戎卓娜，李慧玲，董鵬輝，樊婷婷，李 娟，趙 毅，王福金，王愛國，王靖宇

(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大連 116044)

研究報(bào)告

熒光雙向電泳檢測雌雄小鼠肝組織蛋白組學(xué)的差異

戎卓娜，李慧玲*，董鵬輝，樊婷婷，李 娟，趙 毅，王福金，王愛國，王靖宇*

(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大連 116044)

目的檢測雌雄小鼠肝組織蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，探討肝病發(fā)生的性別差異機(jī)制。方法采用雙向熒光差異凝膠電泳(two dimension difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)技術(shù)檢測C57BL/6J雌雄小鼠肝組織的蛋白質(zhì)組差異表達(dá)譜，分離并鑒定差異表達(dá)蛋白，應(yīng)用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括蛋白功能注釋、分類分析、京都基因與基因組百科全書通路分析。結(jié)果經(jīng)雙向熒光差異凝膠電泳-圖像分析得到1767個(gè)蛋白點(diǎn)，其中差異倍數(shù)≥1.5(P< 0.05)的蛋白點(diǎn)325個(gè)。從中選擇78個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，得到48種差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。其中，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中高表達(dá)的蛋白有14種，低表達(dá)的蛋白有34種。選取6個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行Western blot 驗(yàn)證，證明了2D-DIGE結(jié)果的可靠性。GO分析結(jié)果顯示，涉及雌雄鼠肝組織中的差異蛋白在細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過程中的分布廣泛。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白涉及6條信號(hào)通路。結(jié)論C57BL/6J雌雄小鼠肝組織的差異性蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果為研究性別差異性肝病發(fā)生的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)生物學(xué)信息和有益的線索。

肝；性別差異；蛋白質(zhì)組學(xué)；生物信息學(xué)；雙向熒光差異凝膠電泳

肝病的雄性傾向性是哺乳動(dòng)物的顯著特征[1-5]，說明哺乳動(dòng)物具有相似的性別差異性肝病發(fā)生機(jī)制，但其分子機(jī)制尚不清楚。近年，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析的飛速發(fā)展，為從整體、動(dòng)態(tài)、定量水平研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供了關(guān)鍵性技術(shù)方法和重要信息[6]。本研究采用雙向熒光差異凝膠電泳分析法，首次對(duì)C57BL/6J品系雌雄小鼠肝組織進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組學(xué)檢測和相應(yīng)的生物信息學(xué)分析，為以小鼠為動(dòng)物模型的肝病的性別差異性發(fā)生機(jī)制研究提供基礎(chǔ)生物學(xué)信息。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠3只，9月齡，體重24～27 g，雌性小鼠3只，15月齡，體重24～27 g，小鼠的繁育飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF區(qū)進(jìn)行[SCXK(遼)2013-0003][SYXK(遼)2013-0006]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(ICUC)批準(zhǔn)號(hào)：L20130326。

1.2主要試劑與儀器

Cy2，Cy3，和Cy5購自英國GE Healthcare Bio-Sciences公司；二甲基甲酰胺購自美國Aldrich公司；尿素、瓊脂糖、甘油、溴酚藍(lán)、CHAPS、SDS、碘乙酰胺、過硫酸銨、TEMED、IPG凝膠(24 cm，pH3～10)購自美國Bio-Rad；蛋白酶抑制劑混合物購自瑞士Roche Applied Science；胰蛋白酶(測序級(jí))購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；GelDocTMEZ成像儀(美國Bio-RAD)；質(zhì)譜儀(AutoFlex，德國Bruker公司)；紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)、xMark酶標(biāo)儀等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織樣本的采集和蛋白質(zhì)提取

宏觀解剖分別采集C57BL/6J雄性和雌性小鼠的肝組織，剪成約1 cm3大小的組織塊，置于冷凍管中液氮凍存。組織塊液氮研磨，加入1 mL裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，30 mmol/L Tris-Cl pH 8.5，磷酸酶抑制劑)，超聲破碎10 s， 14 000 r/min 離心30 min。用Bradford蛋白濃度測定試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，并用SDS-PAGE確認(rèn)。

1.3.2 DIGE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和熒光染料標(biāo)記

在3只雌性或3只雄性小鼠的肝組織蛋白樣本中各取50 μg進(jìn)行等量混合，分別獲得雄性(M)和雌性(F)肝組織混合蛋白樣本。雌雄肝組織混合樣本分別以Cy3和Cy5進(jìn)行熒光標(biāo)記，兩者再進(jìn)行等量混合為內(nèi)標(biāo)，以Cy2進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.3.3 雙向電泳

IPG膠條(24 cm，pH 3～10)置于IPGphor水平電泳儀(Bio-Rad)上進(jìn)行水化和聚焦，取1.3.2中樣本的等量混合液進(jìn)行2D-DIGE，電泳條件280 kVh(30 min內(nèi)達(dá)到250 V，1000 V穩(wěn)定1 h，5 h內(nèi)達(dá)到10000 V，10000 V維持到60 kVh)。等電聚焦結(jié)束后，IPG膠條先后在十二烷基磺酸鈉平衡液(0.5%DTT)和平衡液II(4.5%碘乙酰胺)中各平衡15 min；將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移至12%的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上端，設(shè)置功率，避光條件下進(jìn)行垂直電泳，直至溴酚藍(lán)達(dá)膠底線，然后用Typhoon 9410激光共聚焦掃描儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行成像，各個(gè)熒光染料激發(fā)/吸收特異波長設(shè)置分別為Cy2(488/520 nm)，Cy3(532/580 nm)和Cy5(633/670 nm)。同時(shí)取未標(biāo)記的蛋白內(nèi)標(biāo)樣品1 mg進(jìn)行雙向電泳，具體操作同熒光染色樣本。電泳結(jié)束后，先用超敏考馬斯亮藍(lán)染色液染色，再掃描成像，用于質(zhì)譜分析。

1.3.4 圖像分析

雙向熒光差異凝膠電泳圖譜用SameSpots軟件分析，觀察蛋白的變化趨勢。同時(shí)，將一張分析過的圖像用于切膠圖像(SpotPicking)，與1 mg內(nèi)標(biāo)樣品的制備膠的染色點(diǎn)進(jìn)行匹配。選擇倍數(shù)≥1.5(P< 0.05)的斑點(diǎn)為差異蛋白點(diǎn)。

1.3.5 差異蛋白的膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定

采集差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)過清洗和脫色，脫水干燥，37℃酶解15 h。收集上清，提取蛋白并凍干。將蛋白樣本復(fù)溶，點(diǎn)靶于MALDI金屬盤上，4700 MALDI-TOF-MS串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫檢索差異蛋白名稱

應(yīng)用MASCOT軟件對(duì)上述質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)在NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)：種類為Mus musculus；酶為胰蛋白酶，允許1個(gè)漏切位點(diǎn)；肽質(zhì)量容忍差異為0.2；MS/MS容忍差異為0.3。

1.3.7 蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證2D-DIGE檢測結(jié)果

RIPA裂解液提取C57BL/6J雌雄小鼠肝臟組織的總蛋白(4只/組)，Bradford試劑盒測定樣本蛋白濃度。將30 μg的蛋白樣品在12%的SDS-PAGE上進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用EPHX2、CA3、FBP1、ARHGDIA(Abcam)和SCP2、Albumin(Bioworld)一抗以及HRP標(biāo)記山羊抗兔(ABclonal)二抗孵育后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Advansta，USA)顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，Bradford染色作為上樣內(nèi)參。

1.4生物信息學(xué)分析

用DAVID軟件(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對(duì)鑒定的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析，對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能注釋和分類，包括Cellular component(CC)、Molecular function(MF)和Biological Process(BP)分析；以及對(duì)差異蛋白進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)的通路富集分析。

2 結(jié)果

2.12D-DIGE圖譜和分析結(jié)果

將雌鼠和雄鼠的肝組織蛋白樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記和電泳后，分別經(jīng)488、532、633 nm波長的激光進(jìn)行掃描，即獲得內(nèi)標(biāo)圖譜、雌鼠肝組織蛋白圖譜、雄鼠肝組織蛋白圖譜共3張，然后用SameSpots分析軟件進(jìn)行分析，并將圖譜疊加(圖1)。雌雄小鼠肝組織蛋白樣本中共檢測到蛋白質(zhì)斑點(diǎn)1767個(gè)。

注：A：3個(gè)不同熒光標(biāo)記樣品的疊加圖像；B：Cy2標(biāo)記的混合蛋白樣本內(nèi)標(biāo)；C：Cy3標(biāo)記的雄鼠肝組織蛋白樣本；D：Cy5標(biāo)記的雌鼠肝組織蛋白樣本。圖1 C57BL/6J雄鼠和雌鼠肝組織蛋白表達(dá)的雙向熒光差異凝膠電泳圖譜Note.A: The merged images of different fluorescent labeled samples; B: Cy2 labeled mixed protein samples; C: Cy3 labeled liver tissue protein samples of male mice; D: Cy5 labeled liver tissue protein samples of female mice.Fig.1 Images of gender differentially expressed proteins in C57BL/6J mouse liver tissues detected by two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis

Uniprot編號(hào)AccessionNo．相對(duì)分子量MW等電點(diǎn)pI蛋白質(zhì)名稱ProteinnamesP07724686477575血清白蛋白(serumalbumin，Alb)P11588207633496主要尿蛋白1(majorurinaryprotein1，MUP?1)P16015293476689碳酸酐酶3(carbonicanhydrase3，Ca3)P24270597576772過氧化氫酶(catalase，Cat)P27773566427588蛋白二硫鍵異構(gòu)酶A3(proteindisulfide?isomeraseA3，PDIA3)P32020590878716固醇載體蛋白2(sterolcarrierprotein2，SCP2)P34914624746585雙功能環(huán)氧化物水解酶2(bifunctionalepoxidehydrolase2，Ephx2)P63017708272537熱休克蛋白8(heatshockprotein8，Hsp8)Q03265597156922ATP合酶亞基α(ATPsynthasesubunitalpha，ATP5A1)Q63880578215543羧酸酯酶3A羧酸酯酶3A(carboxylesterase3A，Ces3a)Q8C1961645137648氨甲酰磷酸合酶(carbamoyl?phosphatesynthase，CPS1)Q8R0Y6986465564醛脫氫酶家族1成員L1(aldehydedehydrogenasefamily1memberL1，ALDH1L1)Q921I1766737694血清鐵蛋白(serotransferrin，Trf)Q9R0N0422684517半乳糖激酶(galactokinase，Galk1)

表2 雄鼠肝組織低表達(dá)差異蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2雌雄小鼠肝臟組織中差異表達(dá)蛋白的篩選和鑒定

采用SameSpots軟件對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析和篩選。篩選條件：蛋白質(zhì)差異在1.5倍以上(P< 0.05)。比較后共分析出325個(gè)差異點(diǎn)。其中，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中高表達(dá)的蛋白點(diǎn)共計(jì)155個(gè)，低表達(dá)的蛋白點(diǎn)共計(jì)170個(gè)。對(duì)篩選出來的差異蛋白點(diǎn)，隨機(jī)選取78個(gè)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。結(jié)果顯示，這些鑒定的所有蛋白點(diǎn)均獲得了較好的質(zhì)譜圖。將肽質(zhì)量指紋圖譜和MS/MS數(shù)據(jù)提交MASCOT進(jìn)行在線檢索，共成功檢索出48種蛋白。其中，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中高表達(dá)的蛋白14種(表1)，低表達(dá)的蛋白34種(表2)。

2.3鑒定結(jié)果的蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證

在鑒定出的雌雄小鼠肝臟組織差異表達(dá)蛋白中選取EPHX2、SCP2、CA3、FBP1、ARHGDIA和Albumin 6個(gè)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證。結(jié)果如圖2所示，與雌性小鼠的肝組織相比，EPHX2、SCP2和CA3在雄性小鼠肝組織中的表達(dá)明顯升高，F(xiàn)BP1和ARHGDIA在雄性小鼠肝組織中的表達(dá)明顯降低。這些結(jié)果與2D-DIGE的鑒定結(jié)果一致，說明了2D-DIGE結(jié)果的可靠性。但是，Albumin的蛋白表達(dá)在雌雄小鼠間未見明顯差異，在2D-DIGE鑒定的78個(gè)蛋白點(diǎn)中，有9個(gè)點(diǎn)鑒定為Albumin。這表明Albumin在雌雄小鼠間可能存在轉(zhuǎn)錄剪切或翻譯后修飾的顯著差異。

2.4差異蛋白的GO分析

將所有差異蛋白進(jìn)行GO分析(表3)，共涉及26條分子功能，其中包含蛋白數(shù)量最多的前10種分子功能為：poly(A)RNA結(jié)合、酶結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、受體結(jié)合、催化活性、解折疊蛋白結(jié)合、ATPase活性、鈣粘蛋白結(jié)合參與細(xì)胞間粘附、泛素蛋白連接酶結(jié)合和蛋白復(fù)合物結(jié)合。共涉及28條細(xì)胞組分，其中包含蛋白數(shù)量最多的前十種細(xì)胞組分為：胞外體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、胞質(zhì)溶膠、線粒體、細(xì)胞外空間、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、蛋白復(fù)合物、胞外區(qū)和髓鞘。共涉及40條生物學(xué)功能，其中包含蛋白數(shù)量最多的前十種生物學(xué)功能為：運(yùn)輸、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、代謝過程、蛋白質(zhì)折疊、脂代謝過程、氧化還原過程、對(duì)藥物的反應(yīng)、響應(yīng)活性氧、ATP代謝過程和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。以上結(jié)果表明，雌雄小鼠肝臟差異蛋白在分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)功能中都存在廣泛而顯著的差異。

注：1～8數(shù)字分別代表不同個(gè)體的C57BL/6J小鼠。圖2 蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證雌雄小鼠肝臟組織差異表達(dá)蛋白Note.1～8 numbers indicate the different individuals of C57BL/6J mice.Fig.2 Validation of the differentially expressed proteins between females and males by Western blot assay

表3 雌雄小鼠肝組織差異蛋白GO富集分析結(jié)果

表4 雌雄小鼠肝組織差異蛋白的KEGG通路數(shù)據(jù)庫富集分析結(jié)果

2.5差異蛋白的KEGG分析

對(duì)所有差異蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，共發(fā)現(xiàn)了6個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝通路(表4)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、氧化磷酸化、阿爾茨海默病、PPAR信號(hào)通路、帕金森病和甲狀腺激素合成。

3 討論

我們的前期研究結(jié)果表明，在Ras癌基因誘導(dǎo)的，以C57BL/6J為遺傳背景的肝癌小鼠動(dòng)物模型中[3]，肝腫瘤的發(fā)生主要集中在雄鼠的中年階段和雌鼠的老年階段，并存在顯著的差異(肝腫瘤發(fā)生率：9月齡雄鼠為100%，15月齡雌鼠為34.62%)。由此，本研究選擇9月齡雄鼠和15月齡雌鼠作為研究對(duì)象。通過2D-DIGE分析，與雌鼠相比，雄鼠肝組織中下調(diào)的蛋白34個(gè)，上調(diào)蛋白14個(gè)，涉及廣泛的細(xì)胞生物學(xué)功能和代謝通路。

適當(dāng)?shù)腞OS水平對(duì)正常細(xì)胞的生理過程具有重要的調(diào)節(jié)作用，但過量的ROS又是參與細(xì)胞病變過程的重要因素[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，三種參與ROS代謝的關(guān)鍵酶(GPX1，Prdx6，CAT)在雌雄小鼠肝組織中的表達(dá)具有顯著的差異。其中，GPX1和Prdx6在雄性C57BL/6J小鼠肝組織內(nèi)的表達(dá)較雌性小鼠顯著降低(GPX1下降5.31倍，Prdx6下降2.7倍)。GPX1是線粒體中重要的抗氧化酶，主要負(fù)責(zé)消除線粒體內(nèi)H2O2的水平，從而抵抗或阻止ROS蓄積所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[8]。Prdx6是抗氧化蛋白超家族成員之一，是具有GPX和Ca2+非依賴性磷脂酶A2雙重酶活性的蛋白。體外研究表明，小鼠表皮細(xì)胞過表達(dá)Prdx6具有抵抗氧化應(yīng)激損傷的作用[9]。GPX1和Prdx6的顯著降低可能會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠肝細(xì)胞中的ROS水平偏高，肝細(xì)胞易受損傷，進(jìn)而有利于肝病的發(fā)生發(fā)展。另外，KEGG富集分析結(jié)果顯示，線粒體中氧化磷酸化通路發(fā)生了顯著變化，其中的相關(guān)蛋白在雄性小鼠肝細(xì)胞中普遍降低，這可能會(huì)進(jìn)一步提升雄性小鼠肝細(xì)胞中的ROS水平。有趣的是，CAT在雄性C57BL/6J小鼠肝組織內(nèi)的表達(dá)較雌性小鼠顯著升高(1.6倍)。CAT主要功能是分解H2O2為H2O和O2，與SOD、POD共同組成抗氧化酶系統(tǒng)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平[10]。CAT的顯著升高可能是低水平GPX1和Prdx6的代償性補(bǔ)充，以維持雄性肝細(xì)胞的正常ROS水平和生理功能，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

肝臟是生物體脂質(zhì)代謝的中樞器官，而脂質(zhì)代謝紊亂又是誘發(fā)或影響肝病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[11]。本研究的KEGG通路富集分析數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的PPAR信號(hào)通路在雌雄小鼠的肝組織中具有顯著的差異，其中檢測到的差異蛋白為Scp2、ApoA1、FABP1和FABP5，與雌性小鼠相比，Scp2在雄性小鼠中上調(diào)，其他蛋白均下調(diào)。Scp2是膽固醇代謝的重要調(diào)節(jié)因子，不僅參與膽固醇的生物合成和轉(zhuǎn)化，還是膽固醇的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Liu等研究表明，中草藥當(dāng)歸可顯著下調(diào)肝組織Scp2的表達(dá)進(jìn)而抑制脂肪肝的發(fā)生[12]。因而，Scp2在雄性小鼠肝組織中的顯著升高可能會(huì)導(dǎo)致膽固醇在雄性肝細(xì)胞中的蓄積，進(jìn)而影響肝病的進(jìn)展。ApoA1作為卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的載脂蛋白，主要參與膽固醇由外周組織向肝臟的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。而FABP1和FABP5均為脂肪酸結(jié)合蛋白家族的成員，其中FABP5不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸為細(xì)胞生長提供能量及原材料，而且可以結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)各種配體，參與腫瘤生長相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。這些脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白在脂肪肝及肝腫瘤中都具有重要的作用，然而，它們的顯著下降對(duì)雄性傾向性肝病病變過程的影響尚有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)首次檢測了C57BL/6J雌雄小鼠肝臟組織的差異性蛋白表達(dá)，為研究性別差異性肝病發(fā)生的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)生物學(xué)信息和有益的線索。

[1] Bianco T, Cillo U, Amodio P, et al. Gender differences in the quality of life of patients with liver cirrhosis related to hepatitis C after liver transplantation[J]. Blood Purif, 2013, 36(3-4): 231-236.

[2] Pan JJ, Fallon MB. Gender and racial differences in nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Hepatol, 2014, 6(5): 274-283.

[3] Wang AG, Moon HB, Lee MR, et al. Gender-dependent hepatic alterations in H-ras12V transgenic mice[J]. J Hepatol, 2005, 43(5): 836-844.

[4] 定明, 何允剛, 張小飛, 等.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定白化黑線倉鼠皮膚白化相關(guān)差異蛋白質(zhì)[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2014,22(1):79-82.

[5] 李順,陳麗香,彭秀華, 等.小鼠肝癌模型研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2016,24(2):213-216.

[6] Boguski MS, McIntosh MW. Biomedical informatics for proteomics[J]. Nature, 2003, 422(6928): 233-237.

[7] Holbrook NJ, Ikeyama S. Age-related decline in cellular response to oxidative stress: links to growth factor signaling pathways with common defects[J]. Biochem Pharmacol, 2002, 64(5-6): 999-1005.

[8] Thu VT, Kim HK, Ha SH, et al. Glutathione peroxidase 1 protects mitochondria against hypoxia/reoxygenation damage in mouse hearts[J]. Pflugers Arch, 2010, 460(1): 55-68.

[9] Shibata S, Shibata N, Shibata T, et al. The role of Prdx6 in the protection of cells of the crystalline lens from oxidative stress induced by UV exposure[J]. Jpn J Ophthalmol, 2016, 60(5): 408-418.

[10] Jadeja RN, Urrunaga NH, Ahmad D, et al. Data regarding M1 muscarinic receptor-mediated modulation of hepatic catalase activity in response to oxidative stress[J]. Data Brief, 2016, 6: 405-409.

[11] Cohen JC, Horton JD, Hobbs HH. Human fatty liver disease: old questions and new insights[J]. Science, 2011, 332(6037): 1519-1523.

[12] Lu X, Yuan ZY, Yan XJ, et al. Effects of Angelica dahurica on obesity and fatty liver in mice[J]. Chin J Nat Med, 2016, 14(9): 641-652.

[13] Fernandez-Miranda C, Perez-Carreras M, Colina F, et al. A pilot trial of fenofibrate for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Dig Liver Dis, 2008, 40(3): 200-205.

[14] 周玲麗, 曹驥, 李薇, 等.RNA干擾 FABP5基因?qū)θ烁伟?HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(4): 603-608.

DifferentialproteomicanalysisoflivertissuesbetweenmaleandfemaleC57BL/6Jmiceby2D-DIGE

RONG Zhuo-na， LI Hui-ling*， DONG Peng-hui， FAN Ting-ting， LI Juan， ZHAO Yi， WANG Fu-jin， WANG Ai-guo， WANG Jing-yu*

(Laboratory Animal Center, Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

ObjectiveTo identify the differential proteomic expressions between the liver tissues of male and female mice, and investigate the mechanisms underlying gender differences in liver diseases.MethodsTwo-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) were used to identify the differentially expressed proteins in the liver tissues of male and female C57BL/6J mice. The differentially expressed proteins were validated by Western blot and further analyzed by bioinformatics, including Gene Ontology (GO) analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).ResultsAmong the auto-detected 1767 protein spots by 2D-DIGE, 325 protein spots were differentially expressed (|ratio|≥1.5,P< 0.05) between the liver tissues of male and female mice, in which 78 spots were randomly selected for MALDI-TOF-MS identification and finally 48 distinct proteins were obtained. Compared with females, 14 and 34 proteins were up- or down-regulated in males, respectively. Among them, 6 differentially expressed proteins were validated by Western blot which confirmed the reliability of 2D-DIGE results.GO analysis showed that the differentially expressed proteins in the liver tissues of male and female mice are associated to various cellular component, molecular function and biological process. 6 pathways were significantly different between the liver tissues of males and females depending on KEGG analysis.ConclusionsThe proteomic data and related analysis of the liver tissues of C57BL/6J mice offer crucial clues for elucidating the underlying mechanisms of different gender effects on liver diseases.

Liver; Gender difference; Proteomic; Bioinformatics; Two dimension difference gel electrophoresis, 2D-DIGE

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0016-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.004

2017-02-19

遼寧省教育廳科學(xué)規(guī)劃課題(L2014341)；國家自然科學(xué)基金(30872950)。

戎卓娜，女，碩士，研究方向：肝腫瘤發(fā)生分子機(jī)制的研究。E-mail: rongzhuona@163.com

李慧玲，女，碩士，講師，研究方向：肝腫瘤發(fā)生分子機(jī)制的研究。E-mail: 5421992@qq.com。

王靖宇，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物行為學(xué)和分子生物學(xué)。E-mail: wangjingyus@163.com。*共同通訊