨床并尚普及CPT-11及其活性代謝產(chǎn)物SN-38血藥濃度的監(jiān)測?，F(xiàn)有的濃度測定方法主要包括HPLC-紫外法、HPLC-熒光法和LC-MS法[6-10]。其中，質(zhì)譜分析方法的樣本前處理過程較為復雜，且受儀器成本較高的影響，不利于在臨床上大規(guī)模推廣。CPT-11及SN-38的結(jié)構(gòu)式中含有π-π共軛體系，為剛性平面結(jié)構(gòu)，同時含有給電子基（羥基），可以增加熒光效率，滿足熒光物質(zhì)檢測的要求，選擇性較紫外檢測更好[2，7-9]。故筆者參考上述文獻，在370～430 nm激發(fā)波長范圍內(nèi)每隔5 nm掃描其激發(fā)光譜，發(fā)現(xiàn)CPT-11、SN-38在380 nm處的熒光激發(fā)強度最大，故將兩者的激發(fā)波長設定為380 nm；在470～540 nm發(fā)射波長范圍內(nèi)每隔5 nm掃描其發(fā)射光譜，發(fā)現(xiàn)CPT-11在480 nm、SN-38在535 nm處的熒光發(fā)射強度最大，故將其兩者的發(fā)射波長依次設定為480、535 nm。

CPT-11具有一個不穩(wěn)定的內(nèi)酯環(huán)，有pH依賴性，在體內(nèi)保持內(nèi)酯與羧酸鹽2種形式的動態(tài)平衡：當pH為3.0～5.0時，CPT-11主要以具有活性的內(nèi)酯形式存在；當pH為7.0時，則CPT-11主要以羧酸鹽形式存在[11]。因此，筆者考察了不同pH流動相對分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當流動相pH＝3.0時，出現(xiàn)前延峰；當pH＝4.5時，峰形存在拖尾現(xiàn)象；而當用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0時，在保證完全分離的前提下，各待測物峰形良好，故最終確定流動相的pH為4.0。

前期試驗曾使用甲醇作為蛋白沉淀劑，經(jīng)處理后，血漿樣品呈渾濁狀，沉淀不完全。使用相同體積的10%高氯酸處理后，空白血漿進樣后響應值變大，干擾明顯，檢測限升高。而使用乙腈作為蛋白沉淀劑不僅回收率較高，而且內(nèi)源性物質(zhì)的干擾較小。離心后的血漿樣品經(jīng)鹽酸酸化后，可保證CPT-11的內(nèi)酯-羧酸鹽平衡向內(nèi)酯移動，使測定結(jié)果更為準確。

筆者通過優(yōu)化色譜條件，調(diào)節(jié)流動相比例和pH，并采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，操作簡單、迅速，同時又可消除血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，可滿足生物樣本快速批量檢測的需求。臨床上與CPT-11可能合用的藥物包括5-FU、LV等，在臨床應用中并未發(fā)現(xiàn)上述兩種藥物對CPT-11、SN-38和內(nèi)標的檢測有所干擾。該方法在10 min之內(nèi)即可完成CPT-11和SN-38血藥濃度的檢測，且成本較低，可用于臨床治療藥物監(jiān)測。值得注意的是，空白血漿在3～4 min處出現(xiàn)色譜峰（見圖1A），雖然響應值很低，但也有可能對測定結(jié)果造成一定影響，故該方法仍有待進一步完善。

3.2 臨床應用

目前，臨床上主要依靠尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）1A1基因多態(tài)性檢測來指導CPT-11的個體化用藥，從而降低限制性毒副反應的發(fā)生。當患者服用高劑量（＞300 mg/m2）的CPT-11時，其不良反應與基因型存在相關(guān)性；而服用中、低劑量（＜300 mg/m2）的CPT-11時，其不良反應則與基因型無關(guān)[12]。然而，我國人群UGT1A1基因突變的比例僅占10%～12%，且CPT-11的給藥劑量一直處于較低水平，因此僅依靠基因檢測來指導其個體化用藥存在明顯的局限性[13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CPT-11所造成的嚴重骨髓抑制與SN-38的峰濃度密切相關(guān)，腹瀉的發(fā)生率也與SN-38的谷濃度存在相關(guān)性[14-15]。但上述研究仍處于初始階段，尚無一致結(jié)論。

本研究所建立的血藥濃度監(jiān)測方法已成功應用于患者。由表3可見，若CPT-11劑量為100～300 mg，CPT-11、SN-38的血藥濃度分別維持在398.14～617.19、11.61～31.89 ng/mL。其中，4號患者的用藥劑量高于3號，但活性代謝產(chǎn)物SN-38的血藥濃度卻明顯低于3號，提示CPT-11的體內(nèi)代謝可能存在明顯的個體差異。但由于本研究檢測的患者例數(shù)較少，監(jiān)測的樣本量也較小，且均為結(jié)腸癌患者，具有一定的局限性，故有待后續(xù)研究收集更多的樣本，進一步探討CPT-11血藥濃度與不良反應的相關(guān)性，以指導臨床個體化用藥。

綜上所述，該方法樣品處理簡單、快速，方法靈敏度高、重復性好，適用于臨床常規(guī)監(jiān)測CPT-11及其代謝物SN-38的血藥濃度及藥動學研究。

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Concentration Determination of Irinotecan and Its Active Metabolite in Human Plasma by HPLC-FLD

ZHANG Xiaopei1，LIU Xiaoming2，XU Jinning2，WANG Aiping2，JIANG Aiwen2（1.Dept.of Pharmacy，Hebei North University，Hebei Zhangjiakou 075000，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Hebei Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of irinotecan（CPT-11）and its active metabolite 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin（SN-38）in human plasma.METHODS：After precipitated by acetonitrile and acidified with hydrochloric acid，using camptothecin as internal standard，the plasma sample was determined by HPLC-FLD.The determination was performed on Waters Luna C18column with mobile phase consisted of 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate-acetonitrile（70∶30，V/V，adjusted pH to 4.0 by phosphoric acid）at flow rate of 1 mL/min.The excitation wavelength was set at 380 nm；the emission wavelengths of CPT-11 and SN-38 were set at 480 nm and 535 nm，respectively.The column temperature was 25and the sample size was 20 μL.RESULTS：The linear ranges were 200-1 000 ng/mL for CPT-11（r＝0.999 4，n＝5）and 5-45 ng/mL for SN-38（r＝0.999 2，n＝5）.RSDs of inter-day and intra-day were 1.68%-5.57%.The relative recoveries of CPT-11 and SN-38 were 90.12%-106.93%（RSD＜8%，n＝5）and 92.07%-102.56%（RSD＜6%，n＝5）；the extraction recoveries of CPT-11 and SN-38 were 72.23%-86.56%（RSD＜6%，n＝5）and 71.98%-83.44%（RSD＜7%，n＝5），respectively.The plasma concentrations of CPT-11 and SN-38 in 5 patients with colon cancer were 431.13-617.19，13.97-31.89 ng/mL（1 h after intravenous dripping）and 398.14-584.43，11.61-29.94 ng/mL（2 h after intravenous dripping）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive，reproducible and suitable for the determination of plasma concentration and pharmacokinetic study of CPT-11 and its metabolite SN-38.

HPLC-FLD；Irinotecan；7-ethyl-10-hydroxycamptothecin；Plasma concentration

R969.1

A

1001-0408（2017）29-4072-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.29.11

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃（No.20120157）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學。電話：0313-8043563。E-mail：2605520609@qq.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導師。研究方向：藥理學。電話：0313-8043563。E-mail：lxmyf@hotmail.com

2016-11-23

2017-03-15）

（編輯：張元媛）