王 楊，谷冬梅，陳京山，胡志東*

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 1.醫(yī)學(xué)檢驗科，2.健康事業(yè)部，天津300052)

三種常規(guī)方法檢測血清膽紅素結(jié)果的可比性和偏倚評估

王 楊1，谷冬梅1，陳京山2，胡志東1*

(天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 1.醫(yī)學(xué)檢驗科，2.健康事業(yè)部，天津300052)

目的本研究對三種常規(guī)方法(重氮法、釩酸鹽法和干化學(xué)法)檢測血清膽紅素進(jìn)行檢測結(jié)果的可比性及偏倚評估分析，為實驗室檢測結(jié)果一致性及標(biāo)準(zhǔn)化提供實驗數(shù)據(jù)支持。方法按照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會EP9-A文件方案，以重氮法為比對方法，釩酸鹽法和干化學(xué)法為待評方法，分別對40例新鮮血清樣本進(jìn)行平行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析、計算醫(yī)學(xué)決定水平處的方法間預(yù)期偏倚，以臨床化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量指標(biāo)(WS/T403-2012)允許總誤差范圍的1/2為判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷偏倚的臨床可接受性。結(jié)果總膽紅素檢測釩酸鹽法和干化學(xué)法與重氮法的回歸方程分別為：y=0.913 4x+1.367 3，r2=0.998 7；y=0.975x+10.234，r2=0.996 5；該兩種方法在醫(yī)學(xué)決定值水平處(25、50和340 μmol/L)與重氮法的預(yù)期偏倚分別為：-0.80、-2.96和-28.08以及-2.39、-6.70和-56.76。直接膽紅素檢測釩酸鹽法與重氮法檢測結(jié)果回歸方程為：y=0.8274x+ 1.9252，r2=0.997 8；兩種方法在醫(yī)學(xué)決定值水平處(6、35.5 μmol/L)的預(yù)期偏倚分別為：0.98和-4.21。結(jié)論總膽紅素與直接膽紅素不同方法間均具有良好的相關(guān)性(r2均大于0.95)，但不同方法間的預(yù)期偏倚隨醫(yī)學(xué)決定值水平的增高顯著增加。與重氮法檢測結(jié)果相比，釩酸鹽法檢測總膽紅素預(yù)期偏倚可接受；干化學(xué)法檢測總膽紅素與釩酸鹽法檢測直接膽紅素結(jié)果則僅有較低醫(yī)學(xué)決定值水平預(yù)期偏倚可接受。

方法比對；偏倚評估；總膽紅素；直接膽紅素

(ChinJLabDiagn,2017,21:1744)

臨床實驗室常用兩種以上不同檢測系統(tǒng)對相同檢測項目進(jìn)行分析，如何保障其檢測結(jié)果具有可比性和一致性，已成為重要課題[1，2]。血清總膽紅素有助于臨床醫(yī)生判斷患者黃疸程度及其類型，是美國臨床病理學(xué)會(CAP)全球室間質(zhì)量調(diào)查中問題最大的項目之一[3]。本研究依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)的“用患者標(biāo)本進(jìn)行方法比對及偏倚評估-批準(zhǔn)指南”EP9-A文件[5]的要求，對本實驗室內(nèi)重氮法、釩酸鹽法和干化學(xué)法三種方法檢測總膽紅素(T-BIL)和直接膽紅素(D-BIL)的結(jié)果進(jìn)行方法學(xué)比對及預(yù)期偏倚評估，探尋提高檢驗結(jié)果可比性的方法。

1 材料與方法

1.1檢測系統(tǒng)的組成

1.1.1重氮法 T-BIL試劑盒(Roche)，D-BIL試劑盒(Roche)。儀器為羅氏DPP Modular全自動生化分析儀(D模塊)。

1.1.2釩酸鹽法 T-BIL試劑盒(日本和光)；D-BIL試劑盒(日本和光)。儀器為羅氏DPP Modular全自動生化分析儀(P模塊)開放通道。

1.1.3干化學(xué)法 T-BIL測定干片(強生)。儀器為強生Viros5600干化學(xué)生化分析儀。

1.2標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品

1.2.1重氮法和釩酸鹽法 Roche c.f.a.s 校準(zhǔn)品(批號177963)；Roche PCCC系列質(zhì)控品(批號181739/181775)。

1.2.2干化學(xué)法 強生校準(zhǔn)品(批號0414)；強生質(zhì)控品(批號A3823/Y3571)。

1.3樣品的選擇和處理

連續(xù)5天每天8例收集本院患者共計40例無溶血、無嚴(yán)重脂血的新鮮血清，T-BIL濃度在3.9-440.9 μmol/L之間。濃度分布參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)EP9-A方案[5](表1)。

表1 方法學(xué)比對實驗中總膽紅素濃度分布

1.4測定方法

1.4.1精密度的評估 根據(jù)CLSI EP-15A要求，選擇在血清T-BIL醫(yī)學(xué)決定水平處(25 μmmol/L,50 μmmol/L和340 μmmol/L)的血清樣本進(jìn)行三種常規(guī)方法批內(nèi)和批間不精密度測定，分5天完成，每天每個樣本各測定5次。

1.4.2樣品的測定及結(jié)果的收集 連續(xù)5天每天8份分別使用三種方法對同一樣本進(jìn)行雙份測定；全部標(biāo)本均應(yīng)在兩小時內(nèi)測定完畢。在樣本的雙份測定中，指定第一次測定順序，按反向順序檢測第二次。

1.4.3比對方法的確定 重氮法作為國際臨床化學(xué)家聯(lián)合會(IFCC)和臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦的參考方法，在本實驗室參加全國室間質(zhì)評，成績優(yōu)異，其精密度較好(表2)，故以其作為比對方法，以釩酸鹽法和干化學(xué)法作為待評方法。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

兩種診斷試劑的測定結(jié)果按照CLSI EP9-A[5]指南要求進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用Microsoft Excel 2007 做出散點圖(圖1)和偏倚圖(圖2)，計算相關(guān)性統(tǒng)計分析并給出線性回歸方程Y=bX+a，其中釩酸鹽法和干化學(xué)法為實驗方法(Y)，重氮法為比對方法(X)，計算待評方法(Y)與比較方法(X)之間的預(yù)期偏倚。

按EP9-A[5]文件進(jìn)行三種方法測定值之間的離群值檢查并判斷。比對方法(X) 測定范圍的檢驗，X的分布范圍是否合適，可用相關(guān)系數(shù)(r)作粗略估計，如r>0.975或r2>0.95，則認(rèn)為X取值范圍合適，直線回歸統(tǒng)計的斜率和截距可靠，如r<0.975則說明實驗方法的精密度較差或X取值范圍不合適，直線回歸統(tǒng)計的斜率和截距不可靠，需改善方法的精密度后重新試驗。

根據(jù)其散點圖(圖1)使用線性回歸分析來計算T-BIL和D-BIL醫(yī)學(xué)決定水平(Xc)處的預(yù)期偏倚(Bc)及其95%可信區(qū)間，并與臨床化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量指標(biāo)(WS/T403-2012)要求允許總誤差的1/2比較。

2 結(jié)果

2.1精密度評價

重氮法、釩酸鹽法和干化學(xué)法三種方法檢測T-BIL在醫(yī)學(xué)決定值水平(25 μmmol/L,50 μmmol/L,340 μmmol/L)的批間、批內(nèi)和總CV均小于WS/T403-2012允許總誤差的1/3。其中重氮法批間、批內(nèi)和總CV最小，即不精密度最小，其次為釩酸鹽法，干化學(xué)法不精密度稍大，但依然滿足臨床應(yīng)用需求(5.21%<1/3*20%)(表2)。

表2 三種常規(guī)方法測定血清膽紅素的精密度結(jié)果

2.2比對實驗

2.2.1離群值檢查 根據(jù)EP9-A文件要求，經(jīng)方法內(nèi)雙份測定結(jié)果及方法間離群值檢測，本實驗三種檢測體系間均無離群點。

2.2.2重氮法、釩酸鹽法和干化學(xué)法檢測結(jié)果散點圖以及偏倚圖 圖1顯示血清T-BIL檢測釩酸鹽法和干化學(xué)法與重氮法檢測結(jié)果回歸方程分別為：y=0.913 4x+1.367 3，r2=0.998 7；y=0.975x+10.234，r2=0.996 5。血清D-BIL檢測釩酸鹽法與重氮法檢測結(jié)果回歸方程為：y=0.827 4x+1.925 2，r2=0.997 8。r2均大于0.95，說明比對方法的檢測范圍足夠?qū)?，能夠滿足比對要求；血清膽紅素取值范圍內(nèi)檢測釩酸鹽法和干化學(xué)法與重氮法檢測結(jié)果之間的線性關(guān)系良好，回歸統(tǒng)計的截距和斜率均可靠。

圖2顯示，血清T-BIL和D-BIL濃度在較低范圍時(0-50 μmol/L)，不同方法間檢測結(jié)果差異較小，在血清膽紅素濃度逐漸增高時，釩酸鹽法和干化學(xué)法與重氮法之間的差異隨之加大。干化學(xué)方法檢測血清T-BIL結(jié)果較重氮法檢測結(jié)果高；釩酸鹽法檢測血清T-BIL和D-BIL結(jié)果較重氮法結(jié)果低。

2.3預(yù)期偏差的計算和可接受性能的評價

如表3所示：重氮法與釩酸鹽法在檢測血清T-BIL時，在醫(yī)學(xué)決定水平處的預(yù)期偏倚小于允許偏倚，檢測血清D-BIL在Xc=6 μmol/L時的預(yù)期偏倚可接受(表3)。干化學(xué)法與重氮法在檢測血清T-BIL時，在Xc=25 μmol/L，兩種方法檢測結(jié)果之間的預(yù)期偏倚較小，可接受，但是在高值醫(yī)學(xué)決定水平處(Xc=50 μmol/L和Xc=340 μmol/L)，預(yù)期偏倚大于允許偏倚，不可接受(表4)。該結(jié)果與偏倚圖(圖2)結(jié)果一致。

圖1 重氮法、釩酸鹽法和干化學(xué)法兩次檢測結(jié)果均值的散點圖

圖2 重氮法、釩酸鹽法和干化學(xué)法兩次檢測結(jié)果均值差值的偏倚圖

檢測項目醫(yī)學(xué)決定水平預(yù)期偏倚(95%CI)可接受偏倚結(jié)果評價T-BIL(μmol/L)25-0.80(-1.59,-0.01)2.5接受50-2.96(-3.70,-2.22)5接受340-28.08(-30.34,-25.82)34接受D-BIL(μmol/L)60.98(0.13,1.64)0.6接受35.5-4.21(-4.89,-3.53)3.6不接受

表4 重氮法與干化學(xué)法醫(yī)學(xué)決定水平處預(yù)期偏倚

3 討論

本研究表明：重氮法、釩酸鹽法和干化學(xué)分別測定血清T-BIL和D-BIL，不同方法間檢測結(jié)果均具有良好的相關(guān)性(圖1)，與文獻(xiàn)報道一致[4,7,8]。本實驗室干化學(xué)測定血清T-BIL結(jié)果普遍高于重氮法結(jié)果，雖然有良好相關(guān)性，在低濃度醫(yī)學(xué)決定水平處(Xc=25 μmol/L)，兩種方法檢測結(jié)果之間的預(yù)期偏倚較小，可接受； 隨血清T-BIL濃度逐漸增高時，兩種檢測結(jié)果之間的偏倚隨之增加，超出允許范圍，不具備可比性(表4)。干化學(xué)與濕化學(xué)檢測結(jié)果的不可比性的現(xiàn)象具有普遍性，據(jù)Hongwei Fu等[1]的報道顯示ALT，AST和ALP等指標(biāo)用干化學(xué)和濕化學(xué)分別檢測時，在部分醫(yī)學(xué)決定水平處相對偏倚可達(dá)到30%以上。本研究在Xc=340 μmol/L 水平處，兩者間相對偏差亦達(dá)到了16.69%。分析可能原因為：同為重氮法反應(yīng)原理，但濕化學(xué)測定時，吸光度變化與測定物質(zhì)濃度的變化遵循郎伯比爾定律；濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為直線；而干化學(xué)法測定，吸光度隨物質(zhì)濃度變化遵循William klapper定律，濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為曲線。濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同類型，決定了兩種方法只能在某段濃度范圍內(nèi)具有可比性，亦不可能通過數(shù)學(xué)因子校正的方式來實現(xiàn)兩種方法在高中低三個醫(yī)學(xué)決定水平處均做到檢測結(jié)果的一致性。由本研究結(jié)果亦可看出，在正常參考區(qū)間的上線濃度水平附近時兩種方法有很好的一致性，這樣能夠充分保障兩種方法對黃疸的臨床診斷判斷的一致性，當(dāng)臨床治療連續(xù)監(jiān)測血清膽紅素水平變化時，需采用同一種方法進(jìn)行比較，避免不同實驗方法的交叉檢測。另外一個原因為兩種檢測系統(tǒng)的溯源不同，本研究使用的羅氏的重氮法溯源到Doumas參考方法，vitro5600干化學(xué)溯源到J-G重氮法(參考方法)，參考物質(zhì)為NIST SRM 916a[National Institute of Standard Technology,(美國)國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所;Standard Reference Material]。兩者溯源級別都較高，所以兩種系統(tǒng)的結(jié)果具有相關(guān)性，但是具體的參考方法不同使得兩種有差異，并且隨著膽紅素濃度的增高，差異增大。

重氮法與釩酸鹽法檢測血清T-BIL時的結(jié)果在接受范圍內(nèi)(表3)，但是兩種方法在檢測D-BIL時，醫(yī)學(xué)決定水平處(Xc=35.5 μmol/L)的偏倚不可接受。分析可能原因是重氮法在檢測D-BIL時的溯源級別較低，只能溯源到廠家檢測程序。另外，校準(zhǔn)物之間的互通性是不同檢測方法之間結(jié)果可比性的重要方面。即用兩個程序測量此校準(zhǔn)物所得結(jié)果的數(shù)字關(guān)系，與用這兩個程序測量實際樣品所得結(jié)果的數(shù)字關(guān)系一致。本研究中重氮法與釩酸鹽法使用的相同校準(zhǔn)物，與干化學(xué)的校準(zhǔn)物不同。這也可能是釩酸鹽法與重氮法檢測T-BIL時，有較好的可比性的原因之一。李祥坤[9,10]等人的研究認(rèn)為方法之間相關(guān)系數(shù)幾乎均保持在0.99，各種方法之間幾乎沒有差異并可以相互比較結(jié)果。這種結(jié)論的得出可能源于分析樣本均為低濃度D-BIL所致(0-50 μmol/L)。

綜上所述，目前，實現(xiàn)不同檢測方法之間結(jié)果的可比性還存在不少問題，需要進(jìn)一步研討解決。本研究按照EP9-A文件要求從相關(guān)性、預(yù)期偏倚評估及與臨床化學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量指標(biāo)(WS/T403-2012)要求允許總誤差的1/2比較等方面綜合分析目前常規(guī)檢測血清膽紅素的方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和不一致的可接受限，從不同角度評估檢測結(jié)果，有利于為臨床疾病診斷、療效觀察提供可靠保證。

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Evaluationthecompatibiltyandbiasesofthreeroutinemethodstodetermineserumbilirubin

WANGYang1,GUDong-mei1,CHENJing-shan2，etal.

(1.DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine;2.HealthDepartment,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China)

ObjectiveTo investigate the comparability of three routine methods (Diazo,vanadic acid oxidation method,dry chemical method ) to determine serum bilirubin.MethodsAccording to the profile NCCLS-EP9A,vanadic acid oxidation method and dry chemical method were compared with the Diazo method.Forty test results were anylysed.ResultsThe linear regression equations for total bilirubin were:y=0.913 4x+1.367 3，r2=0.998 7；y=0.975x+10.234，r2=0.996 5,respectively.The bias in each medical decison level(25,50 and 340 μmol/L) was -0.80,-2.96 and -28.08;-2.39、-6.70 and -56.76,respectively.The linear regression equation for direct bilirubin wasy=0.827 4x+1.925 2，r2=0.997 8.The bias in each medical decison level(1、6 and 35.5 μmol/L) was 1.75,0.98 and -4.21.ConclusionBoth vanadic acid oxidation method and dry chemical method were closely correlated to the Diazo method.When the concentration increase,the correspondent prospective biase also increase.Compared with the test result of Diazo method,correspondent prospective biase of the vanadic acid oxidation method was accepted,while the dry chemical method was not.

method comparison;bias estimantion;total bilirubin;direct bilirubin

R446.11

A

2016-12-21)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1744-04

王楊(1979-),女，醫(yī)學(xué)學(xué)士，主管技師，主要從事生化檢驗方面的研究。