彭卓穎，李 想，叢 喆，薛 婧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

流式細(xì)胞術(shù)分析PMA誘導(dǎo)THP-1分化為巨噬細(xì)胞的表型特征

彭卓穎，李 想，叢 喆*，薛 婧*

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，新發(fā)再發(fā)傳染病動(dòng)物模型研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的用流式細(xì)胞術(shù)明確單獨(dú)使用PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化而來(lái)的巨噬細(xì)胞的分化情況。方法首先用PMA刺激THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，再分別使用LPS、IFN-γ和IL-6將細(xì)胞誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞，用IL-4、IL-13和IL-6將細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞。顯微鏡下觀察三種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各細(xì)胞主要CD分子表達(dá)的差異。結(jié)果當(dāng)THP-1分化為巨噬細(xì)胞后變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈較規(guī)則的圓形或橢圓形；M1和M2細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞突起較明顯，細(xì)胞顆粒度較大。巨噬細(xì)胞表面與抗原提呈功能相關(guān)的CD分子的表達(dá)均較低，大部分呈陰性；而M1和M2細(xì)胞表面這些CD分子的表達(dá)均較高。結(jié)論單獨(dú)使用PMA刺激THP-1細(xì)胞所分化而來(lái)的巨噬細(xì)胞抗原提呈能力較弱，基本處于靜息狀態(tài)。

THP-1；巨噬細(xì)胞；佛波酯；流式細(xì)胞術(shù)

巨噬細(xì)胞(macrophage，Mφ)是一類由血液中單核細(xì)胞分化而來(lái)的固有免疫細(xì)胞，在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]。但是由于細(xì)胞數(shù)量少，分離過(guò)程較繁瑣[2,3]，因此多用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞系分化而成的THP-1-Mφ作為研究巨噬細(xì)胞功能的體外細(xì)胞模型[4]。雖然目前THP-1-Mφ細(xì)胞是比較通用的巨噬細(xì)胞模型，但是此細(xì)胞的分化特征尚不明確，這將影響對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)的分析。本文主要利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分化所得巨噬細(xì)胞的特征進(jìn)行分析，首先用不同細(xì)胞因子組合對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行刺激，分別誘導(dǎo)出Mφ、M1和M2三種細(xì)胞，比較以上細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并用流式檢測(cè)各細(xì)胞主要CD分子表達(dá)的差異，以期明確THP-1-Mφ細(xì)胞的分化情況。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞

THP-1細(xì)胞，外周血的人單核細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2細(xì)胞因子

Recombinant Human IFN-γ(300-02)、Recombinant Human IL-13(200-13)和Recombinant Human IL-4(200-04)購(gòu)自Peprotech公司，Recombinant Human IL-6 Protein(206-IL)購(gòu)自R&D公司，PMA(P1585)和LPS(L4391)購(gòu)自Sigma公司。

1.3流式抗體

流式抗體PE anti-human CD16 Antibody(3G8)、PE anti-human CD68 Antibody(Y1/82A)、FITC anti-human CD80 Antibody(2D10)、APC anti-human CD83 Antibody(HB15)、PE anti-human CD86 Antibody(IT2.2)、PE anti-human CD1a Antibody(HI149)、APC anti-human CD11c Antibody(3.9)均購(gòu)自Biolegend公司；流式抗體PE Mouse Anti-Human CD14(M5E2)、PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD209(DCN46)、APC Mouse Anti-Human HLA-DR(G46-6)、FITC Mouse Anti-Human CD163(GHI/61)、PE Mouse Anti-Human CD206(19.2)均購(gòu)自BD公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 PMA和細(xì)胞因子誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞定向分化[4,5]

取9×106個(gè)正常THP-1于T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入終濃度為50 ng/mL的PMA。2 d后細(xì)胞進(jìn)行換液處理，一部分細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)；一部分細(xì)胞中加入終濃度均為20 ng/mL的LPS、IFN-γ和IL-6，使細(xì)胞向THP-1-M1方向分化；另一部分細(xì)胞中加入終濃度均為20 ng/mL的IL-4、IL-13和IL-6，誘導(dǎo)細(xì)胞向THP-1-M2方向分化。THP-1-M1和THP-1-M2細(xì)胞于第5天進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.4.2 胞外流式染色

用胰酶將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的貼壁細(xì)胞消化下來(lái)，PBS緩沖液洗2次(4℃ 1500 r/min離心3 min)，用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升1×107個(gè)，混勻后在每個(gè)流式管中加入100 μL細(xì)胞懸液，向每管內(nèi)加入相應(yīng)流式抗體，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，2 mL PBS緩沖液洗2次，300 μL PBS重懸細(xì)胞，過(guò)濾后上機(jī)。

1.4.3 胞內(nèi)流式染色[6]

同上將細(xì)胞加入流式管內(nèi)，向每管中加入200 μL IC fixation buffer，4℃避光孵育20 min，隨后用2 mL破膜液洗2次，100 μL破膜液重懸細(xì)胞，向每管中加入對(duì)應(yīng)流式抗體，混勻后4℃避光孵育30 min，破膜液洗2次，PBS緩沖液洗1次，將細(xì)胞懸液過(guò)濾后上機(jī)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1THP-1分化為不同細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變

THP-1細(xì)胞形態(tài)飽滿、大小均一、折光性較好，為懸浮生長(zhǎng)單個(gè)細(xì)胞(圖1A)；PMA刺激2 d后，誘導(dǎo)分化的THP-1-Mφ細(xì)胞全部貼壁，大部分細(xì)胞仍呈圓形或橢圓形，聚團(tuán)生長(zhǎng)較明顯(圖1B)；繼續(xù)向其中加入細(xì)胞因子LPS、IFN-γ和IL-6，誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化為THP-1-M1細(xì)胞后，形態(tài)更為多樣，部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，且細(xì)胞膜上的突起十分明顯(圖1C)；而繼續(xù)加入IL-4、IL-13和IL-6誘導(dǎo)分化出的THP-1-M2細(xì)胞，形態(tài)與THP-1-M1細(xì)胞較相似，但長(zhǎng)梭形細(xì)胞相對(duì)較少(圖1D)。

注：“……”同型對(duì)照；“-”CD14和CD68；A：使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD分子的表達(dá)情況；B：利用統(tǒng)計(jì)圖比較不同細(xì)胞上CD分子表達(dá)情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05。圖2 CD14和CD68分子在不同巨噬細(xì)胞上表達(dá)的差異Note: “……” Isotype control; “-”CD14 and CD68；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ, * P< 0.05.Fig.2 Expression of CD14 and CD68 in different macrophage subsets

2.2單核巨噬細(xì)胞特異性分子CD14、CD68在各細(xì)胞中的表達(dá)

THP-1、THP-1-M1和THP-1-M2細(xì)胞表面均可高表達(dá)CD14分子，表達(dá)量分別為(85.8±6.93)%、(89.25±8.42)%和(82.20±8.62)%；而PMA刺激分化的THP-1-Mφ細(xì)胞表面CD14的表達(dá)僅為(43.1±2.95)%。與之相反，CD68分子在THP-1與THP-1-Mφ細(xì)胞內(nèi)均高表達(dá)，當(dāng)繼續(xù)分化為THP-1-M1后CD68的表達(dá)也并未發(fā)生明顯變化(P=0.7709)；而THP-1-M2細(xì)胞內(nèi)CD68的表達(dá)則出現(xiàn)了較明顯的降低(P=0.0129)，表達(dá)量為(53.45±1.62)%(圖2)。

注：“……”同型對(duì)照；“-”CD16,CD80和CD86；A：使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD分子的表達(dá)情況；B：利用統(tǒng)計(jì)圖比較不同細(xì)胞上CD分子表達(dá)情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖3 CD16,CD80和CD86分子在不同巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的差異Note: “……” Isotype control；“-” CD16,CD80 and CD86；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.3 Differences in the expression of CD16,CD80 and CD86 in different macrophage subsets

2.3M1型巨噬細(xì)胞特異性分子CD16、CD80和CD86在各細(xì)胞中的表達(dá)

CD16、CD80和CD86等分子的表達(dá)是判斷M1型巨噬細(xì)胞分化情況的指標(biāo)。如圖3所示，THP-1分化出的THP-1-Mφ細(xì)胞表面CD16和CD80的表達(dá)基本未發(fā)生變化，CD86分子的表達(dá)量增加到(14.59±2.98)%(P=0.0270)；當(dāng)THP-1-Mφ繼續(xù)分化為THP-1-M1后，CD16分子的表達(dá)出現(xiàn)小幅度升高，而CD80和CD86的表達(dá)卻出現(xiàn)了非常明顯的上升(P值分別為0.0063和0.0082)，表達(dá)量分別達(dá)到(75.85±8.41)%和(69.65±6.43)%；分化出的THP-1-M2細(xì)胞表面CD16分子的表達(dá)有所降低，但其變化并無(wú)顯著性差異，CD80和CD86的表達(dá)情況與THP-1-M1細(xì)胞基本相同。

2.4M2型巨噬細(xì)胞特異性分子CD163、CD206和CD209在各細(xì)胞中的表達(dá)

較常用于鑒定THP-1-M2細(xì)胞分化情況的CD分子為CD163、CD206和CD209。正常THP-1、THP-1-Mφ和THP-1-M1細(xì)胞內(nèi)CD163分子的表達(dá)量均較低；CD206分子在以上三種細(xì)胞表面的表達(dá)基本為陰性；CD209在THP-1和THP-1-M1細(xì)胞表面的表達(dá)量分別為(24.10±5.37)%和(44.75±7.99)%，而在THP-1-Mφ細(xì)胞表面的表達(dá)基本呈陰性；分化成的THP-1-M2細(xì)胞可低表達(dá)CD206分子，而且CD163和CD209分子的表達(dá)均出現(xiàn)了明顯的增加，表達(dá)量分別為(64.90±0.71)%和(89.20±5.06)%(圖4)。

注： “……”同型對(duì)照；“-”CD163,CD206和CD209；A：使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD分子的表達(dá)情況；B：利用統(tǒng)計(jì)圖比較不同細(xì)胞上CD分子表達(dá)情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖4 CD163,CD206和CD209分子在不同巨噬細(xì)胞上表達(dá)的差異Note: “……” Isotype control；“-” CD163,CD206 and CD209；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.4 Differences in the expression of CD163,CD206 and CD209 in different macrophage subsets

2.5與抗原提呈功能相關(guān)的CD分子的表達(dá)情況

THP-1細(xì)胞表面CD83、CD11c和HLA-DR的表達(dá)均較高，表達(dá)量分別達(dá)到(54.75±7.84)%、(76.15±9.12)%和(94.25±2.89)%，CD1a分子的表達(dá)呈陰性。THP-1-M1和THP-1-M2細(xì)胞則高表達(dá)這幾個(gè)分子。與之相反，THP-1-Mφ細(xì)胞CD1a的表達(dá)仍為陰性，CD83分子的表達(dá)明顯降低(P=0.0498)，CD11c和HLA-DR的表達(dá)更是顯著下降，P值分別為0.0073和0.0027(圖5)。

注：“……”同型對(duì)照；“-”CD83,CD1a,CD11c和HLA-DR；A：使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD分子的表達(dá)情況；B：利用統(tǒng)計(jì)圖比較不同細(xì)胞上CD分子表達(dá)情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖5 CD83,CD1a,CD11c和HLA-DR分子在不同巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的差異Note: “……” Isotype control；“-” CD83,CD1a,CD11c and HLA-DR；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.5 Differences in the expression of CD83,CD1a,CD11c and HLA-DR in different macrophage subsets

3 討論

巨噬細(xì)胞是一種具有可塑性和多功能性的固有免疫細(xì)胞，當(dāng)體內(nèi)外微環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，巨噬細(xì)胞可向不同亞型進(jìn)行分化，其中研究較多的為M1和M2型巨噬細(xì)胞。M1細(xì)胞可分泌促炎因子，在炎癥早期發(fā)揮作用；M2細(xì)胞可分泌抑制炎癥因子，發(fā)揮組織修復(fù)作用[7,8]。而對(duì)巨噬細(xì)胞的功能性研究主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成的THP-1-Mφ是最常用的細(xì)胞模型，但到目前為止并沒(méi)有明確其分化情況。THP-1-Mφ可能為單一亞型的巨噬細(xì)胞，也可能是M1和M2型巨噬細(xì)胞共存的細(xì)胞群，因此本研究對(duì)此科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行了深入探究。首先利用PMA刺激THP-1單核細(xì)胞分化為THP-1-Mφ，然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)添加不同細(xì)胞因子，分別誘導(dǎo)出THP-1-M1和THP-1-M2細(xì)胞，最后用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞主要CD分子的表達(dá)情況。

當(dāng)THP-1細(xì)胞被PMA刺激兩天后，細(xì)胞由之前的懸浮生長(zhǎng)變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)，而且THP-1-Mφ細(xì)胞可高表達(dá)單核巨噬細(xì)胞特有的CD14分子和CD68分子，說(shuō)明單核細(xì)胞已經(jīng)成功分化為巨噬細(xì)胞。但是此時(shí)細(xì)胞大部分呈圓形或橢圓形，并沒(méi)有形成明顯的突觸，不具備吞噬病原體的功能，故THP-1-Mφ細(xì)胞攝取抗原的能力較弱，當(dāng)繼續(xù)分化為THP-1-M1和THP-1-M2后，細(xì)胞表面出現(xiàn)非常明顯的突起，此時(shí)的巨噬細(xì)胞可對(duì)病原體進(jìn)行有效的吞噬。由于Mφ與M1和M2型巨噬細(xì)胞之間的形態(tài)學(xué)差異較大，而且THP-1-Mφ并不能高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞的特異性分子CD80和CD86，也不能高表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞的特異性分子CD163和CD209，因此可以認(rèn)為THP-1-Mφ細(xì)胞并非THP-1-M1和THP-1-M2兩種細(xì)胞的混合群，而是不同于M1和M2的一種巨噬細(xì)胞。

除各細(xì)胞的特異性分子之外，本研究還對(duì)與抗原提呈功能相關(guān)的CD分子進(jìn)行了檢測(cè)，其中共刺激分子CD80、CD83和CD86可使細(xì)胞有效攝取并加工提呈抗原，為T細(xì)胞的活化提供所需的共刺激信號(hào)[9]；CD209的高表達(dá)同樣可促進(jìn)巨噬細(xì)胞更好的識(shí)別抗原，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答[10]；CD1a則主要負(fù)責(zé)脂類抗原的提呈[11]；而HLA-DR的表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的激活，其表達(dá)程度也反映了細(xì)胞提呈抗原的能力[12]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THP-1-Mφ細(xì)胞表面以上分子的表達(dá)量均較低，大部分呈陰性，與體內(nèi)靜息狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞較相似，此時(shí)細(xì)胞攝取并提呈抗原的能力較弱，無(wú)法有效的刺激T細(xì)胞活化[13]；而當(dāng)THP-1-Mφ被細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化為THP-1-M1和THP-1-M2后，以上CD分子的表達(dá)均出現(xiàn)了明顯的上升。因此可以認(rèn)為THP-1-Mφ細(xì)胞為處于靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，而THP-1-M1和THP-1-M2則為被活化的具有功能性的巨噬細(xì)胞，但是以上結(jié)果并不能直接說(shuō)明THP-1-Mφ即為M0細(xì)胞。

綜上所述，靜息狀態(tài)的Mφ與活化狀態(tài)的M1、M2在細(xì)胞形態(tài)和CD分子的表達(dá)方面差異較大，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞模型。本研究在體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用了比較分析的方法，明確了PMA刺激THP-1細(xì)胞后所得THP-1-Mφ的類型，為巨噬細(xì)胞功能性實(shí)驗(yàn)的研究提供了理論依據(jù)，而且本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了巨噬細(xì)胞CD分子的表達(dá)情況，也為巨噬細(xì)胞的表型鑒定方法提供了新思路。

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PhenotypiccharacterizationofPMA-inducedTHP-1macrophagesanalyzedbyflowcytometry

PENG Zhuo-ying， LI Xiang， CONG Zhe*， XUE Jing*

(Comparative Medicine Center, Peking Union College(PUMC)& Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS);Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing Key Laboratory for Animal Models of Emerging and Remerging Infectious Diseases, Beijing 100021, China)

ObjectiveTo identify the characteristics of the subtype of PMA-induced THP-1 macrophages by flow cytometry analysis.MethodsTHP-1 monocytic cells differentiate into macrophages promoted by PMA, then induced into M1 and M2 by adding different cytokines, such as LPS,IL-6 and IFN-γ for THP-1-M1, IL-4,IL-13 and IL-6 for THP-1-M2. Morphology of cells were observed under a microscope and the expression of CD14, CD68, CD16, CD80, CD86, CD163, CD206, CD209, CD83, CD1a, CD11c, HLA-DR were detected by flow cytometry.ResultsThe macrophages stimulated by PMA became adherent; THP-1-M1 and THP-1-M2 lost their spherical morphology, appeared more irregular with many obvious projections. The expression of CD83, CD1a, CD11c, HLA-DR which had the function of antigen presenting on the surface of THP-1-Mφ were very low, and most of them were negative, but those of THP-1-M1 and THP-1-M2 were very high.ConclusionsThe macrophages differentiated from THP-1 stimulated by PMA are weak in antigen presenting function.

THP-1; Macrophage; Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA; Flow cytometry

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0010-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.003

2017-04-12

國(guó)家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81301437)；科技部重大專項(xiàng)(2014ZX10001001-001-004，2014ZX10001001-002-006)。

彭卓穎(1992-)，女，碩士研究生，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)研究工作。E-mail: 18810963239@163.com

薛婧(1983-)，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：病原生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail: xuejing@cnilas.org。

叢喆(1972-)，女，副主任技師，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒分子生物學(xué)和模型研究工作。E-mail: congz@cnilas.org。*共同通訊