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        健脾化痰活血方對甲狀腺功能減退癥大鼠肝臟脂肪變性的影響*

        2017-11-01 06:54:34孫群群高天舒張鳳暖
        中國中醫(yī)急癥 2017年10期
        關(guān)鍵詞:高量常量灌胃

        孫群群 高天舒 陳 巍 張鳳暖

        (1.遼寧中醫(yī)藥大學,遼寧 沈陽110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽110032)

        健脾化痰活血方對甲狀腺功能減退癥大鼠肝臟脂肪變性的影響*

        孫群群1高天舒2△陳 巍1張鳳暖1

        (1.遼寧中醫(yī)藥大學,遼寧 沈陽110847;2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽110032)

        目的觀察健脾化痰活血方對甲狀腺功能減退癥模型大鼠肝臟脂肪變性的影響并探討其機制。方法80只Wistar雄性大鼠飼養(yǎng)1周,隨機選出8只為正常組,剩余72只予0.1%丙硫氧嘧啶(PTU)10mg/(kg·d)灌胃4周,建立甲減大鼠模型。模型成功后把72只大鼠隨機分為6組(n=12),即模型組、L-T4組、常量組、高量組、常量+L-T4組、高量+L-T4組,予相應(yīng)處理。12周后,處死大鼠,RIA法檢測血清總甲狀腺素(TT4)水平,IRMA法測血清促甲狀腺激素(TSH)水平;全自動生化分析儀檢測三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)以及肝組織中TG、TC;光鏡下觀察肝細胞形態(tài)。結(jié)果4周末,與正常組比,其余各組血清TT4均明顯下降(P<0.01),TSH均明顯升高(P<0.01),證明甲減模型成立。12周末:與正常組比,模型組血清TT4明顯下降(P<0.01),血清TSH明顯升高(P<0.01),血清TC、LDL-C均升高(P<0.05),TG明顯升高(P<0.01),HDL-C無明顯變化(P>0.05),血清ALT、AST均升高(P<0.05),肝組織中TG升高(P<0.05),TC明顯升高(P<0.01);與模型組比,L-T4組、中藥各劑量組、中藥+L-T4各劑量組血清TT4均升高(P<0.05或P<0.01),血清TSH均降低(P<0.05或P<0.01),血脂(TG、TC、LDL-C)、肝酶(ALT、AST)、肝臟中TG、TC水平均降低(P<0.05或P<0.01),高量組較L-T4組顯著降低,但以高量+L-T4組降低最明顯。形態(tài)學觀察:模型組肝臟胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量散在分布的橘紅色脂滴,呈彌漫性脂肪變,各治療組治療后脂滴明顯減少。結(jié)論甲減大鼠體內(nèi)出現(xiàn)肝臟脂質(zhì)沉積和肝細胞脂肪變性,健脾化痰活血方能改善大鼠甲狀腺功能、糾正脂代謝異常、逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性,與L-T4合用具有協(xié)同增效的作用。

        健脾化痰活血方 甲狀腺功能減退癥 肝臟脂肪變性

        甲狀腺功能減退癥(甲減)是由于各種原因?qū)е碌牡图谞钕偌に匮Y或甲狀腺激素抵抗而引起的全身性低代謝綜合征[1]。血清促甲狀腺激素(TSH)升高,甲狀腺激素(T4)降低即可診斷為甲減。甲減起病隱匿,易造成心、腦、腎等器官的損害,對肝臟也可造成影響。肝臟為脂質(zhì)代謝的中心器官,甲狀腺激素對肝內(nèi)脂質(zhì)、血清膽固醇的調(diào)節(jié)起著重要的作用,臨床上如非酒精性脂肪性肝(NAFLD)與肝臟代謝異常有關(guān)[2],且NAFLD的患病率與T4水平呈負相關(guān),T4水平的降低可增加NAFLD發(fā)生的風險。甲減患者中NAFLD的患病率為35.7%[3],NAFLD患者中甲減的患病率為21.1%[4],甲減可能為誘導NAFLD的獨立危險因素[5]。甲減屬于中醫(yī)學“虛勞”“痰飲”等范疇。甲狀腺手術(shù)或藥物的響影,可致脾氣虛衰,氣虛日久則陽虛,陽虛為甲減之病本,而痰濁瘀血則為該病之標[6]。本文第二作者高天舒教授根據(jù)甲減的臨床癥狀以及多年臨床經(jīng)驗,自擬健脾化痰活血方治療甲減,以改善甲狀腺功能,調(diào)節(jié)免疫力低下。本研究以Wistar雄性大鼠為研究對象,旨在觀察健脾化痰活血方對甲減大鼠肝臟脂肪變性的影響,為中藥防治甲減致肝臟脂肪變性提供客觀依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物SPF級Wistar雄性大鼠80只,體質(zhì)量180~220 g,購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(遼)2015-0001。

        1.2 實驗藥物 健脾化痰活血方,由紅參、當歸、牡蠣、炙甘草、姜半夏等藥物組成(涉及專利申請,未列出全部藥物),中藥飲片購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院草藥局,經(jīng)浸泡、煎熬、過濾及濃縮后,常量組:制備成藥物生藥量為2.0 g/mL水煎液。高量組:制備成藥物生藥量為6.0 g/mL濃縮劑。丙硫氧嘧啶片(PTU,上海朝暉藥業(yè)有限公司),左甲狀腺素鈉片(L-T4)(德國默克公司50μg/片)。

        1.3 試劑與儀器4%多聚甲醛、10%水合氯醛、異丙醇、油紅O染料(由遼寧中醫(yī)藥大學教學實驗中心提供),血清TSH測定試劑盒、TT4放免試劑盒(購于北京北方生物技術(shù)研究所),OCT包埋劑 (德國Leica)。雙蒸水、無菌飼料,由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。灌胃器 (沈陽市實驗試劑玻璃儀器廠);YP10001型電子秤(上海越平科學儀器有限公司,中國);低溫高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司);超低溫(-80℃)冰箱(日本三洋);直冷式冷藏冷凍(-20℃)箱(德國西門子);高速勻漿機(德國ika);冷凍切片機(德國Leica);顯微鏡(德國Leica);全自動生化分析儀(美國貝克曼)。

        1.4 分組與造模80只大鼠于SPF級實驗室飼養(yǎng)1周,飼以雙蒸水與無菌飼料。隨機選8只作為正常組,余72只予0.1%PTU按10mg/(kg·d)灌胃造模[7]。4周后,眶靜脈取血進行模型評價,將成模的72只大鼠隨機分為模型組、L-T4組、常量組、高量組、常量+L-T4組、高量+L-T4組,每組各12只。

        1.5 給藥方法 正常組、模型組予等量去離子水灌胃;L-T4組予左甲狀腺素鈉片懸混液5μg/(kg·d)灌胃;常量組予中藥水煎液13.7 g/(kg·d)灌胃;高量組予中藥濃縮液41.1 g/(kg·d)灌胃;常量+L-T4組先予左甲狀腺素鈉片懸混液灌胃,1 h后再按13.7 g/(kg·d)灌胃中藥水煎劑;高量+L-T4組先予左甲狀腺素鈉片懸混液灌胃,1 h后再按41.1 g/(kg·d)灌胃中藥濃縮液。每千克體質(zhì)量大鼠每日劑量按60 kg成人用藥劑量換算,容積為8.75 mL/kg。連續(xù)灌胃8周。

        1.6 標本采集與檢測4周末,經(jīng)眶靜脈取血,分離血清,-20℃冰箱保存,檢測血清TSH與TT4,用于模型評價;8周后,大鼠處死前禁食不禁水12 h,稱質(zhì)量后麻醉,經(jīng)腹主動脈取血,離心取血清備用,-20℃冰箱保存,待檢各指標;迅速摘取肝臟,于干冰上取等體積肝組織小塊存放EP管內(nèi),-80℃冰箱保存,用于肝臟脂質(zhì)含量測定;肝臟組織于-80℃冰箱保存,用于肝臟形態(tài)觀察。1)一般情況:實驗期間,每周稱取體質(zhì)量1次,根據(jù)變化調(diào)整給藥量,觀察大鼠狀態(tài),飲食,大便及活動情況。2)甲功(TSH、TT4)測定:IRMA法測血清TSH,RIA法測血清TT4,按照試劑盒說明規(guī)范操作。3)血脂及肝酶的測定:血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)以及血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)用全自動生化分析儀檢測。4)肝內(nèi)脂質(zhì)測定:取肝組織小塊,按每100 g肝組織加入0.9 mL異丙醇,高速勻漿機勻漿,高速離心機分離上清液,全自動生化分析儀檢測TG、TC含量。5)形態(tài)學觀察:將肝組織從-80℃冰箱取出回溫,于30%蔗糖溶液中沉降48 h,OCT包埋劑包埋后做冰凍切片進行油紅O染色。40倍顯微鏡下觀察脂肪變性情況。按肝細胞脂肪變性細胞數(shù)占總肝細胞數(shù)的百分比計算共分為4度[8]。F0:小于5%,為正常肝臟。F1:5%~30%,發(fā)生細胞脂肪變性。F2:31%~50%,為輕度脂肪肝。F3:51%~75%,為中度脂肪肝。F4:大于75%,為重度脂肪肝。

        1.7 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析進行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01為差異有明顯統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠一般情況比較 正常組大鼠活動自如、反應(yīng)靈敏,皮毛光亮,飲食、大便正常;模型組大鼠動作遲緩,反應(yīng)遲鈍,皮毛枯黃稀疏,納差,大便溏;各藥物治療組(中藥常量組、中藥高量組、L-T4組、常量+LT4組、高量+L-T4組)大鼠治療前情況同模型組,治療后接近正常組;治療過程中大鼠死亡情況:正常組1只,L-T4組2只,高量組2只,常量+L-T4組1只。

        2.2 各組大鼠血清TT4、TSH水平比較 見表1。4周末:與正常組比,其余各組大鼠血清TT4降低、TSH升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),證明模型成功。藥物治療8周。12周末:L-T4組、中藥各劑量組、中藥+L-T4各劑量組TT4水平升高、TSH水平降低,與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),且高量組改善優(yōu)于L-T4組(P<0.05),表明中藥具有調(diào)節(jié)甲功的效果。

        2.3 各組大鼠血脂水平比較 見表2。模型組血清TG、TC、LDL-C較空白組升高(P<0.05或P<0.01);LT4組、中藥各劑量組、中藥+L-T4各劑量組均明顯降低,與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),L-T4與中藥均能夠降低血脂水平,以高量+L-T4組效果最佳;在血清TG、TC恢復上,高量組優(yōu)于L-T4組與常量組;各組間血清HDL-C差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

        表1 各組大鼠治療前后甲功水平比較(±s)

        表1 各組大鼠治療前后甲功水平比較(±s)

        與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與LT4組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與常量組比較,■P<0.05,■■P<0.01。下同。

        治療前 治療后組 別n TSH(uIU/mL)TT4(ng/mL)n TSH(uIU/mL)TT4(ng/mL)正常組8 0.19±0.05 55.18±6.56 7 0.23±0.04 46.56±12.78模型組12 L-T4組12 1.21±0.12**26.59±5.77**1.25±0.18**27.53±5.35**12 10 1.22±0.50**23.99±0.49**0.81±0.12**##31.10±0.72**#?!龀A拷M12 1.23±0.10**25.55±4.86**12 0.92±0.39**#27.42±0.98**#高量組12 1.25±0.20**24.88±4.97**10 0.50±0.07##▲■■35.01±1.18**#?!觥龀A?L-T4組12 1.23±0.15**24.83±4.94**11 0.45±0.27#?!觥?6.36±1.21**#?!觥龈吡?L-T4組12 1.24±0.07**25.91±5.89**12 0.30±0.19#?!觥?0.00±0.94*##▲▲■■

        表2 各組大鼠治療后TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較(mmol/L,±s)

        表2 各組大鼠治療后TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較(mmol/L,±s)

        組 別n正常組7模型組12 L-T4組10 TG TTC LDL-C HDL-C 0.32±0.05 1.28±0.04 0.34±0.04 1.09±0.23 0.43±0.02**1.38±0.15*0.45±0.10*1.15±0.06 0.31±0.12#1.24±0.03##■0.33±0.07#?!?.08±0.08常量組12 0.34±0.03#1.29±0.04#0.39±0.08 1.15±0.15高量組10 0.26±0.08*#?!觥?.15±0.07*##▲■■0.30±0.12#?!觥?.03±0.11常量+L-T4組11 0.25±0.05**#?!觥?.12±0.10*#?!觥?.27±0.04**#?!觥?.96±0.08高量+L-T4組12 0.24±0.07**##▲▲■■1.09±0.12**#?!觥?.25±0.05**#?!觥?.94±0.11

        2.4 各組大鼠血清肝功能水平比較 見表3。模型組較正常組升高(P<0.05);L-T4組、中藥各劑量組、中藥+L-T4各劑量組較模型組均有不同程度降低 (P<0.05或P<0.01);在血清ALT恢復上,高量組優(yōu)于LT4組與常量組。

        表3 各組大鼠治療后血清AST、ALT水平比較(U/L,±s)

        表3 各組大鼠治療后血清AST、ALT水平比較(U/L,±s)

        組 別n正常組7模型組12 L-T4組10 ALT AST 45.00±1.41 162.29±8.62 48.14±2.54*173.43±8.96*40.86±2.04**##151.43±8.98*##常量組12 42.57±2.44##157.71±5.44##高量組10 38.14±3.08**#?!觥?44.43±8.58**#?!觥龀A?L-T4組11 37.43±1.40**#?!觥?29.43±7.07**#?!觥龈吡?L-T4組12 34.71±1.49**#?!觥?27.00±6.30**#?!觥?/p>

        2.5 各組大鼠肝臟勻漿(TG、TC)結(jié)果比較 見表4。模型組較正常組均升高(P<0.05);L-T4組、中藥各劑量組、中藥+L-T4各劑量組較模型組均有不同程度下降(P<0.05或P<0.01),高量組改善優(yōu)于L-T4組與常量組,以高量+L-T4組效果最優(yōu)。

        2.6 各組大鼠肝細胞脂肪變性結(jié)果比較 見表5??瞻捉M無肝細胞脂肪變,模型組大鼠肝細胞脂肪變?yōu)?3.68%,屬輕度脂肪肝;各治療組內(nèi)肝細胞脂肪變均減少,與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

        表4 各組大鼠治療后肝臟勻漿中TG、TC水平比較(mmol/L,±s)

        表4 各組大鼠治療后肝臟勻漿中TG、TC水平比較(mmol/L,±s)

        組 別n正常組7模型組12 L-T4組10 TG TC 0.60±0.07 0.34±0.03 0.69±0.05*0.48±0.02**0.50±0.03*##0.40±0.05*#常量組12 0.54±0.05##0.42±0.02**#高量組10 0.37±0.07**##▲▲■■0.36±0.01#?!龀A?L-T4組11 0.33±0.03**#?!觥?.28±0.07*#?!觥龈吡?L-T4組12 0.23±0.04**#?!觥?.25±0.03**##▲▲■■

        表5 各組大鼠肝細胞脂肪變性結(jié)果比較(±s)

        表5 各組大鼠肝細胞脂肪變性結(jié)果比較(±s)

        組 別n正常組6模型組6 L-T4組6脂肪變性(%)0±0 33.68±4.28**24.75±4.49**常量組6 27.72±4.41**##高量組6 20.21±2.50**#?!觥龀A?L-T4組6 14.40±2.33**#?!觥龈吡?L-T4組6 11.97±2.84**#?!觥?/p>

        2.7 各組大鼠肝臟組織油紅O染色結(jié)果比較 見圖1。空白組肝臟細胞邊緣清晰、胞漿豐富、胞核完整,胞質(zhì)無橘紅的脂滴;與正常組比較,模型組肝細胞胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量散在分布的橘紅色脂滴,呈彌漫性脂肪變;治療后,各治療組脂滴數(shù)量均減少,以高量+L-T4組減少最為明顯。

        圖1 各組大鼠肝臟組織油紅O染色結(jié)果(40倍)

        3 討 論

        肝臟是甲狀腺激素(TH)作用的靶器官,TH水平低下可引起TC、LDL-C水平的升高及TG水平的升高,因為血清TC、LDL-C水平增高與肝細胞表面的LDL受體表達和LDL顆粒的氧化有關(guān)[9]。肝臟也是脂質(zhì)代謝的中心器官,膽固醇轉(zhuǎn)化和分解的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常均可能導致TG、TC排出受阻[10],高TC血癥、高TG血癥則是非酒精性脂肪性肝(NAFLD)發(fā)病的重要因素。NAFLD已成為一個重要的公共健康問題,如不控制將會演變成非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌,其與肥胖、高脂血癥、糖尿病、心血管疾病等密切相關(guān),但甲減與NAFLD之間的機制尚不清楚。

        本文第二作者高天舒教授認為脾氣虛弱多為甲減初期表現(xiàn)[11],治以健脾益氣,并用補中益氣湯治療甲減,我們以往實驗研究證明:補中益氣湯可以上調(diào)下降T4的水平,且療效顯著[12-14]。脾虛為甲減之病本,脾虛則痰濁內(nèi)生,氣虛則瘀血阻滯,痰瘀互結(jié)日久則閉阻肝經(jīng)脈絡(luò),形成脂肪肝。因此,本文第二作者高天舒教授在補中益氣湯的基礎(chǔ)上,自擬健脾化痰活血方治療本病,方中紅參、炙黃芪、當歸健脾益氣活血;浙貝母、鱉甲化痰散結(jié),諸藥共奏健脾化痰活血之功效。本實驗通過制備甲減大鼠模型,觀察健脾化痰活血方對甲減致脂肪變性的療效。

        本實驗觀察到大鼠機體內(nèi)血清TG、TC、LDL-C、ALT、AST及肝內(nèi)(TG、TC)水平均升高,光鏡下可見大量散在分布的橘紅色脂滴,提示肝臟脂質(zhì)沉積和肝細胞脂肪變性,與文獻報道[15]一致。甲狀腺激素通過刺激肝臟合成、血清攝取和肝內(nèi)膽汁酸轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)血清膽固醇水平[3],使血脂水平降低,此結(jié)果與趙家軍[16]的結(jié)論相符。本研究中,中藥效果與L-T4相當,但中藥高量組優(yōu)于L-T4,以高量+L-T4組效果最佳。由此可見,健脾化痰活血方可以調(diào)節(jié)甲狀腺功能,改善脂質(zhì)沉積與肝細胞脂肪變性,與L-T4聯(lián)合使用有協(xié)同增效的作用。健脾化痰活血方可能成為治療甲減合并脂肪肝的有效方劑,其療效機制仍需進一步的實驗研究。

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        [14]高天舒,尹慧絲.補中益氣法對甲減大鼠心肌α-MHC和β-MHCmRNA表達的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志,2012,18(12):1340-1343,1352.

        [15]王孟丹.甲狀腺功能減退大鼠肝臟脂質(zhì)合成和β氧化的變化[D].石家莊:河北醫(yī)科大學,2016.

        [16]趙家軍,楊利波.甲狀腺功能減退癥與血脂異常[J].中國實用內(nèi)科雜志,2014,34(4):340-343.

        Effect of Jianpi Huatan Huoxue Decoction on Liver Fatty Degeneration in Rats with Hypothyroidism

        SUN Qunqun,GAO Tianshun,CHENWei,et al.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning,Shenyang 110847,China.

        Objective:To observe the effect of Jianpi Huatan Huoxue Decoction on liver fatty degeneration in rats with hypothyroidism.Methods80 Wistar male rats were fed for one week,and 8 rats were random ly selected for the normal group.The remaining 72 rats were given 0.1% propylthiouracil(PTU)10mg/(kg·d),for 4 weeks,to establish the model of hypothyroidism rats.After the model was successful,72 rats were randomly divided into six groups(n=12),namely,the model group,L-T4 group,the constant group,high volume group,constant+L-T4 group,high volume+L-T4 group,and the factors of corresponding treatment were given.After 12 weeks,the level of serum TT4 was detected with RIA;the level of serum TSH was detected with IRMA;automatic biochemical analyzer was used to detect Triglyceride(TG),total cholesterol(TC),low density lipoprotein(LDL-C),high density lipoprotein(HDL-C),and total cholesterol(TC)and triglyceride(TG)in liver.Hepatocyte morphology was observed under light microscope.ResultsAt the 4 weekend,compared with the normal group,the serum TT4 levels of all the other groups decreased significantly(P<0.01),and serum TSH was significantly increased(P<0.01),indicating that the hypothyroidism model was established.At the 12 weekend,compared with the normal group,theserum TT4 of the model group decreased obviously(P<0.01);serum TSH was significantly increased(P<0.01);serum TC and LDL-C were increased(P<0.05);TG was significantly increased(P<0.01);serum HDL-C had no significant change(P>0.01);serum ALT and AST were increased(P<0.05);TG in liver tissue increased(P<0.05);TC in liver tissue was significantly increased(P<0.01).Compared with the model group,serum TT4 in LT4 group,the traditional Chinese medicine dose groups,traditional Chinese medicine+L-T4 dose group were increased(P<0.05 or P<0.01),and the levels of serum TSH were lower(P<0.05 or P<0.01);the levels of lipid(TG,TC,LDL-C),liver enzymes(ALT,AST),TG and TC in liver were lower(P<0.05 or P<0.01).The high volume group was significantly lower than L-T4 group,but the most significant reduction was in high volume+L-T4 group.Morphological observation:in the model group,large amounts of scattered orange fat droplets appeared in the cytoplasm of the liver,which showed diffuse fatty degeneration,and after treatment,lipid droplets in all groups were significantly decreased.ConclusionHepatic lipidosis and hepatocytes steatosis occurred in rats with hypothyroidism.Jianpi Huatan Fang can improve thyroid function,correct lipid metabolism abnormalities,and reversal of liver steatosis,and has a synergistic effect combined with L-T4.

        Jianpi Huatan Huoxue Decoction;Hypothyroidism;Fatty degeneration of liver

        R285.5

        A

        1004-745X(2017)10-1707-05

        10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.005

        遼寧省科學技術(shù)計劃項目產(chǎn)業(yè)基地發(fā)展建設(shè)計劃(2014226035);遼寧中醫(yī)藥大學杏林優(yōu)才計劃(遼中醫(yī)校發(fā)[2012]211號);遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用國家教育部重點實驗室開放資金資助(ZYZX1511)

        △通信作者(電子郵箱:gaotianshu67@163.com)

        2017-05-10)

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