王新梅，王雪野，韓 梅*，肖中平

(吉林省人民醫(yī)院 1.血液科;2.腫瘤科，吉林 長(zhǎng)春130021)

人體外周血CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞體外擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)研究

王新梅1，王雪野2，韓 梅1*，肖中平1

(吉林省人民醫(yī)院 1.血液科;2.腫瘤科，吉林 長(zhǎng)春130021)

目的探討人體外周血CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞(DNT細(xì)胞)在體外進(jìn)行分離和擴(kuò)增的方法。方法取健康的成人外周血20 ml，應(yīng)用Rosettesep抗體吸附法去除CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞；再將DNT細(xì)胞放入anti-CD3mAb包被的培養(yǎng)板中，并加入rhIL-2、rhIL-4，共同培養(yǎng)，第10天和第14天計(jì)數(shù)細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)及記錄擴(kuò)增曲線；利用Easysep免疫磁珠法純化，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其純度。結(jié)果經(jīng)分選、純化后的DNT細(xì)胞，純度可達(dá)94%以上；體外培養(yǎng)第10天和第14天，DNT細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為53倍和41倍。結(jié)論通過(guò)Rosettesep抗體吸附法及Easysep免疫磁珠法分離及純化DNT細(xì)胞是可行的，可獲得大量高純度的DNT細(xì)胞。

CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞；Rosettesep抗體吸附法；Easysep免疫磁珠法；流式細(xì)胞術(shù)

(ChinJLabDiagn,2017,21:1831)

免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫耐受的重要機(jī)制，近年來(lái)由于免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞越來(lái)越受到人們的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)這類細(xì)胞在機(jī)體的自身免疫、腫瘤免疫以及器官移植等方面都具有重要的作用。目前被證實(shí)的具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答功能的細(xì)胞主要包括：免疫抑制性CD8+CD28-T細(xì)胞、γδTCR+T細(xì)胞、自然殺傷(NK) T細(xì)胞、CD8+否決細(xì)胞以及CD3+CD4-CD8-雙陰性T細(xì)胞(double negative T cells，DNT細(xì)胞)[1]。其中DNT細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，主要與其表面標(biāo)志不同及分泌特殊的效應(yīng)因子有關(guān)[2,3]。然而，DNT細(xì)胞在正常人和小鼠的外周血T淋巴細(xì)胞中的數(shù)量極少，僅占1%-2%和1%-5%[4-6]，這就限制了對(duì)其功能的進(jìn)一步研究。因此，對(duì)于DNT細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法及優(yōu)化，成為目前亟待解決的問(wèn)題。本課題研究的目的為體外分離和培養(yǎng)外周血DNT細(xì)胞，獲取一定數(shù)量高純度的DNT細(xì)胞，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

每年進(jìn)行健康體檢志愿者5名，其中男2名，女3名，年齡21-44歲，中位年齡33歲。于清晨、空腹、采集肝素抗凝靜脈血20 ml。

1.2試劑和儀器

抗-CD3 單抗購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；rh IL-2，rh IL-4購(gòu)自美國(guó)PEPROTECH公司；Rosettesep CD4、CD8負(fù)選試劑盒、Easysep CD4、CD8、CD56正選試劑盒、磁極均購(gòu)自于加拿大STEMCELL公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；CD3-PC5/ CD4-FITC /CD8-PE，CD3-FITC/CD56-PE，流式細(xì)胞儀(EPICS XL)均產(chǎn)自于美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司；5 ml聚苯乙烯試管，購(gòu)自于美國(guó)BD公司；多標(biāo)記微孔板分析儀1420，購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer Victor公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Rosettesep抗體吸附法分離DNT細(xì)胞 新鮮肝素抗凝靜脈血20 ml，加入Rosettesep Human CD4和 CD8 Depletion Cocktail各 50 μl/mL，在室溫條件下，孵育20 min；加入PBS+2%FBS 10 ml；加入到15 ml Ficoll中，于2 300 rpm離心30 min。取上、中層交界的白色云霧狀液體層，再加入PBS+2%FBS稀釋，于1 200 rpm離心10 min，棄上清，重復(fù)2次。計(jì)數(shù)細(xì)胞，以細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/mL。

1.3.2DNT細(xì)胞的體外培養(yǎng) 準(zhǔn)備24孔板，用anti-CD3mAb 100 ng/mL包被，封口膜封口，孵箱過(guò)夜。以適量PBS+2%FBS洗板3次，分別加入RPMI-1640，10% FBS，鏈霉素100 μg/mL，青霉素100 U/mL，rhIL-2 50 U/mL，rhIL-4 30 U/mL。將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL的DNT細(xì)胞加入24孔板，每孔加2 ml。每3天換液1次。共培養(yǎng)10-14天。

1.3.3DNT細(xì)胞的純化 收集24孔板中細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個(gè)/mL，放入聚苯乙烯試管中，加入Easysep Human CD4 Positive Selection Cocktail 、Easysep Human CD8 Positive Selection Cocktail、 Easysep Human CD56 Positive Selection Cocktail 各100 μl/mL，在室溫條件下進(jìn)行孵育，15 min，再于聚苯乙烯試管中分別加入磁珠50 μl/mL，混勻，室溫避光，孵育10 min，再加入Robosep Buffer，至總體積為2.5 ml，放入磁極中5 min，將所需要的DNT細(xì)胞倒入新的試管中，重復(fù)3次，加入2 ml Robosep Buffer，1 200 rpm，離心10 min。

1.3.4免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取細(xì)胞懸液100 μl，分別加入CD3-PC5/CD4-FITC /CD8-PE，CD3-FITC /CD56-PE各20 μl，室溫避光孵育15 min，加入冷PBS洗滌，1 500 rpm離心，10 min，棄上清，加入0.5 ml的PBS，混勻。采用EPICS-XLII流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，收集細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)/管。上機(jī)前對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行光流路質(zhì)量調(diào)控，雙色熒光補(bǔ)償，Listmode形式保存文件，應(yīng)用CellQuest軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1DNT細(xì)胞的體外培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)第7、10、14天，鏡下可見培養(yǎng)板底大量圓形核深染細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量及克隆現(xiàn)象逐漸增多，第10天達(dá)高峰，第14天可見細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

2.2DNT細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

采用Rosettesep抗體吸附法分離DNT細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞比例為94.4%(圖1)。體外擴(kuò)增及Easysep免疫磁珠法純化后的CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞純度可達(dá)99.2%(圖 2)。

2.3DNT細(xì)胞的體外擴(kuò)增

將細(xì)胞培養(yǎng)至d7，d10，d14，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)至d10生長(zhǎng)最旺盛，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，細(xì)胞數(shù)逐漸減少。第0天，第4天，第7天，第10天，第14天，DNT細(xì)胞數(shù)分別為8×106個(gè)，8×107個(gè)，3.12×108個(gè)，4.24×108個(gè)，3.28×108個(gè)。DNT細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)分別為0倍，10倍，39倍，53倍，41倍(圖3)。

3 討論

DNT細(xì)胞，是一群既不表達(dá)CD4分子，也不表達(dá)CD8分子的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，通過(guò)抗原特定因子的方式，來(lái)抑制免疫應(yīng)答的發(fā)生[7]。大量的研究表明，DNT細(xì)胞具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，有望成為一種新型的腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療方法。目前，一些免疫學(xué)專家認(rèn)為，能夠使調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的刺激因素主要為T細(xì)胞受體(TCR)，這種受體對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞起刺激性作用，對(duì)其功能造成影響。但是，DNT細(xì)胞與其他種類的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞不同，因其本身不表達(dá)共受體CD4和CD8，也不表達(dá)共刺激分子CD28[8]。另外，一些專家學(xué)者指出，細(xì)胞因子等對(duì)于DNT細(xì)胞的激活和DNT細(xì)胞發(fā)揮的功能都具有重要的作用[9]。DNT 細(xì)胞能夠在體外存活，需要有外源性的IL-2和IL-4的參與刺激，同時(shí)IL-4也具有保護(hù)DNT細(xì)胞的作用，避免發(fā)生和TCR交叉刺激，從而發(fā)生細(xì)胞的凋亡[10,11]。有研究者基于體外容易得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞，用 CD3抗體成功在體外擴(kuò)增活化T淋巴細(xì)胞，并且CD3抗體可增加淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并與濃度有關(guān)[12]。

圖3 DNT細(xì)胞體外擴(kuò)增的生長(zhǎng)曲線

在實(shí)驗(yàn)研究中我們采用的擴(kuò)增方法為通過(guò)anti-CD3mAb包被培養(yǎng)板，起到了人工APC的作用，能夠減少異體APC所帶來(lái)的各種差異，以及異體免疫細(xì)胞的污染，減少因異體排斥反應(yīng)所引起的增殖減低，加上rhIL-2和rhIL-4，方法簡(jiǎn)便，有利于大批量擴(kuò)增及應(yīng)用。但此種方法受限于不能長(zhǎng)期培養(yǎng)，在培養(yǎng)14天左右細(xì)胞數(shù)就逐漸下降，所以本實(shí)驗(yàn)方法有待于進(jìn)一步改進(jìn)。Ford Mclntyre等[13]研究發(fā)現(xiàn)，同種異體的APC可以有效的激活DNT細(xì)胞，使DNT細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)穿孔素途徑可以引起同種異體或同種同體的B細(xì)胞的凋亡。在我們的實(shí)驗(yàn)中也同樣見到的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，考慮與B細(xì)胞的凋亡有關(guān)。

傳統(tǒng)的細(xì)胞分選的技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)，十分昂貴，而且對(duì)于DNT細(xì)胞的分選費(fèi)時(shí)較多， 從而影響了細(xì)胞的活性，不利于細(xì)胞的進(jìn)一步培養(yǎng)及應(yīng)用。免疫磁珠法分選細(xì)胞是通過(guò)磁極和包被不同的抗體，可進(jìn)行幾乎所有細(xì)胞亞群的分離和純化，不僅簡(jiǎn)便靈活，而且經(jīng)濟(jì)省時(shí)，并且對(duì)于細(xì)胞造成的損傷也小，有利于分離后的培養(yǎng)和應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用Rosettesep抗體吸附法和Easysep免疫磁珠法獲得的DNT細(xì)胞，純度大于94%，可保證對(duì)于DNT細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增以及對(duì)DNT細(xì)胞抗腫瘤等作用研究的實(shí)驗(yàn)要求。

通過(guò)本研究得到的純度高并且數(shù)量多的DNT細(xì)胞，使接下來(lái)研究DNT細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能和對(duì)腫瘤的抑制作用的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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AmplificationofHumanperipheralbloodCD3+CD4-CD8-doublenegativeTcellsinvitro

WANGXin-mei,WANGXue-ye,HANMei.

(HematolgyDepartmentofJilinProvincePeople’sHospitalChangchun130021,China)

ObjectiveTo detect the method of isolation and amplification CD3+CD4-CD8-double negative T cells (DNT) in vitro.MethodsWe used the Rosettesep to remove CD4+T cells and CD8+T cells from human peripheral blood.To culture DNT cells with anti-CD3mAb,rhIL-2 and rhIL-4.We computed and recordedthe amplification times after day 10 and day 14.To putify DNT cells with Easysep and test its purity with flow cytometry.ResultsThe purity of DNT cells is 94%.The amplification times is 53 in day 10 and 41 in day 14.ConclusionThe method of Rosettesep and Easysep can be used to isolate and purify DNT cells.

CD3+CD4-CD8-double negative T cells;Rosettesep antibody adsorption method;Easysep micro-magnetic beads method;Flow cytometry

R446.62

A

2016-12-09)

吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(2012Z052)，吉林省科技廳項(xiàng)目(20150204074SF)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1831-04

王新梅(1983-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師，主要從事血液病基礎(chǔ)相關(guān)研究。