董麗紅，張瑞芬，黃 菲，魏振承，張名位

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610)

油酸誘導(dǎo)單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型的建立及應(yīng)用

董麗紅，張瑞芬，黃 菲，魏振承，張名位

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610)

目的探討人肝癌HepG2細(xì)胞單純肝脂肪變性細(xì)胞模型的建立方法與模型的應(yīng)用。方法體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，以不同濃度的油酸處理24 h誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪變性，油紅O和尼羅紅染色定性觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積情況，并測定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，確定最佳模型濃度；同時，利用此模型觀察黃酮類化合物對脂肪變性肝細(xì)胞內(nèi)TG的影響。結(jié)果油酸終濃度為0.4 mmol·L-1時，肝細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴形成，且細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加，而MDA含量、SOD活性及培養(yǎng)液中ALT、AST釋放量較正常組無明顯變化；槲皮素和表兒茶素可明顯降低模型細(xì)胞內(nèi)TG含量。結(jié)論采用0.4 mmol·L-1油酸可成功誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，建立單純性肝細(xì)胞脂肪變性模型，該模型適用于預(yù)防非酒精性脂肪肝病的天然降脂藥物研究。

油酸；HepG2細(xì)胞；脂肪變性；甘油三脂；細(xì)胞模型；黃酮類化合物

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是目前世界上廣泛流行的一種慢性疾病，其發(fā)病過程可由早期階段的單純性脂肪肝逐漸發(fā)展到非酒精性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)，甚至肝纖維化和肝硬化等嚴(yán)重病癥。根據(jù)NAFLD形成機(jī)制的“二次打擊”學(xué)說，肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(triglyceride, TG)過度沉積是“第一次打擊”，導(dǎo)致單純性脂肪肝的發(fā)生；隨之，氧化應(yīng)激和炎癥因子上演“第二次打擊”，促使NASH的發(fā)展[1]。可見，在無“第二次打擊”的情況下，單純性脂肪肝不一定會轉(zhuǎn)化成NASH，其臨床表現(xiàn)為肝臟單純性脂肪變性，是預(yù)防NAFLD發(fā)生和發(fā)展的最佳時期。鑒于膳食療法的預(yù)防和早期治療原則以及無毒副作用等優(yōu)點，尋求新的食療方法，以預(yù)防肝脂肪變性及防止其向NASH的轉(zhuǎn)化成為食品營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。因而，首先要建立一種方便、實用的單純性肝脂肪變性模型。目前，細(xì)胞模型由于實驗條件可控、影響因素少而被廣泛用于NAFLD的體外研究[2]，但大部分研究采用的細(xì)胞模型并非單純性肝脂肪變性模型，如Yin等[3]和Xie等[4]的研究分別以一定濃度游離脂肪酸誘導(dǎo)L02或HepG2細(xì)胞脂肪變性，在TG蓄積的同時，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等指標(biāo)亦明顯變化，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因此，本研究擬采用油酸誘導(dǎo)HepG2建立單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型，并利用該細(xì)胞模型，評價黃酮類化合物預(yù)防肝脂肪變性的作用，旨在建立一種早期NAFLD的細(xì)胞模型，并應(yīng)用于膳食營養(yǎng)或食品功能因子等活性物質(zhì)預(yù)防NAFLD的體外研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞HepG2由中國科學(xué)院干細(xì)胞庫提供。

1.1.2試劑與儀器 MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、非必需氨基酸溶液，購自美國Thermo Fisher公司；油酸(oleic acid，OA)、牛血清白蛋白(bull serum albumin, BSA)、油紅O、尼羅紅染料，購自美國Sigma公司；MTT細(xì)胞增殖-毒性檢測、ALT、AST、MDA、SOD測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；TG酶法檢測試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒，購自北京普利萊技術(shù)有限公司。熒光倒置相差顯微鏡購自德國Leica公司；Infinite M200pro熒光酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和抗生素的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄細(xì)胞的生長狀態(tài)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，用1 mL 0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞，1 ∶3 傳代。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2細(xì)胞存活率的測定 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以5×108·L-1，每孔100 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的油酸(以異丙醇作溶劑[5])，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24、48 h后，按照MTT法檢測試劑盒的說明書測定各組細(xì)胞活力，篩選油酸的安全濃度范圍。以酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度值A(chǔ)，計算細(xì)胞存活率/%=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%

1.2.3油酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以5×108·L-1，每孔2 mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞匯合至70%～80%時，棄去舊的培養(yǎng)液，用含1% BSA的無血清MEM培養(yǎng)基饑餓處理16 h后，加入不同濃度的油酸(“1.2.2”確定的安全濃度范圍內(nèi))，每個濃度重復(fù)3次，培養(yǎng)24 h。

1.2.4單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型的鑒定

1.2.4.1細(xì)胞內(nèi)脂滴染色觀察 細(xì)胞按“1.2.3”方法做相應(yīng)處理后，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，冰凍的4%多聚甲醛固定10 min，分別采用油紅O染色法[3]和尼羅紅染色法[5]進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.4.2TG、ALT、AST、MDA和SOD的測定 細(xì)胞按“1.2.3”方法做相應(yīng)處理后，收集培養(yǎng)液和細(xì)胞。培養(yǎng)液1 000 r·min-1離心5 min，取上清，以試劑盒測定ALT、AST的含量；加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，2 000 r·min-1離心5 min，取上清，以試劑盒測定TG、MDA、SOD濃度，并以BCA 法測定蛋白濃度，分別以每克細(xì)胞蛋白中所含的量來表示。

1.2.5模型的應(yīng)用 選取“1.2.4”確定的最佳油酸濃度，按“1.2.3”所述的方法建立單純性肝細(xì)胞脂肪變性模型。設(shè)置正常對照組、油酸模型組和油酸+不同濃度藥物的實驗組(槲皮素或表兒茶素)，每組重復(fù)3次。處理完成后收集細(xì)胞，以試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)TG的變化。

2 結(jié)果

2.1油酸對HepG2細(xì)胞活力的影響由Fig 1可知，相比于未加油酸的正常對照組，油酸濃度為0.8 mmol·L-1時，誘導(dǎo)24 h能明顯降低HepG2細(xì)胞活力(P<0.05)，且當(dāng)油酸濃度達(dá)到1.0 mmol·L-1時，存活細(xì)胞量明顯減少，僅為79%(P<0.01)；誘導(dǎo)48 h，油酸對HepG2細(xì)胞活力的影響更大，其濃度為0.6 mmol·L-1時，HepG2細(xì)胞活力已明顯降低至正常對照組的90%(P<0.05)。由此可見，油酸濃度和誘導(dǎo)時間對HepG2細(xì)胞活力均有一定影響。油酸濃度≤0.6 mmol·L-1，孵育24 h時，對HepG2細(xì)胞活力無明顯影響。

Fig 1 Effect of oleic acid on HepG2 cell viability

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig2EffectofoleicacidonlipidaccumulationinHepG2cells

A:Oil red O staining and Nile red staining(×400); B:Intracellular TG content.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型的鑒定

2.2.1油酸對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的影響 從Fig 2A可看出，對比2種脂質(zhì)染色方法，均能很好地呈現(xiàn)油酸負(fù)荷下HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的特征。隨著油酸濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴越來越多，脂滴主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靠近細(xì)胞膜的部位，當(dāng)其濃度達(dá)到0.4 mmol·L-1時，在靠近細(xì)胞膜的區(qū)域聚集大量的紅色脂滴且連成片狀。細(xì)胞內(nèi)TG含量的測定結(jié)果與染色觀察結(jié)果一致(Fig 2B)，隨著油酸濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)TG逐漸上升，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。油酸濃度為0.1 mmol·L-1時，細(xì)胞內(nèi)TG含量比正常對照組中TG含量高出64%；當(dāng)油酸濃度增加到0.4 mmol·L-1時，細(xì)胞內(nèi)TG含量已達(dá)到正常對照組的3.5倍。表明油酸濃度為0.4 mmol·L-1時能明顯導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積。

2.2.2油酸對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響 由Fig 3A可知，相比于正常對照組，濃度≤0.4 mmol·L-1的油酸誘導(dǎo)24 h后，ALT和AST水平無明顯增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.6 mmol·L-1時，ALT水平明顯升高(P<0.05)。由Fig 3B、3C可知，相比于正常對照組，濃度≤0.4 mmol·L-1的油酸組細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量亦無明顯變化，而0.6 mmol·L-1油酸組細(xì)胞內(nèi)MDA水平明顯增加(P<0.05)，SOD活性明顯降低(P<0.05)，表明高濃度油酸可引發(fā)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，甚至死亡。

上述結(jié)果表明，油酸濃度為0.4 mmol·L-1時，細(xì)胞內(nèi)聚集的甘油三酯明顯增加，且此濃度未引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因此，以0.4 mmol·L-1的油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h可成功建立單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型。

2.3黃酮類化合物對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響以0.4 mmol·L-1油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立單純性肝細(xì)胞脂肪變性模型，在加入油酸的同時，給予不同濃度槲皮素或表兒茶素干預(yù)24 h，檢測各組細(xì)胞內(nèi)TG的變化。結(jié)果如Fig 4所示，各濃度槲皮素和表兒茶素均能明顯降低細(xì)胞內(nèi)TG含量(P<0.05)，其中20 μmol·L-1時抑制效果最好，與油酸模型組相比，表兒茶素的抑制率為24%，槲皮素的抑制率達(dá)到45%。表明黃酮類化合物對單純性肝細(xì)胞脂肪變性具有良好的改善作用。

3 討論

建立肝脂肪變性細(xì)胞模型的關(guān)鍵在于選擇合適的細(xì)胞和誘導(dǎo)劑。大量研究發(fā)現(xiàn)，以油酸或軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性是一種較合適的體外研究NAFLD模型，而其中關(guān)于單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型的研究報道較少[2]。單純性脂肪變性的特征是細(xì)胞內(nèi)TG蓄積，但無明顯氧化應(yīng)激損傷，通常以肝酶ALT、AST以及MDA、SOD等脂質(zhì)過氧化指標(biāo)來判斷是否造成肝損傷[6]。而劉江等[7]僅通過模型組和正常組細(xì)胞內(nèi)MDA無明顯差異，則認(rèn)為所建模型是單純脂肪變性。殷錦錦等[8]通過細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA變化來判斷模型是否存在脂質(zhì)過氧化，這些研究均不能完全說明建立的模型是單純性脂肪變性模型。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，不同游離脂肪酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性時，軟脂酸更易造成細(xì)胞急性脂毒性，而油酸更易被細(xì)胞吸收而引起TG蓄積，這說明油酸比軟脂酸更適合用于建立單純性肝脂肪變性細(xì)胞模型[9]。

Fig 3 Effect of oleic acid on transaminaseactivities and oxidative injury in HepG2 cells

A: ALT and AST activity in cell culture medium; B:Intracellular MDA content; C: SOD activity.*P<0.05vscontrol group

本研究發(fā)現(xiàn)，以0.4 mmol·L-1油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加，表明脂肪變性細(xì)胞模型造模成功。同時測定發(fā)現(xiàn)，該模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST水平無明顯增加，表明該模型無明顯的肝損傷；且細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量無明顯變化，表明該模型不會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，符合單純性脂肪變性模型的特征。Cui 等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，油酸濃度不超過0.4 mmol·L-1時細(xì)胞活力無明顯影響，且細(xì)胞內(nèi)TG含量呈劑量依賴增加，這與本研究結(jié)果一致。Liu等[11]的研究以1 mmol·L-1油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞24 h建立了單純性脂肪變性模型，這可能是由于油酸溶解的方法不同，此方法先用BSA乳化油酸，再使其溶解于培養(yǎng)液中，而油酸必須與BSA分離后才能被細(xì)胞吸收，導(dǎo)致其有效濃度降低。這提示本研究的方法簡單方便，更具可行性。

Fig 4 Inhibitory effects of flavonoids onlipid accumulation in HepG2 cells

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsOA model group

為了進(jìn)一步確定該細(xì)胞模型適用于天然活性物質(zhì)預(yù)防NAFLD的體外研究，本研究選用槲皮素和表兒茶素來評價黃酮類化合物對肝細(xì)胞脂肪變性的改善作用。槲皮素和表兒茶素是水果和蔬菜中常見的2種黃酮類化合物，研究表明其具有良好的降脂活性。本研究結(jié)果顯示，槲皮素和表兒茶素均能明顯抑制細(xì)胞內(nèi)TG聚集，表明該細(xì)胞模型應(yīng)用于植物活性物質(zhì)預(yù)防NAFLD的體外研究是可行的[12]。此外，Zhang等[13]研究認(rèn)為，槲皮素等黃酮類化合物抑制油酸負(fù)荷的肝細(xì)胞內(nèi)TG聚集作用與其細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性密切相關(guān)。但在本研究模型中，HepG2細(xì)胞內(nèi)并無明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，推測槲皮素和表兒茶素等天然活性物質(zhì)抑制該模型細(xì)胞內(nèi)TG聚集作用可能是通過調(diào)節(jié)脂肪酸吸收、甘油三酯合成和分解相關(guān)基因的表達(dá)而實現(xiàn)[14-15]。

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Establishmentandapplicationofhepatocytesteatosismodelsinducedbyoleicacid

DONG Li-hong, ZHANG Rui-fen, HUANG Fei, WEI Zhen-cheng, ZHANG Ming-wei

(SericulturalandAgri-FoodResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences/KeyLabofFunctionalFood,MinistryofAgriculture/GuangdongKeyLabofAgriculturalProductsProcessing,Guangzhou510610,China)

AimTo establish aninvitrocell model for investigating hepatic steatosis in the primary stage of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).MethodsCultured HepG2 cells were divided into different group exposed to different concentrations of oleic acid for 24 h respectively. Lipid droplets in the cells were observed with Oil Red O staining and Nile red staining. The contents of intracellular TG, MDA and SOD and the levels of ALT and AST in the cell supernatant were evaluated to verify the cell model, and the effect of flavonoids on the TG accumulation was observed in oleic acid-induced HepG2.ResultsA large number of lipid droplets were found in the model group with 0.4 mmol·L-1oleic acid, which showed markedly increased level of triglyceride without significant changes of intracellular MDA content and SOD activity and the levels of ALT and AST in the cell supernatant, compared with the control group. Intervention with different doses of quercetin and epicatechin significantly decreased the TG content in the cell model.ConclusionHepatic steatosis HepG2 cell model can be established by 0.4 mmol·L-1oleic acid for the studies on lipid-lowering natural drugs in the prevention of NAFLD.

oleic acid; HepG2 cells; steatosis; triglyceride; cell model; flavonoids

A

1001-1978(2017)11-1622-05

R322.47；R329.24；R344.3；R575.5；R977.6

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.056.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.028

2017-08-06,

2017-09-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31571828)；國家自然科學(xué)基金-廣東聯(lián)合基金資助項目(No U1301211)

董麗紅(1991-)，女，碩士，研究方向：功能食品，E-mail：dolify@163.com； 張名位(1966-)，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：功能食品，通訊作者，E-mail：mwzhh@vip.tom.com