馬寅芙，李首慶，米旭光，魏海峰，譚 巖，方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心， 吉林 長(zhǎng)春130021)

miR-126和miR-199對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程的影響

馬寅芙，李首慶，米旭光，魏海峰，譚 巖，方艷秋*

(吉林省人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心， 吉林 長(zhǎng)春130021)

目的探討miR-126和miR-199在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響。方法以qRT-PCR檢測(cè)分析在乳腺癌細(xì)胞中miR-126和miR-199的表達(dá)情況；以miRNA mimics轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231，檢測(cè)miR-126和miR-199在表達(dá)增高的情況下對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響。結(jié)果miR-126和miR-199在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)較MCF-7細(xì)胞株明顯更低；轉(zhuǎn)染miRNA mimics 48h后，乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中的miR-126和miR-199的表達(dá)顯著上調(diào)，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程。結(jié)論提高miR-126和miR-199在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，發(fā)揮抗腫瘤效果。

miR-126；miR-199；乳腺癌；細(xì)胞周期

(ChinJLabDiagn,2017,21:1828)

MicroRNA(miRNA)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，起著癌基因或抑癌基因的作用[1,2]。每種腫瘤都有自己的miRNA表達(dá)譜，通過(guò)對(duì)miRNA在腫瘤中的表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)腫瘤具有診斷分析意義，miRNA有可能成為一種腫瘤臨床應(yīng)用的新生物標(biāo)記物。miRNA在腫瘤中的表達(dá)程度不同，對(duì)腫瘤產(chǎn)生的作用也有差異。本研究旨在研究miR-126和miR-199在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響和作用。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株與試劑人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF-7為本實(shí)驗(yàn)室凍存；胎牛血清、LipofectamineTM2000、 Trizol購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；DMEM培養(yǎng)、RPMI medium 1640基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司； Has-miR-126 mimics、Has-miR-199 mimics及陰性對(duì)照Cel-miR-67 mimics購(gòu)自上海百奧邁科生物技術(shù)有限公司；miR-126、miR-199、U6引物購(gòu)自上海生工公司；SYBR Green Master購(gòu)自瑞士Roche公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；碘化丙啶染液購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；其他常用試劑均購(gòu)自北京化工廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231用含雙抗(100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素)、10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；MCF-7細(xì)胞株用含雙抗的RPMI medium 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃，5% CO2，100%飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前一天細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用胰酶消化將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，以密度為2×105個(gè)/孔接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度可達(dá)70%左右。每孔轉(zhuǎn)染miRNA mimics 5 μl(終濃度為50 nM)，操作步驟參考脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞分兩部分，一部分用于提取RNA，另一部分細(xì)胞用于進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.2總RNA提取和qRT-PCR檢測(cè) 用Trizol法提取乳腺癌細(xì)胞株總RNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA的純度和濃度。參考逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將獲得的cDNA 以5倍稀釋用于熒光定量PCR檢測(cè)。使用2×SYBR Green Master應(yīng)用ABI7500 Real-Time PCR儀測(cè)定。miRNA的表達(dá)以U6作為內(nèi)參，結(jié)果以2-△△Ct表示mRNA拷貝數(shù)比值。hsa-miR-126:頸環(huán)引物5′-GTCGTA TCCAG TGCAG GGTCC GAGGT ATTCG CACTG GATAC GACCG CATT-3′，miR-126-3p forward primer:5′-GTCTC GTACC GTGAG TAAT-3′，hsa-miR-199:頸環(huán)引物5′-GTCGT ATCCA GTGCA GGGTC CGAGG TATTC GCACT GGATA CGACT AACCA-3′，miR-199a-3p forward primer:5′-GTCAC AGTAG TCTGC ACAT-3′，miRNA Universal primer:5′-GTGCA GGGTC CGAGGT-3′；U6 forward primer:5′-CTCGC TTCGG CAGCA CA-3′，reverse primer:5′-AACGC TTCAC GAATT TGCGT-3′。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集細(xì)胞：用胰酶消化細(xì)胞后離心(1 000 g/min離心5分鐘)收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，棄上清。固定細(xì)胞： 將1 ml預(yù)冷的70%乙醇加入細(xì)胞沉淀中，吹懸混勻，4℃固定2 h。染色：離心收集固定的細(xì)胞，加1 ml預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，1 000 g/min離心5分鐘，棄上清；細(xì)胞中加入500 μl碘化丙啶(PI)，緩慢并充分混勻細(xì)胞，4℃避光孵育30 min，混勻上機(jī)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀(COULTER Epics XL)檢測(cè)，應(yīng)用Wincycle 32軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

2 結(jié)果

2.1miR-126和miR-199在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次(n=3)，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用熒光定量 PCR儀檢測(cè)miR-126及miR-199在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，相對(duì)于乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，miR-126和miR-199在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)明顯更低。

注：**.P<0.01

2.2轉(zhuǎn)染miRNAmimics對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中miR-126和miR-199的表達(dá)影響

以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-126和miR-199 mimics入MDA-MB-231細(xì)胞中，終濃度為50 nM，以U6為內(nèi)參，Cel-mir-67 mimics為陰性對(duì)照(negative control,NC)。用2-ΔΔCt法分析real-time PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)(n=3)，每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)染miRNA mimics 48 h后，可使低表達(dá)miR-126和miR-199的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中此2種miRNAs的表達(dá)顯著上調(diào)(**P<0.01)。

注：**.P<0.01

圖2乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中轉(zhuǎn)染miRNAmimics后miR-126(A)和miR-199(B)表達(dá)分析

2.3上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-126和miR-199的表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響

如圖3所示，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-126和miR-199 mimics后(終濃度為50 nM)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(*P<0.05，**P<0.01)。相對(duì)于NC對(duì)照組，miRNA mimics轉(zhuǎn)染組明顯細(xì)胞周期受到抑制，G1期阻滯延長(zhǎng)(*P<0.05)。結(jié)果顯示提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞中miR-126及miR-199的表達(dá)水平，可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

注：*.P<0.05，**.P<0.01

(A)ApoptoticcellsanalyzedaftertransfectionwithmiR-126andmiR-199mimicsofMDA-MB-231cells;CellcycledistributionanalyzedofmiR-126(B)andmiR-199(C)aftermimicstransfectedinMDA-MB-231cells.

3 討論

人類發(fā)現(xiàn)miRNA所起的作用類似于癌基因或抑癌基因的功能[1,2]。miRNA在腫瘤組織中提高表達(dá)，它起到癌基因的作用；而miRNA在腫瘤組織中降低表達(dá)，它起到抑癌基因的作用。miRNA的表達(dá)調(diào)控癌基因或抑癌基因影響細(xì)胞的增殖和凋亡。在多項(xiàng)研究中證實(shí)，miR-126可在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)[3-5]，miR-199在卵巢癌、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、骨肉瘤等腫瘤中表達(dá)降低[6]，miR-126和miR-199在乳腺癌中表達(dá)均降低[7,8]，而提高miR-126和miR-199的表達(dá)可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，降低腫瘤復(fù)發(fā)率和提高患者生存率[6,11]。

miR-126和miR-199發(fā)揮抑癌基因的作用，可能與其抑制靶基因的表達(dá)相關(guān)[6,9-11]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-126可以降低VEGF的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力；上調(diào)miR-199表達(dá)可以抑制PAK4的表達(dá)，從而抑制PAK4/MEK/ERK途徑，乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，遷移和侵襲能力都受到抑制。

本研究中顯示，乳腺癌組織中miR-126和miR-199在不同侵襲力的乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)顯示出差異，即侵襲力強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231相對(duì)于侵襲力較弱的MCF-7細(xì)胞株 miR-126和miR-199表達(dá)明顯降低。所以，我們選擇表達(dá)量相對(duì)較低的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231轉(zhuǎn)染miRNA mimics進(jìn)行研究。在研究miR-126和miR-199抑制乳腺癌的機(jī)制中，我們對(duì)其在乳腺癌中表達(dá)升高引起的腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)這兩種miRNA的表達(dá)，可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，使G1期阻滯延長(zhǎng)。由此證明miR-126和miR-199促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，是其發(fā)揮腫瘤抑制作用的重要機(jī)制之一。

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EffectsofmiR-126andmiR-199oncellcycleofbreastcancer

MAYin-fu,LIShou-qing,MIXu-guang,etal.

(MedicalExperimentCenter,JilinProvincePeople’sHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveInvestigate the effect of miR-126 and miR-199 on the cell cycle in breast cancer cells.MethodsThe expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cells was detected by qRT-PCR assay;the effect of miR-126 and miR-199 expression on the cell cycle of breast cancer cells was detected after miRNA mimics were transfected into breast cancer cell line MDA-MB-231.ResultsThe expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cell line MDA-MB-231 was significantly lower than that of MCF-7 cell line;after transfection of miRNA mimics 48h,the expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cell line MDA-MB-231 was up-regulated,which could promote cell apoptosis and block the cell cycle progression of breast cancer.ConclusionIncreasing the expression of miR-126 and miR-199 in breast cancer cells can inhibit tumor cell cycle progression and exert anti-tumor effect.

miR-126;miR-199;breast cancer;cell cycle

R737.9

A

2016-10-11)

吉林省科技廳青年科研基金項(xiàng)目(20160520165JH)；吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)建設(shè)基金(20160622008JC)；吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20150101178JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1828-03