史 航,朱 輝

(1.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130061；2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

缺氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞水通道蛋白-1表達(dá)的影響

史 航1,朱 輝2*

(1.長(zhǎng)春市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130061；2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科)

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease)是一系列不同程度的缺血性腦血管疾病的總稱。其根本病理生理學(xué)基礎(chǔ)是腦血管壁病變導(dǎo)致供腦部血流量減少，引起腦組織缺血，缺氧，嚴(yán)重情況會(huì)導(dǎo)致腦組織梗死，神經(jīng)元凋亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞是循環(huán)血液與血管平滑肌細(xì)胞間的機(jī)械屏障。在缺氧的損傷后會(huì)出現(xiàn)生理功能失調(diào)，使其分泌的多種活性物質(zhì)水平出現(xiàn)變化，原有的動(dòng)態(tài)平衡被打破，從而導(dǎo)致正常生理功能永久性的損害[1]。本文擬探討缺氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的水通道蛋白-1表達(dá)的影響，進(jìn)而探討血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子病理學(xué)變化，為改善缺血性腦血管疾病的預(yù)后尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926(人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞),設(shè)立常規(guī)培養(yǎng)氧細(xì)胞組和缺氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞組，分別處理24、48和72 h后收集標(biāo)本。 缺氧組細(xì)胞用混合氣(94% N2、5%CO2、1% O2)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2方法

收集兩組的人血管內(nèi)皮細(xì)胞后，采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)法檢測(cè)水通道蛋白-1(AQP-1)表達(dá)水平。將不同時(shí)間點(diǎn)收集的常規(guī)培養(yǎng)氧細(xì)胞組和缺氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞組通過(guò)RIPA細(xì)胞裂解液及超聲裂解。離心后獲得蛋白質(zhì)檢測(cè)樣品。然后將蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗采用鼠抗人水通道蛋白1的IgG抗體，GAPDH為內(nèi)參照物，結(jié)果通過(guò)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行成像及分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用SPSS13.0進(jìn)行，P≤0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞組及缺氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞組血管內(nèi)皮細(xì)胞均有一定水平AQP -1的表達(dá)。AQP -1/GAPDH以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。其中，缺氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞組AQP -1/GAPDH明顯高于常規(guī)培養(yǎng)氧細(xì)胞組(P≤0.05)，且呈時(shí)間依賴性，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05)。具體結(jié)果如表1。

表1 常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞組及缺氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞組血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP-1的表達(dá)情況

表1中數(shù)值為兩組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)AQP -1/GAPDH的比值。

3 討論

缺血性腦血管病占我國(guó)腦血管病例當(dāng)中80%-85%，缺血性腦血管病嚴(yán)重威脅國(guó)人健康。血管內(nèi)皮細(xì)胞因缺氧引起一系列病理變化是缺血性腦血管病發(fā)病進(jìn)而引起血管損傷的重要環(huán)節(jié)之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生的機(jī)制與缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)和水通道蛋白4(AQP4)的表達(dá)異常有關(guān)[2]。水通道蛋白-1被證實(shí)廣泛表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與水分子、氧、二氧化碳及一氧化氮的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[3]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧組內(nèi)皮細(xì)胞在24、48和72 小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞水通道蛋白 1表達(dá)的水平上調(diào)，且呈時(shí)間依賴性。這證實(shí)了缺氧會(huì)導(dǎo)致AQP1表達(dá)上調(diào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞水通道的轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)失調(diào)，可能參與缺血性腦血管病發(fā)病過(guò)程中的作用。缺氧后血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)還會(huì)出現(xiàn)COX-2/PGE2等一系列細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常調(diào)控[4]。所以，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞AQP-1的表達(dá)可能是調(diào)控血管內(nèi)皮損傷的重要環(huán)節(jié)，可能為以后干預(yù)缺血缺氧性腦血管病及顱腦損傷的預(yù)后提供基礎(chǔ)。

[1]Sada K,Nishikawa T,Kukidome D,et al.Hyperglycemia Induces Cellular Hypoxia through Production of Mitochondrial ROS Followed by Suppression of Aquaporin-1[J].PLoS One,2016,11(7):e0158619.

[2]Abreu-Rodríguez I,Sánchez Silva R,Martins AP,et al.Functional and transcriptional induction of aquaporin-1 gene by hypoxia; analysis of promoter and role of Hif-1α[J].PLoS One,2011,6(12):e28385.

[3]Leggett K,Maylor J,Undem C,et al.Hypoxia-induced migration in pulmonary arterial smooth muscle cells requires calcium-dependent upregulation of aquaporin 1[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2012,303(4):L343.

[4]Zhao L,Wu Y,Xu Z,et al.Involvement of COX-2/PGE2 signalling in hypoxia-induced angiogenic response in endothelial cells[J].J Cell Mol Med,2012,16(8):1840.

2016-03-22)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1838-02