陳 奔，覃梅春，黃金蘭，吳登攀，郭爾楚，許哲郝，劉志萍，鐘振國(guó)

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200；2.徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004)

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

陳 奔1，覃梅春1，黃金蘭2，吳登攀2，郭爾楚1，許哲郝1，劉志萍1，鐘振國(guó)1

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200；2.徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，江蘇 徐州 221004)

目的比較兩種不同的阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)樹(shù)鼩模型大腦神經(jīng)病理改變，探索優(yōu)化的AD樹(shù)鼩模型。方法50只樹(shù)鼩隨機(jī)分為5組：D-半乳糖復(fù)合鵝膏蕈氨酸(IBO)高、低劑量組(腹腔注射D-半乳糖復(fù)合雙側(cè)大腦基底注射IBO)，Aβ25-35復(fù)合IBO高、低劑量組(雙側(cè)基底前腦注射)及對(duì)照組，10只/組。HE染色法觀察各組樹(shù)鼩大腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)；免疫組化法檢測(cè)各組樹(shù)鼩大腦膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和突觸素(SYP)的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)、淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)和磷酸化tau蛋白(p-tau)的表達(dá)。結(jié)果HE染色顯示，造模樹(shù)鼩大腦神經(jīng)細(xì)胞均出現(xiàn)程度不同的形態(tài)損傷改變 ，以D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組和Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組改變明顯；免疫組化染色結(jié)果顯示，造模組的ChAT和SYP的表達(dá)均明顯下降(P<0.01)，其中以Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組下降明顯。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，造模組的Aβ1-42、APP和p-tau的表達(dá)均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，其中以

Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組升高明顯。結(jié)論Aβ25-35合并IBO注射Meynert核損毀造模方法更適合構(gòu)建AD樹(shù)鼩模型。

阿爾茨海默?。粯?shù)鼩；膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶；突觸素；β淀粉樣蛋白；淀粉樣蛋白前體蛋白；磷酸化tau蛋白

目前，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)缺乏特效的治療方法，一方面是由于與人類(lèi)AD類(lèi)似的動(dòng)物模型未能真正建立，鑒于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的昂貴價(jià)格以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R原則，現(xiàn)有AD模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多為嚙齒類(lèi)，其與人類(lèi)的大腦結(jié)構(gòu)多有不同；另一方面，由于AD發(fā)病因素多樣、病理過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜，難將其兼顧模擬。因此，探索新型的AD動(dòng)物模型一直是研究熱點(diǎn)。樹(shù)鼩與人類(lèi)某些基因具有較高的相似性[1]，與靈長(zhǎng)類(lèi)有較高的親緣關(guān)系，且在生理解剖上與人類(lèi)具有極高相似度，因此，以樹(shù)鼩為對(duì)象構(gòu)建的AD模型更能模擬人類(lèi)AD發(fā)病。D-半乳糖復(fù)合鵝膏蕈氨酸(ibotenic acid，IBO)的造模方法是本課題組之前研究的一種成熟的造模方法[2]，β淀粉樣蛋白25-35(amyloid beta 25-35，Aβ25-35)合并IBO致老年癡呆的方法，孔明望等[3]均采用過(guò)，但二者均用大鼠造模。本實(shí)驗(yàn)嘗試以樹(shù)鼩為受試動(dòng)物，以上述兩種AD造模方法進(jìn)行比較，大腦病理學(xué)檢查研究此兩種AD造模方法效果的優(yōu)劣，以期找到以樹(shù)鼩為研究對(duì)象的新型AD動(dòng)物模型。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12月齡中緬樹(shù)鼩滇西亞種50 只，♂，體質(zhì)量(130±10)g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)：SCXK(滇)K2013-0002。引進(jìn)后，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2藥物與試劑D-半乳糖(Sigma公司，批號(hào)：G0625)；鵝膏蕈氨酸(IBO，Sigma公司，批號(hào)：BGBC2055VF)；Aβ25-35(Sigma公司，批號(hào)：053M4804V)；廣譜二抗(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：D-3004)；DAB濃縮型試劑盒(上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：FL-6001)；抗乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransterase，ChAT)抗體(種屬山羊，Abcam公司，貨號(hào)：ab18736)；抗突觸素(synaptophysin，SYP)抗體(種屬兔，Abcam公司，貨號(hào)：ab14692)；抗β樣淀粉蛋白1-42(beta amyloid 1-42，Aβ1-42)抗體(種屬兔，Abcam公司，貨號(hào)：ab39377)；抗淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloidogenic property，APP)抗體(種屬兔，Sigma公司，貨號(hào)：SAB5200113)；抗磷酸化tau蛋白抗體(種屬羊，Santa Cruz公司，貨號(hào)：sc-23468)；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(CST公司，貨號(hào)：#5174)；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(碧云天，貨號(hào)：A0208)；驢抗山羊HRP標(biāo)記二抗(碧云天，貨號(hào)：A0181)；羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(碧云天，A0216)。

1.3儀器正置顯微鏡CX41(OLYMPUS公司)；恒溫烘箱DHG-9023A(上海恒一科學(xué)儀器有限公司)；石蠟切片機(jī)SQ2125(徠克公司)；攤片機(jī)PPTHK-21B(徠克公司)；IMS圖像分析系統(tǒng)(基爾頓生物科技上海有限公司)；D5100數(shù)碼相機(jī)(NIKON公司)；酶標(biāo)儀MK3(芬蘭雷勃)；Mini protean 3 cel電泳儀(Bio-Rad 公司)；電轉(zhuǎn)儀PS-9(大連競(jìng)邁科技有限公司)；成像系統(tǒng)(Tanon-5200)。

2 方法

2.1動(dòng)物分組與溶液配制50只12月齡♂滇西亞種樹(shù)鼩隨機(jī)分為D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組(1.92% D-半乳糖，IBO 5 g·L-1)、D-半乳糖復(fù)合IBO低劑量組(0.96% D-半乳糖，IBO 5 g·L-1)、Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組(Aβ25-3510 g·L-1，IBO 5 g·L-1)、Aβ25-35復(fù)合IBO低劑量組(Aβ25-355 g·L-1，IBO 5 g·L-1)和對(duì)照組，10只/組。Aβ25-35用滅菌生理鹽水分別配制成濃度為5、10 g·L-1Aβ25-35溶液，置37℃培養(yǎng)箱孵育4 d,使其成聚集態(tài)，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。D-半乳糖用滅菌生理鹽水配制成濃度為0.96%、1.92%的D-半乳糖溶液。IBO用滅菌生理鹽水配制成5 g·L-1IBO溶液，-20℃保存。

2.2模型制備D-半乳糖復(fù)合IBO造模組：高、低劑量組按5 mL·kg-1的體積體重比分別腹腔注射1.92%、0.96%的D-半乳糖溶液，每天1次，連續(xù)6周，第7周兩組動(dòng)物均顱內(nèi)雙側(cè)大腦Meynert基底核注射IBO 1 μL。Aβ25-35復(fù)合IBO造模組：動(dòng)物正常飼養(yǎng)6周，在第7周，顱內(nèi)雙側(cè)大腦Meynert基底核注射Aβ25-35與IBO混合液，即Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組注射濃度為10 g·L-1Aβ25-351 μL和IBO 1 μL，Aβ25-35復(fù)合IBO低劑量組注射濃度為5 g·L-1Aβ25-351 μL和IBO 1 μL。對(duì)照組：每日腹腔注射等體積的生理鹽水，第7周顱內(nèi)雙側(cè)大腦Meynert基底核注射生理鹽水2 μL。具體操作方法如下：10%的水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉樹(shù)鼩，將其固定于腦立體定位儀，頭部皮膚備毛，75%乙醇消毒樹(shù)鼩備毛的皮膚，在其兩耳連線中央向鼻尖方向開(kāi)一長(zhǎng)約0.8 cm的切口，鈍性分離筋膜，暴露出顱骨，參照中緬樹(shù)鼩腦立體定位圖譜[4]，于耳間線和矢狀逢交叉點(diǎn)向矢狀縫前8.7 mm，中線旁開(kāi)3 mm處以三棱針鉆孔，顱骨下10 mm緩慢注射(5 min)各組動(dòng)物相應(yīng)藥物(參照前述)，注入完成后，針頭再在原位保留5 min后緩慢拔針，傷口處用生理鹽水清理后縫合，碘酒擦拭，1周后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2.3標(biāo)本制備各組樹(shù)鼩隨機(jī)選取5只，水合氯醛腹腔注射麻醉，快速剝離胸腔，左心室主動(dòng)脈插管，先后以預(yù)冷生理鹽水和4%多聚甲醛溶液沖洗血液，并進(jìn)行心臟灌流，以準(zhǔn)確快速固定腦組織，除顱蓋，取出完整大腦，置于4%多聚甲醛固定液中，用于病理切片待測(cè)。各組樹(shù)鼩再隨機(jī)選取5只，水合氯醛腹腔注射麻醉，快速剝離胸腔，左心室主動(dòng)脈插管，以預(yù)冷生理鹽水快速?zèng)_洗血液，取出完整大腦，用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

2.4大腦HE染色取上述大腦組織，流水沖洗，去除殘留的固定液和雜質(zhì)。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，進(jìn)行烤片和脫蠟、水化、蘇木精染色、伊紅染色，二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。

2.5免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)ChAT與SYP的表達(dá)上述大腦組織脫蠟、水化后，PBS沖洗5 min×3次，置0.01 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓修復(fù)，滴加3%雙氧水，濕盒孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3 min×3次。8%山羊血清封閉10 min后滴加一抗(ChAT 1 ∶1 000，SYP 1 ∶500)，濕盒4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗3 min×3次。滴加HRP標(biāo)記廣譜二抗，室溫濕盒孵育20 min。PBS沖洗3 min×3次。新鮮DAB染色，待切片顏色改變時(shí)，立即用自來(lái)水洗去染色液。切片蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。選取每片鏡頭下上、下、左、右、中5個(gè)視野拍照，采集分析樣本相關(guān)部位，利用IMS圖像分析系統(tǒng)計(jì)算ChAT和SYP陽(yáng)性面積。

2.6免疫印跡法檢測(cè)APP、Aβ1-42、p-tau表達(dá)水平將樹(shù)鼩腦組織剪成細(xì)小的碎片，按每20 mg組織加入150 μL裂解液的比例加入裂解液，勻漿器勻漿至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12 000×g離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后，貯存于-80℃冰箱。制備10%分離膠，半干式轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，4 ℃孵育一抗(Aβ1-421 ∶1 000，APP 1 ∶500，p-tau 1 ∶1 000，GAPDH 1 ∶1 000)過(guò)夜。次日，按照1 ∶1 000稀釋加入相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗，與膜37℃孵育1 h。用TBST洗滌3次后，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白條帶。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析組間差異。

3 結(jié)果

3.1HE染色HE染色鏡下觀察到對(duì)照組樹(shù)鼩大腦組織神經(jīng)元細(xì)胞輪廓清晰，排列整齊，核仁明顯，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)豐富，錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)連接緊密，細(xì)胞未見(jiàn)變形、固縮等改變；D-半乳糖復(fù)合IBO低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)稍顯變化，排列稍稀疏，細(xì)胞核變形，少量突起，細(xì)胞數(shù)量變少；D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組形態(tài)改變明顯，多個(gè)神經(jīng)元變性壞死，排列稀疏、紊亂，嚴(yán)重脫失，胞質(zhì)、胞核界限不明顯，細(xì)胞周?chē)g隙過(guò)大，神經(jīng)纖維排列雜亂，錐體細(xì)胞變小、缺失，有少量神經(jīng)元；Aβ25-35復(fù)合IBO低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，核固縮嚴(yán)重、胞質(zhì)、胞核界限不明顯，細(xì)胞變得稀疏，錐體細(xì)胞變小、缺失；Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組無(wú)完整神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，錐體細(xì)胞變薄，殘留的錐體細(xì)胞變淺，基質(zhì)疏松及微空泡形成(Fig 1)。

3.2免疫組化染色

3.2.1ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞免疫組化染色 Fig 2顯示，對(duì)照組存在大量的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元，其陽(yáng)性物質(zhì)主要存在于胞質(zhì)與胞膜內(nèi)，顯黃色，細(xì)胞排列緊密、整齊；D-半乳糖復(fù)合IBO組的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體破裂縮小，出現(xiàn)核固縮，排列較松散。Aβ25-35復(fù)合IBO組的ChAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，無(wú)完整結(jié)構(gòu)，胞體縮小，出現(xiàn)核固縮、染色加深、排列較松散、陽(yáng)性物質(zhì)較少。Tab 1結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各造模組的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值均有明顯降低(P<0.01)。相同造模組內(nèi)比較：與D-半乳糖復(fù)合IBO低劑量組比較，D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值明顯降低(P<0.01)；與Aβ25-35復(fù)合IBO低劑量組相比，Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值亦明顯降低(P<0.01)。不同造模組間比較：與D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組相比，Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值明顯減少(P<0.01)。

Tab 1 Comparison of choline acetyltransferase(ChAT) positive reaction positive cell area/OD in each group(±s, n=5)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsD-galactose compound IBO low-dose group;△△P<0.01vsAβ25-35compound IBO low-dose group;▲▲P<0.01vsD-galactose compound IBO high-dose group

3.2.2突觸素免疫組化染色 Fig 3顯示，對(duì)照組存在大量的突觸素，大多集中在胞質(zhì)與胞膜內(nèi)，顯黃色，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列緊密；D-半乳糖復(fù)合IBO組突觸素反應(yīng)產(chǎn)物的量明顯減少，細(xì)胞固縮，排列紊亂。Aβ25-35復(fù)合IBO組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量和突觸素反應(yīng)產(chǎn)物明顯減少，核破裂，核仁染色加深。Tab 2結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，造模組的突觸素陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值均有明顯降低(P<0.01)；與低劑量組比

Fig 1 The pathological changes of brain tissues in tree shrews of each group(×40)

A:Control group;B:D-galactose compound IBO low-dose group;C:D-galactose compound IBO high-dose group; D: Aβ25-35compound IBO low-dose group; E: Aβ25-35compound IBO high-dose group

Fig 2 Comparison of choline acetyltransferase positive neurons in each group(×40)

A:Control group;B:D-galactose compound IBO low-dose group;C:D-galactose compound IBO high-dose group; D: Aβ25-35compound IBO low-dose group; E:Aβ25-35compound IBO high-dose group

Fig 3 Changes of synaptophysin immunoreactivity in each group(×40)

A:Control group; B: D-galactose compound IBO low-dose group; C: D-galactose compound IBO high-dose group; D: Aβ25-35compound IBO low-dose group; E: Aβ25-35compound IBO high-dose group

較，兩種造模模式的高劑量組的突觸素陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值均明顯降低(P<0.01)；與D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組相比，Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組的突觸素陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值明顯減少(P<0.01)。

Tab 2 Comparison of synaptophysin(SYP) immunoreactivepositive reaction cell area/OD in each group(±s，n=5)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsD-galactose compound IBO low-dose group;△△P<0.01vsAβ25-35compound IBO low-dose group;▲▲P<0.01vsD-galactose compound IBO high-dose group

3.3APP、Aβ1-42、p-tau灰度值的變化各組樹(shù)鼩腦組織中APP、Aβ1-42、p-tau蛋白印跡的定量分析見(jiàn)Fig 4。① 與空白組比較，0.96%組Aβ1-42、APP、p-tau的灰度值明顯增加(P<0.05)；與0.96%組比較，1.92%組APP、Aβ1-42、p-tau灰度值明顯增多(P<0.05)；② 與空白組比較，5、10 μg組的Aβ1-42、APP、p-tau的灰度值有明顯增加(P<0.01)；與5 μg組比較，

Fig 4 Changes of Aβ1-42,APP and p-tau in each group(±s，n=5)

1:Control group;2:D-galactose compound IBO low-dose group;3:D-galactose compound IBO high-dose group; 4: Aβ25-35compound IBO low-dose group; 5: Aβ25-35compound IBO high-dose group.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vsD-galactose compound IBO low-dose group;##P<0.01vsAβ25-35compound IBO low-dose group;▲P<0.05vsD-galactose compound IBO high-dose group

10 μg組Aβ1-42、APP、p-tau的灰度值有明顯增加(P<0.01)；③ 與1.92%組比較，10 μg組的APP灰度值明顯增加(P<0.05)。提示短期造模方法中的高劑量比長(zhǎng)期造模法中的高劑量方法AD相關(guān)蛋白含量更高。

4 討論

樹(shù)鼩(tree shrew，Tupaiabelangeri)是一類(lèi)外形酷似松鼠的小型哺乳動(dòng)物，1986年Zeller等[5]根據(jù)樹(shù)鼩的頭骨形態(tài)將其建立為一個(gè)獨(dú)立目級(jí)—攀鼩目(Scandentia)。樹(shù)鼩在神經(jīng)發(fā)育、生理解剖、心理應(yīng)激等方面與靈長(zhǎng)類(lèi)甚至人類(lèi)有很強(qiáng)的相似性[6]，同時(shí)其擁有哺乳動(dòng)物里最大腦-體重比，是研究腦功能相關(guān)疾病的理想模型[7]，因此，樹(shù)鼩也是研究AD的理想模型動(dòng)物。李麟仙等[8]就以樹(shù)鼩為模型動(dòng)物，探究了三七總皂苷單體Rb1對(duì)樹(shù)鼩局部腦缺血的保護(hù)作用。

D-半乳糖復(fù)合IBO的造模方法是本課題組之前研究的一種成熟的造模方法[2]，聯(lián)合建立AD模型，在腦組織形態(tài)、生化及臨床檢測(cè)指標(biāo)方面呈現(xiàn)老化特征，從而使模型在神經(jīng)遞質(zhì)變化和腦病理改變等方面更類(lèi)似于AD患者的表現(xiàn)。此外，Aβ25-35腦室注射致癡呆小鼠模型是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的抗老年癡呆模型，但因體內(nèi)存在Aβ自身清除機(jī)制，Aβ在大腦中的沉積達(dá)不到理想效果，應(yīng)用IBO基底前腦注射可破壞模型動(dòng)物腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，造成膽堿能神經(jīng)元丟失，模擬老年性癡呆[9]。但該模型僅模擬了與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損害有關(guān)的信息，且此種損害可逆，不表現(xiàn) AD患者的典型的如神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑等病理學(xué)改變。因此，為互補(bǔ)不足，本研究將Aβ25-35合并IBO共同構(gòu)建樹(shù)鼩AD 模型，同時(shí)，采用D-半乳糖復(fù)合IBO的造模方法，比較兩種以樹(shù)鼩為動(dòng)物載體的AD動(dòng)物模型的最佳造模方式。

實(shí)驗(yàn)證明[10]，腦組織中由APP水解生成的Aβ1-42水平與空間學(xué)習(xí)障礙和長(zhǎng)時(shí)程記憶障礙具有明顯相關(guān)性，為老年癡呆患者認(rèn)知障礙的決定性因素，在認(rèn)知障礙病理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)各種因素導(dǎo)致Aβ空間構(gòu)象發(fā)生錯(cuò)誤折疊，轉(zhuǎn)變成以β折疊為主時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，難以被蛋白酶水解，從而在組織內(nèi)沉積，并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡甚至壞死[11-12]。tau蛋白是神經(jīng)元中主要微管相關(guān)蛋白，正常tau蛋白被磷酸化往往導(dǎo)致始于神經(jīng)元突起末端的神經(jīng)元退行性病變, 最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和癡呆神經(jīng)元細(xì)胞外Aβ的沉積。本研究Western blot結(jié)果顯示，造模后動(dòng)物腦組織內(nèi)的Aβ1-42、APP、p-tau含量均明顯升高，提示造模組開(kāi)始出現(xiàn)AD的病理過(guò)程。在同種造模方式下，高劑量組腦組織內(nèi)Aβ1-42、APP、p-tau含量較低劑量組明顯升高，說(shuō)明兩種不同造模方法下，均以高劑量組的造模效果更好。同時(shí)，比較D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組和Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組的Western blot結(jié)果，Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組有更高的Aβ1-42、APP、p-tau含量。提示Aβ25-35復(fù)合IBO方法的效果優(yōu)于D-半乳糖致亞急性損傷合并IBO核損毀的造模方法。

ChAT的含量和活性與中樞膽堿能系統(tǒng)密切相關(guān)[13]，是大腦膽堿能系統(tǒng)功能的標(biāo)志，而AD患者腦中膽堿能活性降低對(duì)記憶與認(rèn)知障礙的發(fā)生起著重要的作用。ChAT是在膽堿能神經(jīng)元胞體內(nèi)合成的，其標(biāo)志著膽堿能神經(jīng)元的功能強(qiáng)弱；也是催化乙酰膽堿生物合成的限速酶，能間接估計(jì)乙酰膽堿的釋放量[14]，因此，ChAT是反映大腦膽堿能系統(tǒng)功能的重要標(biāo)志酶。突觸素是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì)，參與突觸囊泡的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸囊泡再循環(huán)以及突觸發(fā)生[15]。突觸素的減少意味著突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，突觸傳遞功能受阻，老年學(xué)習(xí)記憶減退與海馬結(jié)構(gòu)突觸素的變化密切相關(guān)。本研究HE染色結(jié)果顯示，造模后動(dòng)物大腦組織神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈排列稀疏、數(shù)量減少、細(xì)胞核變形、胞核界限不明顯等現(xiàn)象，結(jié)合免疫組化和Western blot結(jié)果，與對(duì)照組相比，各模型組樹(shù)鼩腦組織的ChAT和SYP免疫陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值明顯降低，此在一定程度上反映了AD樹(shù)鼩動(dòng)物模型的形成。在同種造模方式下，高劑量組形態(tài)改變明顯，與相應(yīng)低劑量組相比，高劑量組的ChAT和SYP陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)面積/OD值明顯下降，說(shuō)明兩種不同造模方法下，均以高劑量組的造模效果更好。同時(shí)，比較D-半乳糖復(fù)合IBO高劑量組和Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組的形態(tài)特征與免疫組化結(jié)果，Aβ25-35復(fù)合IBO高劑量組表現(xiàn)出更為典型的凋亡染色特征和膽堿能系統(tǒng)功能及突觸素?fù)p害，提示Aβ25-35復(fù)合IBO方法的效果優(yōu)于D-半乳糖致亞急性損傷合并IBO核損毀的造模方法。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Aβ25-35復(fù)合IBO注射大腦Meynert基底核造模與D-半乳糖復(fù)合IBO造模相比，動(dòng)物腦組織產(chǎn)生了更高的Aβ1-42、APP、p-tau含量，同時(shí)表現(xiàn)出更為典型的凋亡染色特征和膽堿能系統(tǒng)功能及突觸素?fù)p害。除此之外，兼考慮Aβ25-35復(fù)合IBO的造模周期短(約1周)，D-半乳糖復(fù)合IBO造模周期長(zhǎng)(7周)，樹(shù)鼩應(yīng)激性強(qiáng)[16]，對(duì)生存環(huán)境要求苛刻，長(zhǎng)期的外部環(huán)境變化與人為干預(yù)會(huì)增加動(dòng)物死亡率等因素，可以認(rèn)為Aβ25-35復(fù)合IBO注射大腦Meynert基底核的方法更適合AD樹(shù)鼩模型。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)于廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝各位老師和同學(xué)的大力幫助。)

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StudyoftwokindsofAlzheimer’sdiseasetreeshrewmodels

CHEN Ben1, QIN Mei-chun1, HUANG Jin-lan2, WU Deng-pan2, GUO Er-chu1, XU Zhe-hao1, LIU Zhi-ping1,ZHONG Zhen-guo1

(1.ScienceExperimentCenter,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530200,China; 2.DeptofPharmacology,XuzhouMedicalUniversity,XuzhouJiangsu221004,China)

AimTo explore the optimized tree shrews model of Alzheimer′s disease through comparison of the pathology changes of brain neurons between the two kinds of tree shrew models.MethodsFifty tree shrews were randomly divided into five groups with 10 in each group: control group, high dose D-galactose combined with ibotenic acid(IBO) group, low dose D-galactose combined with IBO group [intraperitoneal injection D-galactose combined with IBO injection into bilateral basal nucleus of Meynert(BNM)], high dose Aβ25-35combined with IBO group, and low dose Aβ25-35combined with IBO group(injection into bilateral BNM). Hematoxylin and eosin(HE) staining was used to observe the morphological changes of brain neurons. The expressions of choline acetyltransterase(ChAT) and synaptophysin(SYP) in the brains were detected by immunohistochemical staining. Western blot was used to detect the expression of amyloid beta 1-42(Aβ1-42), amyloid precursor protein(APP) and phosphorylated tau protein(p-tau).ResultsThe HE staining showed there were different degrees of morphological changes in the brains of model groups. The changes in the high dose D-galactose and high dose Aβ25-35combined with IBO group were more obvious than those in low dose D-galactose and Aβ25-35combined with IBO group. Immunohistochemical staining revealed that the levels of ChAT and SYP in the model groups decreased compared with control group, and the decline in high dose Aβ25-35combined with IBO group was more marked than that in low dose Aβ25-35combined with IBO group(P<0.01). Western blot revealed that the levels of Aβ1-42, APP, p-tau in the model groups increased compared with control group, and the rise in high dose Aβ25-35combined with IBO group was more apparent than that in low dose Aβ25-35combined with IBO group(P<0.05 orP<0.01).ConclusionThe method of modeling by Aβ25-35combined with IBO injection into bilateral BNM is more suitable for the establishment of Alzheimer’s disease model.

Alzheimer’s disease; tree shrew; ChAT; SYP; Aβ; APP; p-tau

A

1001-1978(2017)11-1617-06

R-332；R363-332；R322.81；R745.702.2；R977.3；R977.6

時(shí)間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.054.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.027

2017-07-19,

2017-08-18

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No 桂科攻1347003-1)

陳 奔(1990-)，男，碩士，助教，研究方向；新藥研究與開(kāi)發(fā)，E-mail: 935527242@qq.com； 鐘振國(guó)(1956-)，男，博士，教授，研究方向：新藥研究與開(kāi)發(fā)，通訊作者，E-mail: gxtcmuzzg@163.com